Ergebnisse und Diskussion
um Zu demonstrieren, dass die optimale Enzym Temperatur hängt von der assay-Bedingungen, die β-glucosidase-Sfßgly wurde eingereicht, um das „klassische“ Verfahren für die optimale Ermittlung der Temperatur, D. H., seine Aktivität wurde bestimmt, bei verschiedenen Temperaturen (29 bis 46 °C) mit dem gleichen Enzym-Konzentration., Anschließend wurde die Sfßgly-Aktivität im Verlauf eines Festtemperatur-Assays unter Verwendung der ersten Ableitung an bestimmten Punkten der Produkt-gegen-Zeit-Kurve bestimmt (S2 Fig). Basierend auf diesen Ergebnissen wurde die relative Aktivität von Sfßgly zu unterschiedlichen Zeiten (10 bis 120 min) berechnet, was die Untersuchung der Entwicklung der optimalen Temperaturdiagramme während der Assays desselben Enzyms ermöglichte (Abb.
A) Relative Aktivität von Sfßgly während der Assays bei unterschiedlichen Temperaturen., (violettes Kreuz) 29°C; (blauer Kreis) 33°C; (blauer Diamant) 37°C; (rotes Quadrat) 42°C; (grünes Dreieck) 46°C. Vertikale gestrichelte Linien markieren drei verschiedene Testzeiten (20, 60 und 120 min). Die relative Aktivität bei 42 und 37°C zu diesen Testzeiten wird in den abgerundeten Kästchen dargestellt, um die Verschiebung der optimalen Temperatur während des gesamten Tests zu veranschaulichen. B) Änderungen der optimalen Temperatur, die sich aus Modifikationen der Enzym-Assay-Dauer ergeben. Der rote Kreis und die Pfeile markieren die Abnahme der Enzymaktivität bei 42°C, was die optimale Temperatur im kürzeren Test war., Der blaue Kreis und der Pfeil veranschaulichen die Zunahme der relativen Aktivität bei 37°C, die nur für längere Testzeiten die optimale Temperatur war. Die Enzymkonzentration betrug 140 nM. Dieser vollständige Datensatz (mittlere relative Aktivitäten und entsprechende Abweichungen) ist in der Tabelle dargestellt.
Eine Übersicht über Abb. 1 zeigt, dass sich die relative Position der mit jeder Temperatur verbundenen Aktivitätsdaten mit der Assayzeit ändert (Abb.1A). Zum Beispiel wurde bei 20 min Die höchste relative Aktivität, d. H. Die optimale Temperatur, bei 42 °C beobachtet., Umgekehrt betrug die optimale Temperatur bei 60 min 37 °C. Somit änderte sich die optimale Temperatur um 5 °C, indem die Assaylänge modifiziert wurde, während die verbleibenden Bedingungen (Enzym-und Substratkonzentrationen und Puffer) konstant waren. Im 120-min—Assay sank die relative Aktivität bei 42 °C—der früheren optimalen Temperatur-dramatischer auf nur 50%. Daher zeigen Diagramme des Temperatureffekts auf die relative Enzymaktivität für verschiedene Assaydauern deutlich unterschiedliche Formen und Maxima, d. H. Optimale Temperaturen, selbst wenn sie aus demselben Enzym hergestellt werden (Abb.,
Als zusätzliche Demonstration, dass die optimale Temperatur kein konstanter Parameter ist, wurde das oben beschriebene Experiment unter Verwendung von zwei verschiedenen Konzentrationen von Sfßgly wiederholt(Abb. Es ist klar, dass sich die relative Positionierung der Aktivitätsdaten im Verlauf des Assays für die mit 85 und 280 nM Sfßgly durchgeführten Experimente unterschiedlich entwickelte., Die Diagramme des Temperatureffekts auf die Enzymaktivität, die mit Daten aus 20-min-Assays erstellt wurden, zeigten, dass die optimale Temperatur für 280 nM Sfßgly 42 °C betrug (Fig 2A), während die optimale Temperatur für dasselbe Enzym bei 85 nM 37 °C betrug (Fig 2B). Daher wurde auch die optimale Temperatur durch die Enzymkonzentration beeinflusst.
A) Relative Aktivität von Sfßgly während der Assays bei unterschiedlichen Temperaturen in Experimenten mit 280 nM Sfßgly und B) 85 nM Sfßgly., (violettes Kreuz) 29°C; (blauer Kreis) 33°C; (blauer Diamant) 37°C; (rotes Quadrat) 42°C; (grünes Dreieck) 46°C. Einsätze zeigen den optimalen Temperaturdiagramm für 20-min-Assays bei jeder Enzymkonzentration. Der Vergleich der eingefügten Plots zeigt die optimale Temperaturverschiebung aufgrund der Enzymverdünnung. Dieser vollständige Datensatz (mittlere relative Aktivitäten und entsprechende Abweichungen) ist in der Tabelle dargestellt.
Abschließend änderte sich die optimale Temperatur mit Modifikation der Assayzeit und Enzymkonzentration., Somit ist es kein Parameter, der eine intrinsische Enzymeigenschaft widerspiegelt, sondern eine bloße Folge der Assaybedingungen.
Die molekulare Grundlage der beobachteten Modifikationen der relativen Aktivität und der optimalen Temperatur beruht darauf, dass sich die Enzympopulation im „klassischen Verfahren“ zur optimalen Temperaturschätzung nicht im thermodynamischen Gleichgewicht befindet. Kurz gesagt nimmt bei Temperaturen nahe und oberhalb der Enzymschmelztemperatur (Tm) die aktive Enzymkonzentration im Laufe des Assays aufgrund der thermischen Denaturierung des Proteins kontinuierlich ab., Die Rate der Proteindenaturierung ist viel niedriger unter dem Tm, so dass sich die Konzentration des aktiven Enzyms in diesem Temperaturbereich nicht ändert. Je höher die Temperatur ist, desto größer ist außerdem der Anteil der Substratpopulation, der den Übergangszustand erreicht, was die Reaktionsgeschwindigkeit erhöht. Diese Trends sind während des gesamten Enzymaktivitätstests gleichzeitig., Somit sinkt bei Temperaturen, die es ermöglichen, die durch Proteindenaturierung verursachte Abnahme der Enzymaktivität zu überwinden, die durch die Temperatur verursachte Erhöhung der Reaktionsgeschwindigkeit zu überwinden, die detektierte Enzymaktivität während des Verlaufs des Assays. Im Gegensatz dazu ändert sich bei Temperaturen, bei denen keine Proteindenaturierung auftritt, die detektierte Aktivität nicht in Abhängigkeit von der Zeit. Aus diesem Grund ändern sich die relativen Aktivitätsdaten während des Assays und die optimale Temperatur verschiebt sich zu niedrigeren Werten.,
Ein Beweis für dieses Verschiebungsgleichgewicht ist, dass in den Experimenten bei 42 und 46 °C (Abb.1A), die dem Tm für Sfßgly (45 °C) am nächsten waren, eine stärkere Abnahme der relativen Aktivität beobachtet wurde. Je niedriger die Sfßgly-Konzentration ist, desto kürzer ist außerdem die Zeit, die bei 42 °C für die thermische Denaturierung benötigt wird, um die aktive Enzympopulation auf einen geringeren Anteil als bei 37 °C zu reduzieren, bei dem Sfßgly stabil ist., Tatsächlich dauerte es bei 280 nM Sfßgly 70 min bei 42 °C, um die aktive Enzymkonzentration auf ein Niveau zu reduzieren, bei dem die relative Aktivität niedriger war als bei 37 °C (Abb 2A), während dieser Schaltpunkt bei 40 min mit 140 nM Sfßgly auftrat (Abb 1A). Schließlich hatten bei der niedrigsten verwendeten Proteinkonzentration (85 nM) die relativen Aktivitätsdaten für 42 und 37 °C bereits Positionen bei 10 min ausgetauscht (Fig 2B).,
Um den Mechanismus der oben vorgeschlagenen optimalen Temperaturvariation zu bestimmen, wiederholten wir die gleichen Experimente mit einer thermophilen β-Glucosidase, bglTm, von Thermatoga maritima , die ein Tm über 95 °C hat, weit höher als 46 °C. Somit ist bglTm im Temperaturbereich stabil, der in den Experimenten verwendet wird, und folglich ändert sich die Population des aktiven Enzyms während des Assays nicht. Die Gleichgewichtsverschiebungen in Abhängigkeit von Assay-Temperatur und Enzym-Tm gelten hier nicht, und wie erwartet haben die relativen Aktivitätsdaten (Fig 3A) im Laufe der Zeit keine Positionen gewechselt., Darüber hinaus zeigt das „optimale Temperaturdiagramm“ eine kontinuierlich ansteigende Linie, die ausschließlich aus dem Temperatureffekt auf die Wahrscheinlichkeit resultiert, dass das Substrat den Übergangszustand erreicht. Dieser Plot war nicht von der Assayzeit abhängig(Abb.
A) Relative Aktivität von bglTm während des gesamten Assays bei unterschiedlichen Temperaturen. (lila Kreuz) 29°C; (blauer Kreis) 33°C; (blauer Diamant) 37°C; (rotes Quadrat) 42°C; (grünes Dreieck) 46°C. B) Wirkung der Testzeit auf die relative Aktivität., Die Enzymkonzentration betrug 7,5 nM. Dieser vollständige Datensatz (mittlere relative Aktivitäten und entsprechende Abweichungen) ist in der Tabelle dargestellt.
Daher werden die klassischen glockenförmigen Kurven von „optimum temperature plots“ nur beobachtet, wenn das Enzym während des Aktivitätstests denaturiert. Daher könnte man sich fragen, ob es ratsam ist, den höchsten Punkt dieser Diagramme als „optimale Temperatur“zu bezeichnen.
Diese Bemerkungen gehen über ein technisches Problem hinaus., Die Verwendung der „optimalen Temperatur“ für die Enzymcharakterisierung kann aufgrund des Vorhandenseins von denaturiertem Protein in den Proben während der anfänglichen Geschwindigkeitsbestimmungen zu falschen kinetischen Parametern (Km, Ki und kcat) führen. In Anbetracht seiner Abhängigkeit von den Assaybedingungen kann die Annahme der „optimalen Temperatur“, die unter Prüfbedingungen für Großanwendungen bestimmt wird und sich in der Assaydauer und Enzymkonzentration deutlich unterscheidet, zu abnehmenden Reaktionsraten, niedrigeren Produktausbeuten und finanziellen Verlusten führen.