résultats et discussion

pour démontrer que la température optimale de l’enzyme dépend des conditions d’analyse, la β-glucosidase Sfßgly a été soumise à la procédure « classique” pour la détermination optimale de la température, c’est-à-dire que son activité a été déterminée à différentes températures (29 à 46 °C) en utilisant la même concentration enzymatique., Ensuite, l’activité Sfßgly au cours d’un test à température fixe a été déterminée en utilisant la dérivée première à des points spécifiques de la courbe produit / temps (S2 Fig). Sur la base de ces résultats, L’activité relative de Sfßgly a été calculée à des moments distincts (10 à 120 min), ce qui a rendu possible l’examen de l’évolution des diagrammes de température optimaux lors des essais de la même enzyme (Fig 1).

effet de la durée du dosage sur la température optimale de l’enzyme.

A) activité Relative de Sfßgly pendant les essais à différentes températures., (croix pourpre) 29°C; (Cercle Bleu) 33°C; (Diamant Bleu) 37°C; (carré rouge) 42°C; (triangle Vert) 46°C. Les lignes verticales pointillées mettent en évidence trois temps de dosage différents (20, 60 et 120 min). L’activité relative à 42 et 37°C à ces moments d’essai est présentée dans les cases arrondies, illustrant le déplacement de la température optimale tout au long de l’essai. B) changements de la température optimale résultant de modifications de la durée du dosage enzymatique. Le cercle rouge et les flèches mettent en évidence la diminution de l’activité enzymatique à 42°C, qui était la température optimale dans le test plus court., Le cercle bleu et la flèche illustrent l’augmentation de l’activité relative à 37°C, qui n’était la température optimale que pour des temps d’analyse plus longs. La concentration enzymatique était de 140 nM. Cet ensemble de données complet (activités relatives moyennes et écarts respectifs) est présenté dans le tableau S1.

un aperçu de la figure 1 révèle que la position relative des données d’activité associées à chaque température change avec le temps de dosage (Fig 1A). Par exemple, à 20 min, l’activité relative la plus élevée, c’est-à-dire la température optimale, a été observée à 42 °C., Inversement, à 60 min, la température optimale était de 37 °C. Ainsi, la température optimale changeait de 5 °C en modifiant la longueur du dosage, tandis que les conditions restantes (concentrations d’enzymes et de substrats et tampon) étaient constantes. Plus spectaculaire encore, dans le test de 120 minutes, l’activité relative à 42 °C—l’ancienne température optimale—a chuté à seulement 50%. Par conséquent, les graphiques de l’effet de la température sur l’activité enzymatique relative pour différentes durées d’analyse montrent clairement différentes formes et maxima, c’est-à-dire des températures optimales, même lorsqu’elles sont produites à partir de la même enzyme (Fig 1B).,

comme démonstration supplémentaire que la température optimale n’est pas un paramètre constant, l’expérience décrite ci-dessus a été répétée en utilisant deux concentrations différentes de Sfßgly (Fig 2). Il est clair que le positionnement relatif des données d’activité a évolué différemment au cours du test pour les expériences réalisées avec 85 et 280 nM Sfßgly., Les graphiques de l’effet de la température sur l’activité enzymatique préparés avec des données d’essais de 20 min ont indiqué que la température optimale pour 280 nM Sfßgly était de 42 °C (Fig 2A), alors que la température optimale pour cette même enzyme à 85 nM était de 37 °C (Fig 2b). Par conséquent, la température optimale a également été affectée par la concentration enzymatique.

effet de la concentration enzymatique sur la température optimale.

A) activité Relative de Sfßgly pendant les essais à différentes températures dans des expériences réalisées en utilisant 280 nM Sfßgly et B) 85 nM Sfßgly., (croix pourpre) 29°C; (Cercle Bleu) 33°C; (Diamant Bleu) 37°C; (carré rouge) 42°C; (triangle Vert) 46°C. Les Inserts montrent le diagramme de température optimal pour les tests de 20 min à chaque concentration enzymatique. La comparaison des diagrammes insérés illustre le changement de température optimal dû à la dilution enzymatique. Cet ensemble de données complet (activités relatives moyennes et écarts respectifs) est présenté dans le tableau S2.

En conclusion, la température optimale a changé avec la modification du temps d’analyse et de la concentration enzymatique., Il ne s’agit donc pas d’un paramètre qui reflète une propriété enzymatique intrinsèque, mais plutôt d’une simple conséquence des conditions d’analyse.

La base moléculaire des modifications observées de l’activité relative et de la température optimale repose sur le fait que la population enzymatique n’est pas à l’équilibre thermodynamique dans la « procédure classique” pour l’estimation optimale de la température. En bref, à des températures proches et supérieures à la température de fusion enzymatique (Tm), la concentration en enzyme active diminue continuellement au cours du test en raison de la dénaturation thermique de la protéine., Le taux de dénaturation des protéines est beaucoup plus faible en dessous de la Tm, de sorte que la concentration de l’enzyme active ne change pas dans cette plage de température. De plus, plus la température est élevée, plus la fraction de la population de substrat qui atteint l’état de transition est importante, ce qui augmente la vitesse de réaction. Ces tendances sont simultanées tout au long de l’analyse de l’activité enzymatique., Ainsi, à des températures qui permettent à la diminution de l’activité enzymatique causée par la dénaturation des protéines de surmonter l’augmentation de la vitesse de réaction causée par la température, l’activité enzymatique détectée diminue au cours du test. En revanche, à des températures auxquelles aucune dénaturation des protéines ne se produit, l’activité détectée ne change pas en fonction du temps. Pour cette raison, les données relatives d’activité changent pendant l’analyse, et la température optimale se déplace vers des valeurs plus basses.,

la preuve de cet équilibre changeant est que des diminutions plus marquées de l’activité relative ont été observées dans les expériences effectuées à 42 et 46 °c (Fig 1A), qui étaient les températures les plus proches de la Tm pour Sfßgly (45 °C ). De plus, plus la concentration de Sfßgly est faible, plus le temps nécessaire à 42 °C pour la dénaturation thermique est court pour réduire la population d’enzymes actives à une fraction inférieure à celle présente à 37 °C, à laquelle Sfßgly est stable., En effet, avec 280 nM Sfßgly, il a fallu 70 min à 42 °C pour réduire la concentration enzymatique active à un niveau où l’activité relative était inférieure à celle à 37 °C (Fig 2A), alors que ce point de commutation s’est produit à 40 min avec 140 nM Sfßgly (Fig 1a). Enfin, avec la concentration protéique la plus faible utilisée (85 nM), les données d’activité relative pour 42 et 37 °C avaient déjà échangé des positions à 10 min (Fig 2B).,

pour déterminer le mécanisme de la variation optimale de température proposée ci-dessus, nous avons répété les mêmes expériences avec une β-glucosidase thermophile, bglTm, de Thermatoga maritima, qui a une Tm supérieure à 95 °C , bien supérieure à 46 °C. Ainsi, la bglTm est stable dans la plage de température utilisée dans les expériences, et par conséquent, la population d’enzyme active ne change pas au cours du test. Les déplacements de l’équilibre en fonction de la température de l’essai et de L’enzyme Tm ne s’appliquent pas ici, et comme prévu, les données d’activité relative (Figure 3A) n’ont pas changé de position au fil du temps., De plus, le « diagramme de température optimale” montre une ligne en augmentation continue, qui résulte exclusivement de l’effet de la température sur la probabilité que le substrat atteigne l’état de transition. Ce tracé ne dépendait pas du temps d’analyse (Fig 3B).

effet de la durée du test sur l’activité du bglTm à différentes températures.

A) activité Relative du bglTm tout au long de l’essai à différentes températures. (croix pourpre) 29°C; (Cercle Bleu) 33°C; (Diamant Bleu) 37°C; (carré rouge) 42°C; (triangle Vert) 46°C. B) effet du temps d’analyse sur l’activité relative., La concentration enzymatique était de 7,5 nM. Cet ensemble de données complet (activités relatives moyennes et écarts respectifs) est présenté dans le tableau S3.

Par conséquent, les courbes classiques en forme de cloche des « diagrammes de température optimaux” ne sont observées que si l’enzyme se dénature pendant le test d’activité. Ainsi, on pourrait se demander s’il est conseillé de qualifier le point le plus élevé de ces parcelles de « température optimale”.

ces remarques vont au-delà d’une question technique., L’utilisation de la” température optimale  » pour la caractérisation enzymatique peut entraîner des erreurs de paramètres cinétiques (Km, Ki et kcat) en raison de la présence de protéines dénaturées dans les échantillons lors des déterminations initiales du débit. Il est important de noter que, compte tenu de sa dépendance à l’égard des conditions d’analyse, l’adoption de la « température optimale” déterminée dans des conditions de banc pour des utilisations à grande échelle, dont la durée d’analyse et la concentration enzymatique diffèrent considérablement, peut entraîner une diminution des taux de réaction, une baisse des rendements des produits et des pertes financières.