Risultati e discussione
Per dimostrare che l’ottimale enzima temperatura dipende dalle condizioni di dosaggio, la beta-glucosidasi Sfßgly è stato sottoposto alla “classica” procedura per la temperatura ottimale determinazione, cioè, la sua attività è stata determinata a diverse temperature (da 29 a 46 °C) con lo stesso enzima di concentrazione., Quindi, l’attività Sfßgly durante il corso di un dosaggio a temperatura fissa è stata determinata utilizzando la derivata prima in punti specifici della curva prodotto rispetto al tempo (S2 Fig). Sulla base di questi risultati, l’attività relativa di Sfßgly è stata calcolata in tempi distinti (da 10 a 120 min), il che ha reso possibile l’esame di come si sono evoluti i grafici di temperatura ottimale durante le analisi dello stesso enzima (Fig 1).
A) Attività relativa di Sfßgly durante le analisi a diverse temperature., (croce viola) 29°C; (cerchio blu) 33°C; (diamante blu) 37°C; (quadrato rosso) 42°C; (triangolo verde) 46°C. Le linee tratteggiate verticali evidenziano tre diversi tempi di analisi (20, 60 e 120 min). L’attività relativa a 42 e 37°C in questi tempi di analisi è presentata nelle caselle arrotondate, illustrando lo spostamento della temperatura ottimale durante l’analisi. B) Variazioni della temperatura ottimale derivanti da modifiche della durata del saggio enzimatico. Il cerchio rosso e le frecce evidenziano la diminuzione dell’attività enzimatica a 42°C, che era la temperatura ottimale nel saggio più breve., Il cerchio blu e la freccia illustrano l’aumento dell’attività relativa a 37°C, che era la temperatura ottimale solo per tempi di analisi più lunghi. La concentrazione enzimatica era di 140 nM. Questo set di dati completo (attività relative medie e rispettive deviazioni) è presentato nella tabella S1.
Una panoramica di Fig 1 rivela che la posizione relativa dei dati di attività associati a ciascuna temperatura cambia con il tempo di analisi (Fig 1A). Ad esempio, a 20 min, la più alta attività relativa, cioè la temperatura ottimale, è stata osservata a 42 °C., Al contrario, a 60 min, la temperatura ottimale era 37 °C. Quindi, la temperatura ottimale è cambiata di 5 °C modificando la lunghezza del saggio, mentre le condizioni rimanenti (concentrazioni di enzimi e substrato e tampone) erano costanti. Più drammaticamente, nel test di 120 minuti, l’attività relativa a 42 °C—la precedente temperatura ottimale—è scesa a solo il 50%. Pertanto, i grafici dell’effetto della temperatura sull’attività enzimatica relativa per diverse durate del saggio mostrano chiaramente forme e massimi diversi, cioè temperature ottimali, anche se prodotte dallo stesso enzima (Fig 1B).,
Come ulteriore dimostrazione che la temperatura ottimale non è un parametro costante, l’esperimento sopra descritto è stato ripetuto impiegando due diverse concentrazioni di Sfßgly (Fig 2). È chiaro che il posizionamento relativo dei dati di attività si è evoluto in modo diverso durante il corso del test per gli esperimenti eseguiti con Sfßgly a 85 e 280 nM., I grafici dell’effetto della temperatura sull’attività enzimatica preparati con i dati di saggi di 20 minuti hanno indicato che la temperatura ottimale per 280 nM Sfßgly era di 42 °C (Fig 2A), mentre la temperatura ottimale per questo stesso enzima a 85 nM era di 37 °C (Fig 2B). Pertanto, la temperatura ottimale è stata influenzata anche dalla concentrazione enzimatica.
A) Attività relativa di Sfßgly durante le analisi a diverse temperature in esperimenti eseguiti utilizzando 280 nM Sfßgly e B) 85 nM Sfßgly., (croce viola) 29°C; (cerchio blu) 33°C; (diamante blu) 37°C; (quadrato rosso) 42°C; (triangolo verde) 46°C. Gli inserti mostrano il grafico della temperatura ottimale per i saggi 20-min ad ogni concentrazione enzimatica. Il confronto dei grafici inseriti illustra lo spostamento ottimale della temperatura dovuto alla diluizione degli enzimi. Questo set di dati completo (attività relative medie e rispettive deviazioni) è presentato nella tabella S2.
In conclusione, la temperatura ottimale è cambiata con la modifica del tempo di analisi e della concentrazione enzimatica., Pertanto, non è un parametro che riflette una proprietà enzimatica intrinseca, ma è invece una mera conseguenza delle condizioni del test.
La base molecolare delle modificazioni osservate dell’attività relativa e della temperatura ottimale si basa sul fatto che la popolazione enzimatica non è all’equilibrio termodinamico nella “procedura classica” per la stima ottimale della temperatura. In breve, a temperature vicine e superiori alla temperatura di fusione degli enzimi (Tm), la concentrazione degli enzimi attivi diminuisce continuamente nel corso del saggio a causa della denaturazione termica della proteina., Il tasso di denaturazione delle proteine è molto più basso al di sotto della Tm, quindi la concentrazione dell’enzima attivo non cambia in questo intervallo di temperatura. Inoltre, maggiore è la temperatura, maggiore è la frazione della popolazione del substrato che raggiunge lo stato di transizione, che aumenta la velocità di reazione. Queste tendenze sono simultanee in tutto il test di attività enzimatica., Pertanto, a temperature che consentono la diminuzione dell’attività enzimatica causata dalla denaturazione delle proteine per superare l’aumento della velocità di reazione causato dalla temperatura, l’attività enzimatica rilevata diminuisce durante il corso del test. Al contrario, a temperature alle quali non si verifica denaturazione proteica, l’attività rilevata non cambia in funzione del tempo. Per questo motivo, i dati relativi all’attività cambiano durante il test e la temperatura ottimale si sposta verso valori più bassi.,
La prova di questo equilibrio di spostamento è che diminuzioni più marcate dell’attività relativa sono state osservate negli esperimenti eseguiti a 42 e 46 °C (Fig 1A), che erano le temperature più vicine alla Tm per Sfßgly (45 °C ). Inoltre, più bassa è la concentrazione di Sfßgly, più breve è il tempo necessario a 42 ° C per la denaturazione termica per ridurre la popolazione di enzimi attivi ad una frazione inferiore a quella presente a 37 °C, a cui Sfßgly è stabile., Infatti, con 280 nM Sfßgly, ci sono voluti 70 min a 42 °C per ridurre la concentrazione dell’enzima attivo ad un livello in cui l’attività relativa era inferiore a quella a 37 °C (Fig 2A), mentre questo punto di commutazione si è verificato a 40 min con 140 nM Sfßgly (Fig 1A). Infine, con la concentrazione proteica più bassa utilizzata (85 nM), i dati relativi all’attività per 42 e 37 °C avevano già scambiato posizioni a 10 min (Fig 2B).,
Per determinare il meccanismo della variazione di temperatura ottimale proposta sopra, abbiamo ripetuto gli stessi esperimenti con una β-glucosidasi termofila, bglTm, di Thermatoga maritima, che ha una Tm superiore a 95 °C , molto superiore a 46 °C. Pertanto, bglTm è stabile nell’intervallo di temperatura impiegato negli esperimenti e, di conseguenza, la popolazione di enzima attivo non cambia durante il test. Gli spostamenti di equilibrio in funzione della temperatura del dosaggio e dell’enzima Tm non si applicano qui e, come previsto, i dati relativi all’attività (Fig 3A) non hanno cambiato posizione nel tempo., Inoltre, il “grafico della temperatura ottimale” mostra una linea in continuo aumento, che deriva esclusivamente dall’effetto della temperatura sulla probabilità che il substrato abbia raggiunto lo stato di transizione. Questa trama non dipendeva dal tempo di analisi (Fig 3B).
A) Attività relativa di bglTm durante l’analisi a diverse temperature. (croce viola) 29°C; (cerchio blu) 33°C; (diamante blu) 37°C; (quadrato rosso) 42°C; (triangolo verde) 46°C. B) Effetto del tempo di analisi sull’attività relativa., La concentrazione enzimatica era di 7,5 nM. Questo set di dati completo (attività relative medie e rispettive deviazioni) è presentato nella tabella S3.
Pertanto, le classiche curve a campana dei “grafici di temperatura ottimale” si osservano solo se l’enzima denatura durante il test di attività. Quindi, ci si potrebbe chiedere se sia consigliabile definire il punto più alto di questi grafici la “temperatura ottimale”.
Queste osservazioni si estendono oltre un problema tecnico., L’utilizzo della “temperatura ottimale” per la caratterizzazione enzimatica può comportare parametri cinetici errati (Km, Ki e kcat) a causa della presenza di proteine denaturate nei campioni durante le determinazioni iniziali della velocità. È importante sottolineare che, considerando la sua dipendenza dalle condizioni di dosaggio, l’adozione della “temperatura ottimale” determinata in condizioni di banco per usi su larga scala, che differiscono notevolmente nella durata del dosaggio e nella concentrazione degli enzimi, può comportare una diminuzione dei tassi di reazione, una minore resa del prodotto e perdite finanziarie.