resultat och diskussion
för att visa att den optimala enzymtemperaturen beror på analysförhållandena, lämnades β-glukosidas Sfßgly till ”classic” – förfarandet för optimal temperaturbestämning, dvs dess aktivitet bestämdes vid olika temperaturer (29 till 46 °C) med samma enzymkoncentration., Därefter bestämdes den Sfßgly-aktiviteten under en fast temperaturanalys med hjälp av det första derivatet vid specifika punkter av produkten mot tidskurvan (S2 Fig). Baserat på dessa resultat beräknades Sfßglys relativa aktivitet vid olika tidpunkter (10 till 120 min), vilket gjorde det möjligt att undersöka hur de optimala temperaturområdena utvecklades under analyserna av samma enzym (Fig 1).
A) Sfßglys relativa aktivitet under analyserna vid olika temperaturer., (lila kors) 29°C; (blå cirkel) 33°C; (blå diamant) 37°C; (röd fyrkant) 42°C; (grön triangel) 46°C. vertikala streckade linjer markera tre olika analystider (20, 60 och 120 min). Den relativa aktiviteten vid 42 och 37 ° C vid dessa analystider presenteras i de rundade lådorna, vilket illustrerar förskjutningen av den optimala temperaturen under hela analysen. B) förändringar i den optimala temperaturen till följd av modifieringar av enzymanalysens varaktighet. Den röda cirkeln och pilarna markerar minskningen av enzymaktiviteten vid 42 ° C, vilket var den optimala temperaturen i den kortare analysen., Den blå cirkeln och pilen illustrerar ökningen av den relativa aktiviteten vid 37 ° C, vilket var den optimala temperaturen endast för längre analystider. Enzymkoncentrationen var 140 nM. Denna kompletta datauppsättning (genomsnittliga relativa aktiviteter och respektive avvikelser) presenteras på S1-tabellen.
en översikt över Fig 1 visar att den relativa positionen för aktivitetsdata som är associerade med varje temperaturförändring med analystid (Fig 1A). Till exempel vid 20 min observerades den högsta relativa aktiviteten, dvs den optimala temperaturen vid 42 °C., Omvänt var den optimala temperaturen vid 60 min 37 ° C. Den optimala temperaturen ändrades således med 5 °C genom att analyslängden ändrades, medan de återstående förhållandena (enzym-och substratkoncentrationer och buffert) var konstanta. Mer dramatiskt, i 120-min—analysen, sjönk den relativa aktiviteten vid 42 °C—den tidigare optimala temperaturen-till endast 50%. Därför visar tomter av temperatureffekten på den relativa enzymaktiviteten för olika analystider tydligt olika former och maxima, dvs optimala temperaturer, även när de produceras från samma enzym (Fig 1b).,
som en ytterligare demonstration av att den optimala temperaturen inte är en konstant parameter upprepades det experiment som beskrivs ovan genom att använda två olika koncentrationer av Sfßgly (Fig 2). Det är uppenbart att den relativa placeringen av aktivitetsdata utvecklades annorlunda under analysens gång för de experiment som utfördes med 85 och 280 nM Sfßgly., Temperatureffekten på enzymaktiviteten som framställts med data från 20-min-analyser visade att den optimala temperaturen för 280 nM Sfßgly var 42 °C (Fig 2a), medan den optimala temperaturen för samma enzym vid 85 nM var 37 °C (Fig 2B). Därför påverkades den optimala temperaturen också av enzymkoncentrationen.
a) Sfßglys relativa aktivitet under analyserna vid olika temperaturer i experiment som utförts med 280 nM Sfßgly och B) 85 nM Sfßgly., (lila kors) 29°C; (blå cirkel) 33°C; (blå diamant) 37°C; (Röda torget) 42°C; (grön triangel) 46°C. infogar visar det optimala temperaturintervallet för 20-min-analyser vid varje enzymkoncentration. Jämförelse av de införda tomterna illustrerar det optimala temperaturskiftet på grund av enzymutspädning. Denna kompletta datauppsättning (genomsnittliga relativa aktiviteter och respektive avvikelser) presenteras på S2-tabellen.
Sammanfattningsvis ändrades den optimala temperaturen med modifiering av analystiden och enzymkoncentrationen., Således är det inte en parameter som speglar en inneboende enzymegenskap utan är istället en ren följd av analysförhållandena.
den molekylära grunden för de observerade modifieringarna av relativ aktivitet och optimal temperatur är beroende av det faktum att enzympopulationen inte är vid termodynamisk jämvikt i ”classic procedure” för optimal temperaturuppskattning. Kort sagt, vid temperaturer nära och över enzymets smälttemperatur (Tm) minskar den aktiva enzymkoncentrationen kontinuerligt under analysens gång på grund av termisk denaturering av proteinet., Proteindenatureringshastigheten är mycket lägre under Tm, så koncentrationen av det aktiva enzymet förändras inte i detta temperaturområde. Dessutom, Ju högre temperaturen desto större är fraktionen av substratpopulationen som når övergångstillståndet, vilket ökar reaktionshastigheten. Dessa trender är samtidiga under hela enzymaktivitetsanalysen., Vid temperaturer som tillåter en minskning av enzymaktiviteten orsakad av proteindenaturering för att övervinna reaktionshastigheten som orsakas av temperaturen sjunker den detekterade enzymaktiviteten under analysens gång. Däremot, vid temperaturer vid vilka ingen proteindenaturering uppstår, förändras den detekterade aktiviteten inte som en funktion av tiden. Av denna anledning förändras de relativa aktivitetsdata under analysen och den optimala temperaturen skiftar mot lägre värden.,
tecken på denna skiftande balans är att mer markant minskning av relativ aktivitet observerades i de experiment som utfördes vid 42 och 46 ° C (Fig 1A), som var de närmaste temperaturerna till Tm för Sfßgly (45 °C). Ju lägre Sfßgly-koncentrationen är desto kortare är den tid som krävs vid 42 °C för termisk denaturering för att minska den aktiva enzympopulationen till en fraktion som är sämre än den som finns vid 37 °C, vid vilken Sfßgly är stabil., I själva verket, med 280 nM Sfßgly, tog det 70 min vid 42 ° C för att minska den aktiva enzymkoncentrationen till en nivå vid vilken den relativa aktiviteten var lägre än vid 37 ° C (Fig 2a), medan denna kopplingspunkt inträffade vid 40 min med 140 nM Sfßgly (Fig 1A). Slutligen, med den lägsta proteinkoncentrationen som användes (85 nM), hade de relativa aktivitetsdata för 42 och 37 °C redan utbytt positioner vid 10 min (Fig 2b).,
för att bestämma mekanismen för den optimala temperaturvariationen som föreslagits ovan upprepade vi samma experiment med ett termofilt β-glukosidas, bglTm, från Thermatoga maritima , som har en Tm över 95 °c, långt högre än 46 °C. Således är bglTm stabil i temperaturområdet som används i experimenten, och följaktligen förändras inte populationen av aktivt enzym under analysen. Balansförskjutningarna som en funktion av analystemperaturen och enzymet Tm gäller inte här, och som förväntat bytte de relativa aktivitetsdata (Fig 3a) inte positioner över tiden., Dessutom visar ”optimal temperaturplot” en kontinuerligt ökande linje, vilket uteslutande berodde på temperatureffekten på sannolikheten att substratet nådde övergångstillståndet. Denna tomt berodde inte på analystiden (Fig 3b).
a) Bgltm: s relativa aktivitet under hela analysen vid olika temperaturer. (lila kors) 29°C; (blå cirkel) 33°C; (blå diamant) 37°C; (Röda torget) 42°C; (grön triangel) 46°C. B) effekten av analystid på den relativa aktiviteten., Enzymkoncentrationen var 7,5 nM. Denna kompletta datauppsättning (genomsnittliga relativa aktiviteter och respektive avvikelser) presenteras på S3-tabellen.
därför observeras de klassiska klockformade kurvorna för ”optimala temperaturdiagram” endast om enzymdenaturerna under aktivitetsanalysen observeras. Således kan man ifrågasätta om det är lämpligt att beteckna den högsta punkten i dessa tomter den ”optimala temperaturen”.
dessa anmärkningar sträcker sig utöver en teknisk fråga., Användning av den ”optimala temperaturen” för enzymkarakterisering kan resultera i felaktiga kinetiska parametrar (Km, Ki och kcat) på grund av närvaron av denaturerat protein i proverna under de initiala hastighetsbestämningarna. Viktigt, med tanke på dess beroende av analysförhållandena, kan antagandet av den” optimala temperaturen ” som bestäms under bänkförhållanden för storskaliga användningsområden, som skiljer sig markant i analysens varaktighet och enzymkoncentration, leda till minskande reaktionshastigheter, lägre produktutbyte och ekonomiska förluster.