Resultados e discussão
Para demonstrar que o ideal enzima de temperatura depende das condições do ensaio, a β-glicosidase Sfßgly foi enviado para o “clássico” procedimento para a temperatura ótima de determinação, isto é, sua atividade foi determinada em diferentes temperaturas (29 a 46 °C), utilizando a mesma concentração da enzima., Em seguida, a actividade de Sfßgly durante um ensaio a temperatura fixa foi determinada utilizando o primeiro derivado em pontos específicos da curva produto / tempo (Fig. S2). Com base nestes resultados, a actividade relativa do Sfßgly foi calculada em momentos distintos (10 a 120 minutos), o que possibilitou o exame de como as parcelas de temperatura óptima evoluíram durante os ensaios da mesma enzima (Fig. 1).
A) actividade relativa do Sfßgly durante os ensaios a temperaturas diferentes., (Cruz púrpura) 29 ° C; (círculo azul) 33°C; (diamante azul) 37°C; (quadrado vermelho) 42°C; (triângulo verde) 46°C. As linhas tracejadas verticais realçam três tempos de ensaio diferentes (20, 60 e 120 min). A actividade relativa a 42°C e 37 ° C nestes tempos de ensaio é apresentada em caixas arredondadas, ilustrando a deslocação da temperatura óptima ao longo de todo o ensaio. B) alterações na temperatura óptima resultantes de modificações da duração do ensaio enzimático. O círculo vermelho e as setas evidenciam a diminuição da actividade enzimática a 42°C, que foi a temperatura ideal no ensaio mais curto., O círculo azul e a seta ilustram o aumento da actividade relativa a 37°C, que foi a temperatura ideal apenas para períodos de ensaio mais longos. A concentração enzimática foi de 140 nM. Este conjunto completo de dados (Média das actividades relativas e respectivos desvios) é apresentado no quadro S1.
uma visão geral da Fig. 1 revela que a posição relativa dos dados de actividade associada a cada alteração de temperatura com o tempo de ensaio (Fig. 1A). Por exemplo, a 20 minutos, a maior atividade relativa, ou seja, a temperatura ideal, foi observada a 42 ° C., Inversamente, a 60 minutos, a temperatura óptima era de 37 °C. Assim, a temperatura óptima mudou 5 °C modificando o comprimento do ensaio, enquanto as restantes condições (concentrações enzimáticas e substratos e tampão) eram constantes. Mais dramaticamente, no ensaio de 120 minutos, a actividade relativa a 42 °C-a antiga temperatura óptima—diminuiu para apenas 50%. Portanto, as parcelas do efeito da temperatura na actividade enzimática relativa para diferentes durações do doseamento mostram claramente diferentes formas e máximos, ou seja, temperaturas óptimas, mesmo quando produzidas a partir da mesma enzima (Fig. 1B).,
Como uma demonstração adicional de que a temperatura óptima não é um parâmetro constante, a experiência acima descrita foi repetida utilizando duas concentrações diferentes de Sfßgly (Fig. 2). É evidente que o posicionamento relativo dos dados de actividade evoluiu de forma diferente durante o ensaio para os ensaios realizados com 85 e 280 nM Sfßgly., As parcelas do efeito da temperatura na actividade enzimática preparadas com dados de ensaios de 20 minutos indicaram que a temperatura óptima para 280 nM Sfßgly era de 42 °C (Fig. 2A), enquanto a temperatura óptima para esta mesma enzima a 85 nM era de 37 °C (Fig. 2B). Por conseguinte, a temperatura óptima foi também afectada pela concentração enzimática.
A) actividade relativa do Sfßgly durante os ensaios a diferentes temperaturas em experiências realizadas utilizando 280 nM Sfßgly e B) 85 nM Sfßgly., (Cruz púrpura) 29°C; (círculo azul) 33°C; (diamante azul) 37°C; (quadrado vermelho) 42°C; (triângulo verde) 46°C. As pastilhas mostram o gráfico de temperatura ideal para ensaios de 20 minutos em cada concentração enzimática. A comparação das parcelas inseridas ilustra o desvio óptimo da temperatura devido à diluição enzimática. Este conjunto completo de dados (Média das actividades relativas e respectivos desvios) é apresentado no quadro S2.
Em conclusão, a temperatura óptima alterou-se com a modificação do tempo de ensaio e da concentração enzimática., Assim, não é um parâmetro que reflete uma propriedade enzimática intrínseca, mas sim uma mera consequência das condições do ensaio.
a base molecular das modificações observadas da actividade Relativa e da temperatura óptima baseia-se no facto de a população enzimática não estar em equilíbrio termodinâmico no “procedimento clássico” para uma estimativa óptima da temperatura. Brevemente, a temperaturas próximas e superiores à temperatura de fusão enzimática (Tm), a concentração enzimática activa diminui continuamente ao longo do ensaio devido à desnaturação térmica da proteína., A taxa de desnaturação das proteínas é muito inferior à Tm, pelo que a concentração da enzima activa não se altera neste intervalo de temperatura. Além disso, quanto maior a temperatura, maior a fração da população do substrato que atinge o estado de transição, o que aumenta a taxa de reação. Estas tendências são simultâneas ao longo do ensaio de actividade enzimática., Assim, a temperaturas que permitem a diminuição da actividade enzimática causada pela desnaturação das proteínas para ultrapassar o aumento da taxa de reacção causado pela temperatura, a actividade enzimática detectada diminui durante o ensaio. Em contraste, a temperaturas nas quais não ocorre desnaturação proteica, a atividade detectada não muda em função do tempo. Por esta razão, os dados relativos à actividade mudam durante o ensaio, e a temperatura óptima muda para valores mais baixos.,
evidência deste equilíbrio de deslocamento é que reduções mais marcadas na atividade relativa foram observadas nos experimentos realizados a 42 e 46 °C (Fig. 1A), que foram as temperaturas mais próximas do Tm para Sfßgly (45 °C ). Além disso, quanto mais baixa for a concentração de Sfßgly, mais curto é o tempo necessário a 42 °C para a desnaturação térmica para reduzir a população de enzimas activas para uma fracção inferior à presente a 37 °C, na qual o Sfßgly é estável., Na verdade, com 280 nM Sfßgly, levou 70 min a 42 °C para reduzir a concentração da enzima ativa para um nível em que a atividade relativa foi inferior a 37 °C (Fig 2A), considerando que este ponto de comutação ocorreu aos 40 min de 140 nM Sfßgly (Fig 1A). Por último, com a menor concentração de proteínas utilizada (85 nM), os dados relativos à actividade de 42 e 37 °C já tinham trocado posições a 10 minutos (Fig. 2B).,
Para determinar o mecanismo da variação de temperatura ideal proposto acima, nós o repetimos as mesmas experiências com um thermophilic β-glicosidase, bglTm, a partir de Thermatoga maritima, que tem um Tm acima de 95 °C , muito mais que o 46 °C. Assim, bglTm é estável, na faixa de temperatura empregada nos experimentos e, conseqüentemente, a população de enzima ativa não se altera durante o ensaio. Os deslocamentos do saldo em função da temperatura do ensaio e da enzima Tm não se aplicam aqui e, como esperado, os dados relativos à actividade (Fig. 3A) não mudaram de posição ao longo do tempo., Além disso, o” gráfico de temperatura óptima ” mostra uma linha que aumenta continuamente, o que resulta exclusivamente do efeito da temperatura sobre a probabilidade de o substrato atingir o estado de transição. Esta parcela não dependeu do tempo de ensaio (Fig. 3B).
A) actividade relativa de bglTm ao longo do ensaio a diferentes temperaturas. (Cruz roxa) 29°C; (círculo azul) 33°C; (diamante azul) 37°C; (quadrado vermelho) 42°C; (triângulo verde) 46°C. B) efeito do tempo do doseamento na actividade relativa., A concentração enzimática foi de 7, 5 nM. Este conjunto completo de dados (Média das actividades relativas e respectivos desvios) é apresentado no quadro S3.por conseguinte, as curvas clássicas em forma de sino das “parcelas de temperatura óptima” só são observadas se a enzima desnaturar durante o ensaio de actividade. Assim, pode-se questionar se é aconselhável designar o ponto mais alto destas parcelas a “temperatura óptima”.estas observações vão além de uma questão técnica., A utilização da” temperatura óptima ” para a caracterização enzimática pode resultar em parâmetros cinéticos errados (Km, Ki e kcat) devido à presença de proteínas desnaturadas nas amostras durante as determinações da taxa inicial. Importante é que, tendo em conta a sua dependência das condições de ensaio, a adopção da “temperatura óptima” determinada no banco de ensaio para utilizações em grande escala, que diferem acentuadamente na duração do ensaio e na concentração enzimática, pode resultar numa diminuição das taxas de reacção, numa diminuição dos rendimentos do produto e em perdas financeiras.