resultados y discusión
para demostrar que la temperatura enzimática óptima depende de las condiciones de ensayo, La β-glucosidasa Sfßgly se sometió al procedimiento «clásico» para la determinación de temperatura óptima, es decir, su actividad se determinó a diferentes temperaturas (29 a 46 °C) utilizando la misma concentración enzimática., Luego, la actividad de Sfßgly durante el curso de un ensayo de temperatura fija se determinó utilizando la primera derivada en puntos específicos de la curva de producto versus tiempo (S2 Fig). Sobre la base de estos resultados, se calculó la actividad relativa de Sfßgly en distintos momentos (10 a 120 min), lo que hizo posible el examen de cómo evolucionaron las gráficas de temperatura óptima durante los ensayos de la misma enzima (Fig.1).
A) actividad relativa de Sfßgly durante los ensayos a diferentes temperaturas., (Cruz púrpura) 29°C; (Círculo Azul) 33°C; (Diamante Azul) 37°C; (cuadrado rojo) 42°C; (triángulo Verde) 46°C. Las líneas discontinuas verticales resaltan tres tiempos de ensayo diferentes (20, 60 y 120 min). La actividad relativa a 42°C y 37 ° C En estos tiempos de ensayo se presenta en las cajas redondeadas, que ilustran el cambio de la temperatura óptima a lo largo del ensayo. B) cambios en la temperatura óptima resultantes de modificaciones en la duración del ensayo enzimático. El círculo rojo y las flechas resaltan la disminución de la actividad enzimática a 42 ° C, que fue la temperatura óptima en el ensayo más corto., El círculo azul y la flecha ilustran el aumento de la actividad relativa a 37 ° C, que era la temperatura óptima solo para tiempos de ensayo más largos. La concentración enzimática fue de 140 nM. Este conjunto de datos completo (actividades relativas medias y desviaciones respectivas) se presenta en la tabla S1.
Una visión general de la Figura 1 revela que la posición relativa de los datos de actividad asociados con cada temperatura cambia con el tiempo de ensayo (figura 1a). Por ejemplo, a los 20 min, la actividad relativa más alta, es decir, la temperatura óptima, se observó a 42 °C., Por el contrario, a los 60 min, la temperatura óptima fue de 37 ° C. Por lo tanto, la temperatura óptima cambió en 5 °C al modificar la longitud del ensayo, mientras que las condiciones restantes (concentraciones de enzimas y sustratos y tampón) fueron constantes. Más dramáticamente, en el ensayo de 120 minutos, la actividad relativa a 42 ° C—la temperatura óptima anterior-cayó a solo 50%. Por lo tanto, los gráficos del efecto de la temperatura sobre la actividad enzimática relativa para diferentes duraciones de ensayo muestran claramente diferentes formas y máximos, es decir, temperaturas óptimas, incluso cuando se producen a partir de la misma enzima (Fig.1B).,
Como demostración adicional de que la temperatura óptima no es un parámetro constante, el experimento descrito anteriormente se repitió empleando dos concentraciones diferentes de Sfßgly (Fig 2). Está claro que el posicionamiento relativo de los datos de actividad evolucionó de manera diferente durante el curso del ensayo para los experimentos realizados con 85 y 280 nM Sfßgly., Los gráficos del efecto de la temperatura sobre la actividad enzimática preparados con datos de ensayos de 20 minutos indicaron que la temperatura óptima para 280 nM Sfßgly fue de 42 ° C (Fig 2A), mientras que la temperatura óptima para esta misma enzima a 85 nM fue de 37 °C (Fig 2B). Por lo tanto, la temperatura óptima también se vio afectada por la concentración enzimática.
A) actividad relativa de Sfßgly durante los ensayos a diferentes temperaturas en experimentos realizados con 280 nM Sfßgly y B) 85 nM Sfßgly., (Cruz púrpura) 29°C; (Círculo Azul) 33°C; (Diamante Azul) 37°C; (cuadrado rojo) 42°C; (triángulo Verde) 46°C. Los insertos muestran la gráfica de temperatura óptima para ensayos de 20 minutos a cada concentración enzimática. La comparación de las gráficas insertadas ilustra el cambio de temperatura óptimo debido a la dilución enzimática. Este conjunto de datos completo (actividades relativas medias y desviaciones respectivas) se presenta en la tabla S2.
En conclusión, la temperatura óptima cambió con la modificación del tiempo de ensayo y la concentración enzimática., Por lo tanto, no es un parámetro que refleja una propiedad enzimática intrínseca, sino que es una mera consecuencia de las condiciones del ensayo.
la base molecular de las modificaciones observadas de la actividad relativa y la temperatura óptima se basa en el hecho de que la población enzimática no está en equilibrio termodinámico en el «procedimiento clásico» para la estimación de temperatura óptima. Brevemente, a temperaturas cercanas o superiores a la temperatura de fusión enzimática (Tm), la concentración enzimática activa disminuye continuamente a lo largo del ensayo debido a la desnaturalización térmica de la proteína., La tasa de desnaturalización de la proteína es mucho menor por debajo de la Tm, por lo que la concentración de la enzima activa no cambia en este rango de temperatura. Además, cuanto mayor es la temperatura, mayor es la fracción de la población de sustrato que alcanza el estado de transición, lo que aumenta la velocidad de reacción. Estas tendencias son simultáneas a lo largo del ensayo de actividad enzimática., Por lo tanto, a temperaturas que permiten que la disminución de la actividad enzimática causada por la desnaturalización de la proteína supere el aumento de la velocidad de reacción causado por la temperatura, la actividad enzimática detectada disminuye durante el curso del ensayo. Por el contrario, a temperaturas en las que no se produce la desnaturalización de la proteína, la actividad detectada no cambia en función del tiempo. Por esta razón, los datos relativos de actividad cambian durante el ensayo, y la temperatura óptima cambia hacia valores más bajos.,
La evidencia de este equilibrio cambiante es que se observaron disminuciones más marcadas en la actividad relativa en los experimentos realizados a 42 y 46 °C (Fig 1A), que fueron las temperaturas más cercanas a la Tm para Sfßgly (45 °C ). Además, cuanto menor sea la concentración de Sfßgly, menor será el tiempo requerido a 42 ° C para la desnaturalización térmica para reducir la población de enzimas activas a una fracción inferior a la presente a 37 °C, En la que Sfßgly es estable., De hecho, con 280 nM Sfßgly, se tardó 70 min a 42 ° C para reducir la concentración de la enzima activa a un nivel en el que la actividad relativa era inferior a la de 37 °C (Fig 2A), mientras que este punto de conmutación se produjo a 40 min con 140 nM Sfßgly (Fig 1A). Finalmente, con la concentración de proteína más baja utilizada (85 nM), los datos de actividad relativa para 42 y 37 °C ya habían intercambiado posiciones a 10 min (Fig 2B).,
para determinar el mecanismo de la variación de temperatura óptima propuesta anteriormente, repetimos los mismos experimentos con una β-glucosidasa termofílica, bglTm, de Thermatoga maritima, que tiene una Tm por encima de 95 °C , muy superior a 46 °C. Por lo tanto, bglTm es estable en el rango de temperatura empleado en los experimentos, y en consecuencia, la población de enzima activa no cambia durante el ensayo. Los desplazamientos de la balanza en función de la temperatura del ensayo y de la enzima Tm no se aplican aquí, y como era de esperar, los datos relativos de actividad (Fig.3a) no cambiaron de posición a lo largo del tiempo., Además, el «gráfico de temperatura óptima» muestra una línea en continuo aumento, que resultó exclusivamente del efecto de la temperatura en la probabilidad de que el sustrato alcanzara el estado de Transición. Esta parcela no dependen del tiempo de ensayo (Fig 3B).
A) actividad relativa de bglTm a lo largo del ensayo a diferentes temperaturas. (Cruz púrpura) 29°C; (Círculo Azul) 33°C; (Diamante Azul) 37°C; (cuadrado rojo) 42°C; (triángulo Verde) 46°C. B) efecto del tiempo de ensayo sobre la actividad relativa., La concentración enzimática fue de 7,5 nM. Este conjunto de datos completo (actividades relativas medias y desviaciones respectivas) se presenta en la tabla S3.
por lo tanto, las curvas clásicas en forma de campana de «gráficas de temperatura óptima» solo se observan si la enzima se desnaturaliza durante el ensayo de actividad. Por lo tanto, uno podría preguntarse si es aconsejable llamar al punto más alto de estas parcelas la «temperatura óptima».
estas observaciones van más allá de una cuestión técnica., La utilización de la «temperatura óptima» para la caracterización enzimática puede resultar en parámetros cinéticos erróneos (Km, Ki y kcat) debido a la presencia de proteína desnaturalizada en las muestras durante las determinaciones de velocidad inicial. Es importante destacar que, teniendo en cuenta su dependencia de las condiciones de ensayo, la adopción de la «temperatura óptima» determinada en condiciones de banco para usos a gran escala, que difieren notablemente en la duración del ensayo y la concentración enzimática, puede resultar en una disminución de las tasas de reacción, menores rendimientos del producto y pérdidas financieras.