resultaten en discussie
om aan te tonen dat de optimale enzymtemperatuur afhankelijk is van de testomstandigheden, werd de β-glucosidase Sfßgly onderworpen aan de “klassieke” procedure voor optimale temperatuurbepaling, d.w.z. de activiteit werd bepaald bij verschillende temperaturen (29 tot 46 °C) met dezelfde enzymconcentratie., Vervolgens werd de Sfßgly-activiteit tijdens een bepaling met vaste temperatuur bepaald met behulp van het eerste derivaat op specifieke punten van de product-versus-tijdcurve (S2 Fig). Op basis van deze resultaten werd de relatieve activiteit van Sfßgly berekend op verschillende tijdstippen (10 tot 120 min), wat het mogelijk maakte te onderzoeken hoe de optimale temperatuurgrafieken zich ontwikkelden tijdens de tests van hetzelfde enzym (Fig.1).
a) relatieve activiteit van Sfßgly tijdens de tests bij verschillende temperaturen., (paars kruis) 29°C; (blauwe cirkel) 33°C; (blauwe diamant) 37°C; (rode vierkant) 42°C; (groene driehoek) 46°C. verticale gestippelde lijnen markeren drie verschillende testtijden (20, 60 en 120 min). De relatieve activiteit bij 42 en 37°C op deze testtijden wordt weergegeven in de afgeronde vakken, die de verschuiving van de optimale temperatuur gedurende de test illustreren. B) veranderingen in de optimale temperatuur als gevolg van wijzigingen in de duur van de enzymanalyse. De rode cirkel en pijlen markeren de afname van de enzymactiviteit bij 42°C, wat de optimale temperatuur was in de kortere test., De blauwe cirkel en de pijl illustreren de toename van de relatieve activiteit bij 37°C, die alleen voor langere testtijden de optimale temperatuur was. De enzymconcentratie was 140 nM. Deze complete dataset (gemiddelde relatieve activiteiten en respectievelijke afwijkingen) wordt weergegeven in S1-tabel.
een overzicht van Fig 1 laat zien dat de relatieve positie van de activiteitsgegevens die bij elke temperatuur horen, verandert met de testtijd (Fig 1A). Zo werd bij 20 min de hoogste relatieve activiteit, d.w.z. de optimale temperatuur, waargenomen bij 42 °C., Omgekeerd, bij 60 min, was de optimale temperatuur 37 °C. aldus veranderde de optimale temperatuur met 5 °C door wijziging van de testlengte, terwijl de resterende voorwaarden (enzym en substraat concentraties en buffer) constant waren. Meer dramatisch, in de 120-min test, de relatieve activiteit bij 42 °c—de vroegere optimale temperatuur—daalde tot slechts 50%. Daarom tonen grafieken van het temperatuureffect op de relatieve enzymactiviteit voor verschillende analysetijden duidelijk verschillende vormen en maxima, d.w.z. optimale temperaturen, zelfs wanneer ze uit hetzelfde enzym worden geproduceerd (Fig.1B).,
als aanvullend bewijs dat de optimale temperatuur geen constante parameter is, werd het hierboven beschreven experiment herhaald door gebruik te maken van twee verschillende concentraties Sfßgly (Fig.2). Het is duidelijk dat de relatieve positionering van de activiteitsgegevens in de loop van de test voor de experimenten met 85 en 280 nM Sfßgly verschillend evolueerde., Uit de grafieken van het temperatuureffect op de enzymactiviteit, die werden opgesteld met gegevens van tests van 20 minuten, bleek dat de optimale temperatuur voor 280 nM Sfßgly 42 °C was (Fig 2A), terwijl de optimale temperatuur voor hetzelfde enzym bij 85 nM 37 °C was (Fig 2B). Daarom werd de optimale temperatuur ook beïnvloed door de enzymconcentratie.
a) relatieve activiteit van Sfßgly tijdens de tests bij verschillende temperaturen in experimenten uitgevoerd met 280 nM Sfßgly en B) 85 nM Sfßgly., (paars kruis) 29°C; (blauwe cirkel) 33°C; (blauwe diamant) 37°C; (rode vierkant) 42°C; (groene driehoek) 46°C. Inserts tonen de optimale temperatuur grafiek voor 20-min tests bij elke enzymconcentratie. Vergelijking van de ingevoegde percelen illustreert de optimale temperatuurverschuiving als gevolg van enzymverdunning. Deze complete dataset (gemiddelde relatieve activiteiten en respectievelijke afwijkingen) wordt weergegeven in S2-tabel.
concluderend kan worden gesteld dat de optimale temperatuur veranderde met wijziging van de testtijd en de enzymconcentratie., Aldus, is het niet een parameter die een intrinsieke enzymeigenschap weerspiegelt maar in plaats daarvan een louter gevolg van de testvoorwaarden is.
De moleculaire basis van de waargenomen veranderingen van relatieve activiteit en optimale temperatuur berust op het feit dat de enzympopulatie niet in thermodynamisch evenwicht is in de “klassieke procedure” voor optimale temperatuurschatting. In het kort, bij temperaturen dicht bij en boven de smelttemperatuur van het enzym (TM), neemt de actieve enzymconcentratie in de loop van de test voortdurend af als gevolg van thermische denaturatie van het eiwit., De snelheid van eiwitdenaturatie is veel lager onder de Tm, dus de concentratie van het actieve enzym verandert niet in dit temperatuurbereik. Bovendien, hoe hoger de temperatuur, hoe groter de fractie van de substraatpopulatie die de overgangstoestand bereikt, die de reactiesnelheid verhoogt. Deze trends zijn gelijktijdig gedurende de enzymactiviteit assay., Aldus, bij temperaturen die de daling van enzymactiviteit toestaan die door eiwitdenaturatie wordt veroorzaakt om de verhoging van het reactietarief te overwinnen die door temperatuur wordt veroorzaakt, daalt de gedetecteerde enzymactiviteit tijdens de loop van de analyse. Bij temperaturen waarbij geen eiwitdenaturatie optreedt, verandert de gedetecteerde activiteit daarentegen niet als functie van de tijd. Om deze reden veranderen de relatieve activiteitsgegevens tijdens de analyse en verschuift de optimale temperatuur naar lagere waarden.,
Het bewijs voor deze verschuivende balans is dat bij de experimenten bij 42 en 46 °C (Fig 1A), die het dichtst bij de Tm lagen voor Sfßgly (45 °C), duidelijkere dalingen van de relatieve activiteit werden waargenomen. Bovendien, hoe lager de Sfßgly concentratie, hoe korter de tijd die nodig is bij 42 °C voor thermische denaturatie om de actieve enzympopulatie te verminderen tot een fractie inferieur aan die aanwezig bij 37 °C, waarbij Sfßgly stabiel is., In feite duurde het bij 280 nM Sfßgly 70 minuten bij 42 °C om de actieve enzymconcentratie te verlagen tot een niveau waarbij de relatieve activiteit lager was dan die bij 37 °C (Fig 2A), terwijl dit schakelpunt optrad bij 40 minuten bij 140 nM Sfßgly (Fig 1A). Ten slotte, met de laagste eiwitconcentratie gebruikt (85 nM), De relatieve activiteit gegevens voor 42 en 37 °C hadden al uitgewisseld posities bij 10 min (Fig 2B).,om het mechanisme van de hierboven voorgestelde optimale temperatuurvariatie te bepalen, hebben wij dezelfde experimenten herhaald met een thermofiele β-glucosidase, bglTm, uit Thermatoga maritima, die een Tm heeft boven 95 °C , veel hoger dan 46 °C. bglTm is dus stabiel in het temperatuurbereik dat bij de experimenten wordt gebruikt, en bijgevolg verandert de populatie van actieve enzymen tijdens de test niet. De balansverplaatsingen als functie van de testtemperatuur en het enzym Tm zijn hier niet van toepassing, en zoals verwacht hebben de relatieve activiteitsgegevens (Fig.3A) in de loop van de tijd niet van positie gewisseld., Bovendien toont de “optimale temperatuurplot” een continu stijgende lijn, die uitsluitend het gevolg was van het temperatuureffect op de kans dat het substraat de overgangstoestand bereikte. Deze grafiek was niet afhankelijk van de testtijd (Fig.3B).
A) relatieve activiteit van bglTm gedurende de test bij verschillende temperaturen. (paars kruis) 29°C; (blauwe cirkel) 33°C; (blauwe diamant) 37°C; (rode vierkant) 42°C; (groene driehoek) 46°C. B) Effect van de testtijd op de relatieve activiteit., De enzymconcentratie was 7,5 nM. Deze complete dataset (gemiddelde relatieve activiteiten en respectievelijke afwijkingen) wordt weergegeven in S3-tabel.
daarom worden de klassieke klokvormige curven van “optimum temperature plots” alleen waargenomen als het enzym tijdens de activiteitstest denatureert. Men zou zich dus kunnen afvragen of het raadzaam is om het hoogste punt van deze percelen de “optimale temperatuur”te noemen.
deze opmerkingen gaan verder dan een technische kwestie., Gebruik van de” optimale temperatuur ” voor enzymkarakterisatie kan resulteren in verkeerde kinetische parameters (Km, Ki en kcat) als gevolg van de aanwezigheid van gedenatureerde eiwitten in de monsters tijdens de initiële snelheidsbepalingen. Belangrijk is dat, gezien de afhankelijkheid van de testomstandigheden, de vaststelling van de “optimale temperatuur”, bepaald onder testomstandigheden voor grootschalige toepassingen, die sterk verschillen in testduur en enzymconcentratie, kan resulteren in afnemende reactiesnelheden, lagere productopbrengsten en financiële verliezen.