wyniki i dyskusja
aby wykazać, że optymalna temperatura enzymu zależy od warunków testu, β-glukozydazę Sfßgly poddano „klasycznej” procedurze określania optymalnej temperatury, tzn. jej aktywność oznaczano w różnych temperaturach (29 do 46 °c) przy użyciu tego samego stężenia enzymu., Następnie aktywność Sfßgly ' ego w trakcie testu o stałej temperaturze oznaczono przy użyciu pierwszej pochodnej w określonych punktach krzywej produktu względem czasu (rys. S2). Na podstawie tych wyników obliczono względną aktywność Sfßgly w różnych porach (10-120 min), co umożliwiło zbadanie, w jaki sposób optymalne wykresy temperatury ewoluowały podczas testów tego samego enzymu (ryc. 1).
a) względna aktywność Sfßgly podczas testów w różnych temperaturach., (fioletowy krzyż) 29°C; (niebieskie koło) 33°C; (niebieski diament) 37°C; (czerwony kwadrat) 42°C; (zielony trójkąt) 46°C. pionowe przerywane linie wyróżniają trzy różne czasy testu (20, 60 i 120 min). Względna aktywność w temperaturze 42°C i 37 ° C w tych czasach badania jest przedstawiona w zaokrąglonych polach, ilustrujących przesunięcie optymalnej temperatury w trakcie badania. B) zmiany optymalnej temperatury wynikające ze zmian czasu trwania testu enzymatycznego. Czerwone kółko i strzałki podkreślają spadek aktywności enzymu w temperaturze 42°C, która była optymalną temperaturą w krótszym teście., Niebieskie kółko i strzałka ilustrują wzrost względnej aktywności w temperaturze 37°C, która była optymalną temperaturą tylko dla dłuższych czasów badania. Stężenie enzymu wynosiło 140 nM. Ten kompletny zestaw danych (średnie względne działania i odpowiednie odchylenia) przedstawiono w tabeli S1.
przegląd Rys. 1 pokazuje, że względna pozycja danych dotyczących aktywności związanych z każdą temperaturą zmienia się wraz z czasem badania (rys. 1A). Na przykład, w 20 min, najwyższą względną aktywność, tj. optymalną temperaturę, zaobserwowano w temperaturze 42 °C., Odwrotnie, w 60 min, optymalna temperatura wynosiła 37 °C. Tak więc, optymalna temperatura zmieniła się o 5 °C przez zmianę długości testu, podczas gdy pozostałe warunki (stężenie enzymu i substratu oraz bufor) były stałe. Bardziej dramatycznie, w teście 120-minutowym, względna aktywność w temperaturze 42 °C—dawnej optymalnej temperaturze-spadła tylko do 50%. W związku z tym wykresy wpływu temperatury na względną aktywność enzymu dla różnych czasów trwania testu wyraźnie pokazują różne kształty i maksimum, tj. optymalne temperatury, nawet jeśli są wytwarzane z tego samego enzymu (rys. 1B).,
jako dodatkowy dowód na to, że optymalna temperatura nie jest parametrem stałym, opisany powyżej eksperyment powtórzono, stosując dwa różne stężenia Sfßgly (ryc. 2). Jest oczywiste, że względne pozycjonowanie danych dotyczących aktywności ewoluowało w różny sposób w trakcie testu dla eksperymentów wykonanych z Sfßgly 85 i 280 nM., Wykresy wpływu temperatury na aktywność enzymu przygotowane z danych z 20-minutowych testów wykazały, że optymalna temperatura dla Sfßgly 280 nM wynosiła 42 °C (ryc. 2A), natomiast optymalna temperatura dla tego samego enzymu przy 85 nM wynosiła 37 ° C (ryc. 2b). W związku z tym na optymalną temperaturę wpływało również stężenie enzymu.
a) względna aktywność Sfßgly podczas testów w różnych temperaturach w eksperymentach wykonanych przy użyciu 280 nM Sfßgly i B) 85 nM Sfßgly., (fioletowy krzyż) 29°C; (niebieskie koło) 33°C; (niebieski diament) 37°C; (czerwony kwadrat) 42°C; (zielony trójkąt) 46°C. Wstawki pokazują optymalną wykres temperatury dla 20-minutowych testów przy każdym stężeniu enzymu. Porównanie wstawionych Wykresów ilustruje optymalne przesunięcie temperatury spowodowane rozcieńczeniem enzymu. Ten kompletny zestaw danych (średnie względne działania i odpowiednie odchylenia) przedstawiono w tabeli S2.
podsumowując, optymalna temperatura zmieniała się wraz z modyfikacją czasu badania i stężenia enzymu., W związku z tym nie jest to parametr, który odzwierciedla wewnętrzną właściwość enzymu, ale zamiast tego jest zwykłą konsekwencją warunków testu.
molekularne podstawy zaobserwowanych zmian względnej aktywności i optymalnej temperatury opierają się na fakcie, że populacja enzymu nie znajduje się w równowadze termodynamicznej w „klasycznej procedurze” dla estymacji optymalnej temperatury. Krótko mówiąc, w temperaturach zbliżonych do temperatury topnienia enzymu (Tm) i wyższych, stężenie aktywnego enzymu stale zmniejsza się w trakcie badania z powodu termicznej denaturacji białka., Szybkość denaturacji białka jest znacznie niższa niż Tm, więc stężenie aktywnego enzymu nie zmienia się w tym zakresie temperatur. Dodatkowo, im wyższa temperatura, tym większa frakcja populacji substratu, która osiąga stan przejściowy, co zwiększa szybkość reakcji. Tendencje te występują równocześnie w czasie badania aktywności enzymów., Tak więc, w temperaturach, które pozwalają zmniejszyć aktywność enzymu spowodowaną denaturacją białka w celu przezwyciężenia wzrostu szybkości reakcji spowodowanego temperaturą, wykryta aktywność enzymu spada w trakcie badania. Natomiast w temperaturach, w których nie występuje denaturacja białka, wykryta aktywność nie zmienia się w funkcji czasu. Z tego powodu względne dane dotyczące aktywności zmieniają się podczas testu, a optymalna temperatura przesuwa się w kierunku niższych wartości.,
Dowodem tego przesunięcia równowagi jest to, że bardziej wyraźne spadki względnej aktywności zaobserwowano w eksperymentach przeprowadzonych w temperaturze 42 i 46 °C (ryc. 1a), które były najbliższymi temperaturami TM dla Sfßgly (45 °C ). Ponadto im niższe stężenie Sfßgly, tym krótszy czas wymagany w temperaturze 42 °C do denaturacji termicznej w celu zmniejszenia populacji aktywnego enzymu do frakcji mniejszej niż obecna w temperaturze 37 °C, przy której Sfßgly jest stabilny., W rzeczywistości, przy 280 nM Sfßgly, zajęło 70 minut w temperaturze 42 °c, aby zmniejszyć stężenie aktywnego enzymu do poziomu, przy którym względna aktywność była niższa niż w temperaturze 37 °C (ryc. 2A), podczas gdy ten punkt przełączania występował w 40 min przy 140 nM Sfßgly (ryc. 1a). Wreszcie, przy najniższym stężeniu białka (85 nM), dane dotyczące względnej aktywności dla 42 i 37 °C wymieniały już pozycje w 10 min (rys. 2b).,
aby określić mechanizm optymalnej zmiany temperatury zaproponowanej powyżej, powtórzyliśmy te same eksperymenty z termofilną β-glukozydazą, bglTm, z Thermatoga maritima, która ma Tm powyżej 95 °C , znacznie wyższą niż 46 °C. Tak więc, bglTm jest stabilny w zakresie temperatur stosowanych w eksperymentach, a zatem populacja aktywnego enzymu nie zmienia się podczas testu. Przemieszczenia równowagi w funkcji temperatury testu i enzymu TM nie mają tutaj zastosowania, a zgodnie z oczekiwaniami względne dane dotyczące aktywności (rys. 3a) nie zmieniały pozycji w czasie., Ponadto „Wykres optymalnej temperatury” pokazuje stale rosnącą linię, która wynikała wyłącznie z wpływu temperatury na prawdopodobieństwo, że podłoże osiągnęło stan przejściowy. Wykres ten nie zależał od czasu testu (ryc. 3b).
a) względna aktywność bglTm w czasie badania w różnych temperaturach. (fioletowy krzyż) 29°C; (niebieskie koło) 33°C; (niebieski diament) 37°C; (czerwony kwadrat) 42°C; (zielony trójkąt) 46°C. B) wpływ czasu testu na względną aktywność., Stężenie enzymu wynosiło 7,5 nM. Ten kompletny zestaw danych (średnia względna aktywność i odpowiednie odchylenia) przedstawiono w tabeli S3.
dlatego Klasyczne krzywe w kształcie dzwonka „optymalnych wykresów temperatury” obserwuje się tylko wtedy, gdy enzym denaturuje się podczas badania aktywności. Można więc zadać sobie pytanie, czy wskazane jest określenie najwyższego punktu tych wykresów „optymalną temperaturą”.
uwagi te wykraczają poza kwestie techniczne., Wykorzystanie „optymalnej temperatury” do charakterystyki enzymu może skutkować błędnymi parametrami kinetycznymi (Km, Ki i kcat) ze względu na obecność denaturowanego białka w próbkach podczas oznaczania szybkości początkowej. Co ważne, biorąc pod uwagę jego zależność od warunków badania, przyjęcie „optymalnej temperatury” określonej w warunkach laboratoryjnych dla zastosowań na dużą skalę, które znacznie różnią się czasem trwania badania i stężeniem enzymów, może skutkować zmniejszeniem szybkości reakcji, niższym uzyskiem produktu i stratami finansowymi.