Eredmények, megbeszélés
bizonyítani, Hogy az optimális enzim hőmérséklet függ a vizsgálat feltételek a β-glukozidáz Sfßgly nyújtottak be, hogy a “klasszikus” eljárás az optimális hőmérséklet meghatározása, azaz a tevékenység meghatározott különböző hőmérsékleteken (29 46 °C) ugyanazt enzim koncentráció., Ezután az Sfßgly-aktivitást egy rögzített hőmérsékletű vizsgálat során az első derivált segítségével határoztuk meg a termék versus time curve (S2 ábra) meghatározott pontjain. Ezen eredmények alapján az Sfßgly relatív aktivitását különböző időpontokban (10-120 perc) számítottuk ki, ami lehetővé tette annak vizsgálatát, hogy az optimális hőmérsékleti parcellák hogyan fejlődtek ugyanazon enzim vizsgálata során (1.ábra).
A) az Sfßgly relatív aktivitása a vizsgálatok során különböző hőmérsékleteken., (lila kereszt) 29°C; (kék kör) 33°C; (kék gyémánt) 37°C; (piros négyzet) 42°C; (zöld háromszög) 46°C. A függőleges szaggatott vonalak három különböző vizsgálati időpontot jelölnek ki (20, 60 és 120 perc). A relatív aktivitás 42 és 37°C-on ezekben a vizsgálati időpontokban a kerekített dobozokban látható, szemléltetve az optimális hőmérséklet eltolódását a vizsgálat során. B) az enzimvizsgálat időtartamának módosításából eredő optimális hőmérséklet változása. A piros kör és a nyilak kiemelik az enzimaktivitás 42°C-os csökkenését, ami a rövidebb vizsgálat optimális hőmérséklete volt., A kék kör és a nyíl mutatja a relatív aktivitás 37°C-os növekedését, ami csak hosszabb ideig volt optimális hőmérséklet. Az enzimkoncentráció 140 nM volt. Ezt a teljes adatkészletet (átlagos relatív tevékenységek és eltérések) az S1 táblázat tartalmazza.
az 1. ábra áttekintése azt mutatja, hogy az egyes hőmérsékleti változásokhoz kapcsolódó aktivitási adatok relatív helyzete a vizsgálati idővel (1a.ábra) változik. Például 20 percen belül a legmagasabb relatív aktivitást, azaz az optimális hőmérsékletet 42 °C-on figyelték meg., Ezzel szemben 60 percen belül az optimális hőmérséklet 37 °C volt.így az optimális hőmérséklet 5 °C-kal változott a vizsgálati hossz módosításával, míg a fennmaradó körülmények (enzim-és szubsztrátkoncentrációk és puffer) állandóak voltak. Drámaian, a 120 perces vizsgálatban a relatív aktivitás 42 °C—on—a korábbi optimális hőmérséklet-csak 50% – ra csökkent. Ezért a különböző vizsgálati időtartamok relatív enzimaktivitására gyakorolt hőmérsékleti hatás diagramjai egyértelműen különböző alakzatokat és maximákat mutatnak, azaz optimális hőmérsékletet, még akkor is, ha ugyanabból az enzimből állítják elő (1b ábra).,
további bizonyítékként arra, hogy az optimális hőmérséklet nem állandó paraméter, a fent leírt kísérletet megismételtük két különböző Sfßgly koncentráció alkalmazásával (2.ábra). Nyilvánvaló, hogy a 85 és 280 nM-es Sfßgly-vel végzett kísérletek során az aktivitási adatok relatív pozícionálása eltérő módon alakult ki., Az enzimaktivitásra gyakorolt hőmérsékleti hatás 20 perces vizsgálatokból származó adatokkal készített parcellái azt mutatták, hogy a 280 nM-es Sfßgly optimális hőmérséklete 42 °C volt (2a.ábra), míg ugyanezen enzim optimális hőmérséklete 85 nM-en 37 °C volt (2b. ábra). Ezért az optimális hőmérsékletet az enzimkoncentráció is befolyásolta.
A) az Sfßgly relatív aktivitása a 280 nM Sfßgly és B) 85 nM Sfßgly alkalmazásával végzett kísérletek során különböző hőmérsékleteken végzett vizsgálatok során., (lila kereszt) 29°C; (kék kör) 33°C; (kék gyémánt) 37°C; (piros négyzet) 42°C; (zöld háromszög) 46°C. A betétek az egyes enzimkoncentrációk 20 perces vizsgálatainak optimális hőmérsékleti tartományát mutatják. A beillesztett parcellák összehasonlítása szemlélteti az enzimhígítás miatti optimális hőmérséklet-eltolódást. Ezt a teljes adatkészletet (átlagos relatív tevékenységek és eltérések) az S2 táblázat tartalmazza.
összefoglalva, az optimális hőmérséklet megváltozott a vizsgálati idő és az enzimkoncentráció módosításával., Így ez nem egy olyan paraméter, amely tükrözi a belső enzim tulajdonságot, hanem inkább a vizsgálati feltételek puszta következménye.
a relatív aktivitás és az optimális hőmérséklet megfigyelt módosításainak molekuláris alapja azon a tényen alapul, hogy az enzimpopuláció nem áll termodinamikai egyensúlyban a “klasszikus eljárás” során az optimális hőmérséklet becsléséhez. Röviden, Az enzimolvadási hőmérséklethez (TM) közeli vagy feletti hőmérsékleten az aktív enzimkoncentráció folyamatosan csökken a vizsgálat során a fehérje termikus denaturálása miatt., A fehérje denaturációjának sebessége sokkal alacsonyabb a Tm alatt, így az aktív enzim koncentrációja nem változik ebben a hőmérsékleti tartományban. Ezenkívül minél magasabb a hőmérséklet, annál nagyobb a szubsztrátpopuláció frakciója, amely eléri az átmeneti állapotot, ami növeli a reakciósebességet. Ezek a tendenciák az enzimaktivitási vizsgálat során egyidejűleg jelentkeznek., Így olyan hőmérsékleten, amely lehetővé teszi a fehérje denaturáció által okozott enzimaktivitás csökkenését a hőmérséklet által okozott reakciósebesség-növekedés leküzdésére, az észlelt enzimaktivitás csökken a vizsgálat során. Ezzel szemben olyan hőmérsékleten, ahol nincs fehérje denaturáció, az észlelt aktivitás nem változik az idő függvényében. Ezért a vizsgálat során a relatív aktivitási adatok megváltoznak, az optimális hőmérséklet pedig alacsonyabb értékek felé tolódik el.,
ennek a változó egyensúlynak a bizonyítéka, hogy a relatív aktivitás jelentősebb csökkenését figyelték meg a 42 és 46 °C-on (1a.ábra) végzett kísérletek során, amelyek a Sfßgly (45 °C) esetében a TM-hez legközelebb eső hőmérsékletek voltak. Ezenkívül minél alacsonyabb az Sfßgly koncentráció, annál rövidebb a termikus denaturációhoz szükséges idő 42 °C-on, hogy az aktív enzimpopuláció 37 °C-nál alacsonyabb frakcióra csökkenjen, ahol az Sfßgly stabil., Sőt, a 280 nM Sfßgly, telt, 70 perc, 42 °C-kal csökkenti az aktív enzim koncentráció-egy olyan szintre, ahol a relatív aktivitás volt alacsonyabb 37 °C-on (2A Ábra), mivel ez a kapcsolási pontot történt, 40 perc 140 nM Sfßgly (1A Ábra). Végül, az alkalmazott legalacsonyabb fehérjekoncentráció (85 nM) mellett a 42 és 37 °C-os relatív aktivitási adatok már 10 percen át cseréltek pozíciókat (2b.ábra).,
a fent javasolt optimális hőmérsékletváltozás mechanizmusának meghatározásához ugyanazokat a kísérleteket ismételtük meg egy termofil β-glükozidáz, Bgltm, a Thermatoga maritima-tól, amelynek Tm-je 95 °C felett van, jóval magasabb, mint 46 °C. így a bgltm stabil a kísérletekben alkalmazott hőmérsékleti tartományban, következésképpen az aktív enzim populációja nem változik a vizsgálat során. Az egyensúlyi elmozdulások a vizsgálati hőmérséklet és a TM enzim függvényében itt nem alkalmazandók, és ahogy az várható volt, a relatív aktivitási adatok (3a.ábra) nem váltottak pozíciókat az idő múlásával., Ezenkívül az” optimális hőmérsékleti telek ” folyamatosan növekvő vonalat mutat, amely kizárólag a hőmérsékleti hatás miatt következett be annak valószínűségére, hogy az aljzat elérte az átmeneti állapotot. Ez a cselekmény nem függött a vizsgálati időtől (3b.ábra).
A) A bgltm relatív aktivitása a vizsgálat során különböző hőmérsékleteken. (lila kereszt) 29°C; (kék kör) 33°C; (kék gyémánt) 37°C; (piros négyzet) 42°C; (zöld háromszög) 46°C. B) A vizsgálati idő hatása a relatív aktivitásra., Az enzimkoncentráció 7,5 nM volt. Ezt a teljes adatkészletet (átlagos relatív tevékenységek és eltérések) az S3 táblázat tartalmazza.
ezért az “optimális hőmérsékleti parcellák” klasszikus harang alakú görbéit csak akkor figyeljük meg, ha az enzim denaturálódik az aktivitási vizsgálat során. Így megkérdőjelezhető, hogy tanácsos-e ezeknek a parcelláknak a legmagasabb pontját az “optimális hőmérsékletnek”nevezni.
ezek a Megjegyzések túlmutatnak egy technikai problémán., Az enzimjellemzéshez szükséges “optimális hőmérséklet” kihasználása téves kinetikai paramétereket (Km, Ki és kcat) eredményezhet, mivel a mintákban denaturált fehérje jelen van a kezdeti sebesség meghatározásakor. Fontos, hogy figyelembe véve a vizsgálati körülményektől való függését, a vizsgálat időtartamától és az enzimkoncentrációtól jelentősen eltérő, nagyüzemi felhasználási körülmények között meghatározott “optimális hőmérséklet” elfogadása a reakciósebesség csökkenéséhez, a termékhozamok csökkenéséhez és a pénzügyi veszteségekhez vezethet.