PMC (Română)

Rezultate și discuții

Pentru a demonstra că dimensiunea optimă a enzimei temperatura depinde de condițiilor de testare, β-glucozidaza Sfßgly a fost prezentat la „clasic” procedura de temperatura optimă de determinare, de exemplu, activitatea acesteia a fost determinată la diferite temperaturi (29 la 46 °C), folosind aceleași concentrația enzimei., Apoi, activitatea Sfßgly în cursul unui test de temperatură fixă a fost determinată utilizând primul derivat în anumite puncte ale curbei produsului față de timp (S2 Fig). Pe baza acestor rezultate, activitatea relativă a Sfßgly a fost calculată la momente distincte (10 până la 120 min), ceea ce a făcut posibilă examinarea modului în care au evoluat parcelele optime de temperatură în timpul testelor aceleiași enzime (Fig 1).

o prezentare generală a Fig 1 arată că poziția relativă a datelor de activitate asociate fiecărei temperaturi se schimbă cu timpul de testare (Fig 1a). De exemplu, la 20 min, cea mai mare activitate relativă, adică temperatura optimă, a fost observată la 42 °C., În schimb, la 60 min, Temperatura optimă a fost de 37 °C. Astfel, temperatura optimă s-a schimbat cu 5 °C prin modificarea lungimii testului, în timp ce condițiile rămase (concentrațiile enzimatice și substrat și tampon) au fost constante. Mai dramatic, în testul de 120 de minute, activitatea relativă la 42 °C—fosta temperatură optimă—a scăzut la doar 50%. Prin urmare, parcelele efectului de temperatură asupra activității enzimatice relative pentru diferite durate de testare arată clar diferite forme și maxime, adică temperaturi optime, chiar și atunci când sunt produse din aceeași enzimă (Fig 1b).,ca o demonstrație suplimentară că temperatura optimă nu este un parametru constant, experimentul descris mai sus a fost repetat prin utilizarea a două concentrații diferite de Sfßgly (Fig 2). Este clar că poziționarea relativă a datelor de activitate a evoluat diferit în cursul testului pentru experimentele efectuate cu 85 și 280 nM Sfßgly., Parcele de efectul temperaturii asupra activității enzimatice pregătit cu datele de la 20 de min de teste au indicat că temperatura optimă pentru 280 nM Sfßgly a fost de 42 °C (Fig. 2A), întrucât temperatura optimă pentru aceeași enzimă la 85 nM a fost de 37 °C (Fig 2B). Prin urmare, temperatura optimă a fost, de asemenea, afectată de concentrația enzimei.efectul concentrației enzimei asupra temperaturii optime.

Un) Raport de activitate al Sfßgly în timpul testelor la temperaturi diferite, în experimente efectuate cu ajutorul 280 nM Sfßgly și B) 85 nM Sfßgly., (cruce purpurie) 29°C; (cerc albastru) 33°C; (diamant albastru) 37°C; (pătrat roșu) 42°C; (triunghi verde) 46°C. inserțiile arată graficul optim de temperatură pentru testele de 20 de minute la fiecare concentrație a enzimei. Comparația parcelelor inserate ilustrează schimbarea optimă a temperaturii datorată diluării enzimelor. Acest set complet de date (activitățile relative medii și abaterile respective) este prezentat în tabelul s2.

În concluzie, temperatura optimă s-a modificat odată cu Modificarea timpului de testare și a concentrației enzimei., Astfel, nu este un parametru care reflectă o proprietate intrinsecă a enzimei, ci este o simplă consecință a condițiilor de testare.baza moleculară a modificărilor observate ale activității relative și temperaturii optime se bazează pe faptul că populația de enzime nu este la echilibru termodinamic în „procedura clasică” pentru estimarea temperaturii optime. Pe scurt, la temperaturi apropiate și peste temperatura de topire a enzimei (Tm), concentrația activă a enzimei scade continuu pe parcursul testului datorită denaturării termice a proteinei., Rata de denaturare a proteinelor este mult mai mică sub Tm, astfel încât concentrația enzimei active nu se modifică în acest interval de temperatură. În plus, cu cât temperatura este mai mare, cu atât este mai mare fracțiunea populației de substrat care atinge starea de tranziție, ceea ce crește rata de reacție. Aceste tendințe sunt simultane pe parcursul testului activității enzimatice., Astfel, la temperaturi care permit scăderea activității enzimatice cauzată de denaturarea proteinelor pentru a depăși creșterea vitezei de reacție cauzată de temperatură, activitatea enzimatică detectată scade în cursul testului. În schimb, la temperaturi la care nu are loc denaturarea proteinelor, activitatea detectată nu se schimbă în funcție de timp. Din acest motiv, datele relative de activitate se schimbă în timpul testului, iar temperatura optimă se deplasează spre valori mai mici.,

dovada acestui echilibru de schimbare este că scăderi mai marcate ale activității relative au fost observate în experimentele efectuate la 42 și 46 °C (Fig 1A), care au fost cele mai apropiate temperaturi de Tm pentru Sfßgly (45 °C ). Mai mult, cu cât concentrația Sfßgly este mai mică, cu atât este mai scurt timpul necesar la 42 °C pentru denaturarea termică pentru a reduce populația de enzime active la o fracție inferioară celei prezente la 37 °C, la care Sfßgly este stabilă., În fapt, cu 280 nM Sfßgly, a durat 70 de min la 42 °C pentru a reduce enzimă activă de concentrare de la un nivel la care activitatea relativă a fost mai mică decât la 37 °C (Fig. 2A), întrucât acest punct de comutare a avut loc la 40 de min cu 140 nM Sfßgly (Fig 1A). În cele din urmă, cu cea mai mică concentrație de proteină utilizată (85 nM), datele privind activitatea relativă pentru 42 și 37 °C au schimbat deja pozițiile la 10 min (Fig 2B).,

Pentru a determina mecanismul de temperatura optimă variantă propusă mai sus, am repetat același experimente cu un termofile β-glucozidaza, bglTm, din Thermatoga maritima, care are un Tm de peste 95 °C , mult mai mare decât 46 °C. Astfel, bglTm este stabilă în intervalul de temperatură utilizate în experimente, și, în consecință, populația activă enzimă nu se schimbă în timpul testului. Deplasările de echilibru în funcție de temperatura testului și enzima Tm nu se aplică aici și, așa cum era de așteptat, datele privind activitatea relativă (Fig 3A) nu au schimbat pozițiile în timp., Mai mult, „graficul optim de temperatură” arată o linie în continuă creștere, care a rezultat exclusiv din efectul temperaturii asupra probabilității ca substratul să atingă starea de tranziție. Acest complot nu depinde de timpul de testare (Fig 3B).