Resultater og diskusjon
for Å vise at den optimale enzym temperaturen avhenger av analysen forhold, β-glucosidase Sfßgly ble sendt til den «klassiske» prosedyre for optimal temperatur besluttsomhet, dvs., sin aktivitet ble bestemt ved forskjellige temperaturer (29 46 °C) ved hjelp av det samme enzymet konsentrasjon., Deretter, Sfßgly aktivitet i løpet av en fast temperatur-analysen ble fastsatt ved hjelp av den første deriverte til bestemte punkter av produktet versus tid kurve (S2 Fig). Basert på disse resultatene, er den relative aktiviteten av Sfßgly ble beregnet til forskjellige tider (10 til 120 min), som gjorde det mulig for undersøkelse av hvordan den optimale temperaturen tomter utviklet seg i løpet av analysene av det samme enzymet (Fig 1).
A) Relative aktivitet av Sfßgly under analysene ved forskjellige temperaturer., (lilla kryss) 29°C; (blå sirkel) 33°C; (blue diamond) 37°C; (rød firkant) 42°C; (grønn trekant) 46°C. Vertikale stiplede linjer fremheve tre forskjellige analysen ganger (20, 60 og 120 min). Den relative aktiviteten på 42 og 37°C ved disse analysen ganger er presentert i de runde boksene, illustrerer forskyvning av optimale temperatur i hele analysen. B) Endringer i den optimale temperaturen som følge av endringer av enzymet analysen varighet. Den røde sirkelen og piler merke nedgang i enzymaktivitet ved 42°C, som var den optimale temperaturen i kortere analysen., Den blå sirkelen og pilen illustrerer økningen i den relative aktiviteten ved 37°C, som var den optimale temperaturen bare for lengre analysen ganger. Enzymet konsentrasjon var 140 nM. Dette er et komplett datasett (gjennomsnittlig relativ aktiviteter og respektive avvik) er presentert i Tabell S1.
En oversikt over Fig 1 viser at den relative posisjonen til aktiviteten data knyttet til hver temperaturen endres med analysen tid (Fig 1A). For eksempel, på 20 min, den høyeste relative aktivitet, dvs., optimal temperatur, ble observert ved 42 °C., I motsatt fall, på 60 min, optimal temperatur på 37 °C. Dermed optimal temperatur endret ved 5 °C ved å endre analysen lengde, mens de øvrige vilkårene (enzym og substrat konsentrasjoner og buffer) var konstant. Mer dramatisk, i 120 min analyse, og den relative aktiviteten ved 42 °C—tidligere optimal temperatur—falt til bare 50%. Derfor, plott av temperaturen effekt på den relative enzym aktivitet for ulike analysen varighet tydelig viser forskjellige former og maxima, dvs. optimale temperaturer, selv når det produsert fra samme enzymet (Fig 1B).,
Som en ytterligere demonstrasjon av at den optimale temperaturen er ikke en konstant parameter, eksperimentet beskrevet over ble gjentatt ved å ansette to forskjellige konsentrasjoner av Sfßgly (Fig 2). Det er klart at den relative plasseringen av aktiviteten data utviklet seg forskjellig i løpet av analysen for eksperimenter utført med 85 og 280 nM Sfßgly., Plott av temperaturen effekt på enzymet aktivitet forberedt med data fra 20-min-analyser indikerte at den optimale temperaturen for 280 nM Sfßgly var 42 °C (Fig 2A), mens den optimale temperaturen for denne samme enzymet på 85 nM var 37 °C (Fig 2B). Derfor, den optimale temperaturen var også påvirket av enzymet konsentrasjon.
A) Relative aktivitet av Sfßgly under analysene ved ulike temperaturer i eksperimenter utført ved hjelp 280 nM Sfßgly og B) 85 nM Sfßgly., (lilla kryss) 29°C; (blå sirkel) 33°C; (blue diamond) 37°C; (rød firkant) 42°C; (grønn trekant) 46°C. Setter vise optimal temperatur tomt for 20-min-analyser på hvert enzym konsentrasjon. Sammenligningen av de innsatte plottene illustrerer optimal temperatur skift på grunn av enzymet fortynning. Dette er et komplett datasett (gjennomsnittlig relativ aktiviteter og respektive avvik) er presentert i Tabell S2.
I konklusjonen, er de optimale temperaturen endres med endring av analysen tid og enzym konsentrasjon., Dermed, det er ikke en parameter som reflekterer en iboende enzym eiendom, men er i stedet en ren konsekvens av analysen forhold.
Den molekylære basis av observerte endringer i relative aktivitet og optimal temperatur er avhengig av det faktum at enzymet befolkningen er ikke på termodynamisk likevekt i den «klassiske prosedyre» for optimal temperatur estimering. Kort, ved temperaturer nær og over enzym smeltetemperaturen (Tm), den aktive enzymet konsentrasjon kontinuerlig reduseres i løpet av analysen på grunn av termisk denaturering av proteiner., Frekvensen av protein denaturering er mye lavere nedenfor Tm, slik at konsentrasjonen av det aktive enzymet ikke endres i dette temperaturområdet. I tillegg, jo høyere temperatur, jo større andel av underlaget befolkningen som når transition state, noe som øker reaksjonshastigheten. Disse trendene er samtidig i hele enzym aktivitet analysen., Dermed, ved temperaturer som gjør at nedgangen i enzymaktivitet forårsaket av protein denaturering å overvinne reaksjonshastigheten øker forårsaket av temperatur, oppdaget enzym aktivitet synker i løpet av analysen. I kontrast, ved temperaturer på som ingen protein denaturering skjer, oppdaget aktivitet ikke endres som en funksjon av tiden. Av denne grunn, den relative aktiviteten data endres i løpet av analysen, og optimal temperatur skift mot lavere verdier.,
Bevis på dette skiftende balanse er at mer markert nedgang i relativ aktivitet ble observert i forsøkene utført på 42 og 46 °C (Fig 1A), som var den nærmeste temperaturer til Tm for Sfßgly (45 °C ). Videre, jo lavere Sfßgly konsentrasjon, jo kortere tid som er nødvendig på 42 °C for termisk denaturering å redusere den aktive enzymet befolkningen til en brøkdel dårligere til stede ved 37 °C, som Sfßgly er stabil., Faktisk, med 280 nM Sfßgly, det tok 70 min ved 42 °C for å redusere den aktive enzymet konsentrasjon til et nivå der den relative aktiviteten var lavere enn ved 37 °C (Fig 2A), mens dette slår punkt skjedde på 40 min med 140 nM Sfßgly (Fig 1A). Til slutt, med den laveste protein konsentrasjon som brukes (85 nM), den relative aktiviteten data for 42 og 37 °C allerede hadde byttet posisjoner på 10 min (Fig 2B).,
for Å finne ut mekanismen av optimal temperatur variasjon foreslått ovenfor, vil vi gjentok det samme eksperimenter med en thermophilic β-glucosidase, bglTm, fra Thermatoga maritima, som har en Tm over 95 °C , langt høyere enn 46 °C. Dermed bglTm er stabil i temperaturområdet ansatt i eksperimenter, og følgelig populasjonen av aktive enzymet ikke endres i løpet av analysen. Balansen forskyvninger som en funksjon av analysen temperatur og enzym Tm gjelder ikke her, og som forventet, er den relative aktiviteten data (Fig 3A) ikke bytte posisjoner over tid., Videre er «optimal temperatur tomt» viser en stadig økende linje, noe som resulterte utelukkende fra temperaturen effekt på sannsynligheten for at underlaget nådd overgangen staten. Denne tomten var ikke avhengig analysen tid (Fig 3B).
A) Relative aktivitet av bglTm hele analysen ved forskjellige temperaturer. (lilla kryss) 29°C; (blå sirkel) 33°C; (blue diamond) 37°C; (rød firkant) 42°C; (grønn trekant) 46°C. B) Effekt av analysen tid på den relative aktiviteten., Enzymet konsentrasjon var 7,5 nM. Dette er et komplett datasett (gjennomsnittlig relativ aktiviteter og respektive avvik) er presentert i Tabell S3.
Derfor, den klassiske bell-formede kurver av «optimal temperatur tomter» er observert bare hvis enzymet denatures under aktivitet analysen. Dermed kan man stille spørsmål ved om det er tilrådelig å kalle det høyeste punktet av disse tomter «optimal temperatur».
Disse bemerkninger strekker seg utover et teknisk problem., Utnyttelse av «optimal temperatur» for enzymet karakterisering kan resultere i feil kinetisk parametre (Km, Ki og kcat) på grunn av tilstedeværelsen av denaturert protein i prøver i løpet av første rate bestemmelser. Viktigere, vurderer sin avhengighet av analysen forhold, vedtakelsen av «optimal temperatur» bestemmes under benken vilkår for stor-skala bruker, som markert skiller seg i analysen varighet og enzym konsentrasjon, kan resultere i avtagende reaksjon priser, lavere produktet avkastning og økonomisk tap.