結果と議論
最適酵素温度がアッセイ条件に依存することを実証するために、β-グルコシダーゼSfβglyは、最適温度決定のための”古典的な”手順に提出された、すなわち、その活性は、同じ酵素濃度を用いて異なる温度（29-46℃）で決定された。, 次いで、固定温度アッセイの過程におけるSfβgly活性を、生成物対時間曲線の特定の点における一次導関数を用いて決定した（S2図）。 これらの結果に基づいて、Sfβglyの相対活性を異なる時間（10-120分）で計算し、同じ酵素のアッセイ中に最適温度プロットがどのように進化したかを調べることが可能になった（図1）。
図1の概要は、各温度に関連する活性データの相対位置がアッセイ時間とともに変化することを明らかにする（図1A）。 例えば、20分で、最も高い相対活性、すなわち最適温度が42℃で観察された。, 逆に、60分では、最適温度は37℃であったため、最適温度はアッセイ長を変更することによって5℃変化し、残りの条件（酵素および基質濃度および緩衝液） より劇的に、120分の試金で、42°Cの相対的な活動-前の最適温度—50%だけに落ちました。 したがって、異なるアッセイ期間に対する相対酵素活性に対する温度効果のプロットは、同じ酵素から産生された場合であっても、異なる形状および最大、すなわち最適温度を明確に示す（図1B）。,
最適温度が一定のパラメータではないという追加の実証として、Sfβglyの二つの異なる濃度を用いて上記の実験を繰り返した（図2）。 活性データの相対的な位置付けは、85および280nM Sfβglyで行われた実験のためのアッセイの過程で異なって進化したことは明らかである。, 20分アッセイからのデータを用いて調製した酵素活性に対する温度効果のプロットは、280nM Sfβglyの最適温度が42℃（図2A）であったのに対し、85nMでこの同じ酵素の最適温度は37℃（図2B）であったことを示した。 したがって，最適温度は酵素濃度によっても影響された。
a)280nM SfβglyおよびB)85nM Sfβglyを用いて行われた実験における異なる温度でのアッセイ中のSfβglyの相対活性。, （紫色の十字）29°C;（青い円）33°C;（青いダイヤモンド）37°C;（赤い正方形）42°C;（緑の三角形）46°C.挿入物は各酵素濃度で20分の試金のための最適温度のプロ 挿入されたプロットの比較は、酵素希釈による最適温度シフトを示している。 この完全なデータセット（平均相対活動とそれぞれの偏差）がS2テーブルに表示されます。結論として、最適温度は、アッセイ時間と酵素濃度の変更とともに変化した。, したがって、それは固有の酵素特性を反映するパラメータではなく、代わりにアッセイ条件の単なる結果である。
観察された相対活性および最適温度の修飾の分子基礎は、最適温度推定のための”古典的な手順”において酵素集団が熱力学的平衡にないという 簡単に言えば、酵素融解温度（Ｔｍ）に近い温度およびそれ以上の温度では、活性酵素濃度は、タンパク質の熱変性によるアッセイの過程で連続的に減少する。, タンパク質変性の速度はTmよりもはるかに低いので、活性酵素の濃度はこの温度範囲で変化しない。 さらに、温度が高いほど、遷移状態に達する基質ポピュレーションの割合が大きくなり、反応速度が増加する。 これらの傾向は酵素活性の試金中同時である。, したがって、タンパク質変性によって引き起こされる酵素活性の低下が温度によって引き起こされる反応速度上昇を克服することを可能にする 対照的に、タンパク質変性が起こらない温度では、検出された活性は時間の関数として変化しない。 このため、相対活性データはアッセイ中に変化し、最適温度はより低い値に向かってシフトする。,
このシフトバランスの証拠は、42および46℃（図1A）で行われた実験では、Sfβgly（45℃）のTmに最も近い温度であった相対活性のより顕著な減少が観察されたこ さらに、Sfβgly濃度が低いほど、熱変性のために42℃で必要な時間が短くなり、Sfβglyが安定である37℃で存在するものよりも劣る画分に活性酵素集団を減少させ, 実際、280nM Sfβglyでは、活性酵素濃度を70℃で42分かかり、37℃での相対活性よりも低いレベルに低下させた（図2A）のに対し、このスイッチングポイントは40分で140nM Sfβglyで起こった（図1A）。 最後に、最も低いタンパク質濃度（85nM）を使用して、42および37℃の相対活性データは、すでに10分で位置を交換していた（図2B）。,
上記で提案された最適温度変化のメカニズムを決定するために、我々は95℃以上のTmを有するThermatoga maritimaから好熱性β-グルコシダーゼ、bglTmを用いて同じ実験を繰り返し、46℃よりもはるかに高い。 アッセイ温度および酵素Tmの関数としてのバランス変位はここでは適用されず、予想されるように、相対活性データ（図3A）は時間の経過とともに位置, さらに，”最適温度プロット”は連続的に増加する線を示し，これは基板が遷移状態に達する確率に対する温度効果からのみ生じた。 このプロットは、アッセイ時間に依存しなかった（図3B）。
A)異なる温度でのアッセイを通じたbglTmの相対活性。 （紫色の十字）29°C;（青い円）33°C;（青いダイヤモンド）37°C;（赤い正方形）42°C;（緑の三角形）46°C B）相対活性に対するアッセイ時間の効果。, 酵素濃度は7.5nMであった。 この完全なデータセット（平均相対活動とそれぞれの偏差）がS3テーブルに表示されます。
したがって、”最適温度プロット”の古典的な鐘形曲線は、活性アッセイ中に酵素が変性する場合にのみ観察される。 したがって、これらのプロットの最高点を”最適温度”と呼ぶことが望ましいかどうか疑問に思うことができます。
これらの発言は、技術的な問題を超えて拡張します。, 酵素特性評価のための”最適温度”の利用は，初期速度決定中の試料中の変性タンパク質の存在による誤った速度論的パラメータ（Ｋｍ，Ｋｉおよびｋｃａｔ）をもたらす可能性がある。 重要なことは、アッセイ条件への依存を考慮すると、アッセイ期間と酵素濃度が著しく異なる大規模な使用のためのベンチ条件下で決定される”最