Tulokset ja keskustelu
osoittaa, että optimaalinen entsyymi lämpötila riippuu testin ehtoja, β-glukosidaasin Sfßgly toimitettiin ”klassinen” menettelyä optimaalinen lämpötila määrittäminen, eli sen toiminta oli määritetty eri lämpötiloissa (29 46 °C) käyttäen saman entsyymin pitoisuus., Sitten, Sfßgly toiminnan aikana kiinteä lämpötila-pitoisuus määritettiin käyttäen ensimmäinen derivaatta erityisiä kohtia tuote vs. aika-käyrän (S2 Kuva). Näiden tulosten perusteella suhteellinen aktiivisuus Sfßgly laskettiin eri kertaa (10-120 min), joka mahdollisti sen tarkastelun, miten optimaalinen lämpötila tontteja kehittynyt aikana kokeissa sama entsyymi (Kuva 1).
a) Sfßglyn suhteellinen aktiivisuus määritysten aikana eri lämpötiloissa., (violetti risti) 29°C; (sininen ympyrä) 33°C; (blue diamond) 37°C: ssa; (punainen neliö) 42°C; (vihreä kolmio) 46°C. Pystysuora katkoviivat esiin kolme eri määritystä kertaa (20, 60 ja 120 min). Suhteellinen aktiivisuus 42 ja 37°C: n lämpötilassa nämä assay aikoina on esitetty pyöristetyt laatikot, jotka kuvaavat vaihto-optimaalinen lämpötila koko testin. B) entsyymimäärityksen keston muutoksista johtuvat optimilämpötilan muutokset. Punainen ympyrä ja nuolet korostavat entsyymin aktiivisuuden laskua 42°C: ssa, mikä oli lyhyemmässä määrityksessä optimaalinen lämpötila., Sininen ympyrä ja nuoli havainnollistaa kasvu suhteellinen aktiivisuus 37°C, joka oli optimaalinen lämpötila vain enää assay kertaa. Entsyymipitoisuus oli 140 nM. Tämä täydellinen tietokokonaisuus (keskimääräiset suhteelliset toiminnot ja vastaavat poikkeamat) esitetään S1-taulukossa.
yleiskatsaus Kuva 1 osoittaa, että suhteellinen asema aktiivisuus tiedot liittyvät kunkin lämpötilan muutokset assay aikaa (Kuva 1A). Esimerkiksi 20 minuutin kohdalla Korkein suhteellinen aktiivisuus eli optimaalinen lämpötila havaittiin 42 °C: ssa., Päinvastoin, 60 min, optimaalinen lämpötila oli 37 °C. Näin ollen, optimaalinen lämpötila on muuttunut 5 °C muuttamalla pitoisuus pituus, kun taas loput ehtoja (entsyymi ja substraatti pitoisuudet ja buffer) olivat vakiona. Lisää dramaattisesti, 120 min pitoisuus, suhteellinen aktiivisuus 42 °C—entinen optimaalinen lämpötila—laski vain 50%. Siksi, tontit lämpötilan vaikutus suhteellisen entsyymin aktiivisuus eri assay kestot osoittavat selvästi eri muotoja ja maksimit, eli optimaalinen lämpötiloissa, jopa silloin, kun tuotetaan sama entsyymi (Kuva 1B).,
ylimääräisenä osoitus siitä, että optimaalinen lämpötila ei ole vakio parametri, kokeilla edellä on kuvattu toistettiin käyttämällä kahta eri pitoisuuksia Sfßgly (Kuva 2). On selvää, että suhteellinen paikannus toiminnan tietojen kehittynyt eri tavalla aikana määrityksen kokeilut, 85 ja 280 nM Sfßgly., Tontit lämpötilan vaikutus entsyymin aktiivisuus valmistettu tietoja 20-min analyysit osoittivat, että optimaalinen lämpötila 280 nM Sfßgly oli 42 °C (Kuva 2A), kun taas optimaalinen lämpötila tämä sama entsyymi 85 nM oli 37 °C: ssa (Kuva 2B). Siksi myös entsyymipitoisuus vaikutti optimilämpötilaan.
A) Suhteellinen aktiivisuus Sfßgly aikana määrityksiä eri lämpötiloissa kokeet suoritetaan käyttämällä 280 nM Sfßgly ja B) 85 nM Sfßgly., (violetti risti) 29°C; (sininen ympyrä) 33°C; (blue diamond) 37°C: ssa; (punainen neliö) 42°C; (vihreä kolmio) 46°C. Lisää näytä optimaalinen lämpötila tontti 20 min määritykset jokaisen entsyymin pitoisuus. Lisättyjen palstojen vertailu havainnollistaa entsyymilaimennuksesta johtuvaa optimaalista lämpötilanmuutosta. Tämä täydellinen tietokokonaisuus (keskimääräiset suhteelliset toiminnot ja vastaavat poikkeamat) esitetään S2-taulukossa.
lopuksi, optimaalinen lämpötila muuttui muuttaminen testin ajan ja entsyymin pitoisuus., Näin, se ei ole parametri, joka heijastaa luontainen entsyymi omaisuutta, mutta on sen sijaan pelkkä seuraus assay ehtoja.
molekyyli perusteella havaittu muutoksia suhteellinen aktiivisuus ja optimaalinen lämpötila perustuu siihen, että entsyymi väestöstä ei ole termodynaaminen tasapaino ”klassinen menettely” optimaalinen lämpötila arvio. Lyhyesti, lämpötilassa, joka on lähellä ja ennen entsyymi sulamislämpötila (Tm), aktiivisen entsyymin pitoisuus jatkuvasti pienenee ajan kuluessa testin, koska lämpö proteiinin denaturoitumista., Määrä proteiinia denaturointi on paljon pienempi alle Tm, joten pitoisuus aktiivinen entsyymi ei muuta tällä lämpötila-alueella. Lisäksi, mitä korkeampi lämpötila, sitä suurempi osa alustan väestö, joka saavuttaa siirtyminen valtion, mikä lisää reaktionopeutta. Nämä suuntaukset ovat samanaikaisia koko entsyymiaktiivisuusmäärityksen ajan., Näin ollen lämpötiloissa, jotka mahdollistavat proteiinin denaturaation aiheuttaman entsyymiaktiivisuuden vähenemisen lämpötilan aiheuttaman reaktionopeuden nousun voittamiseksi, havaittu entsyymiaktiivisuus laskee määrityksen aikana. Sen sijaan lämpötiloissa, joissa ei tapahdu proteiinin denaturaatiota, havaittu aktiivisuus ei muutu ajan funktiona. Tästä syystä suhteellinen aktiivisuus tietoa muutoksen aikana määritys, ja optimaalinen lämpötila siirtyy kohti pienempiä arvoja.,
Todisteet tästä ovat siirtymässä tasapaino on, että enemmän on merkitty vähenee suhteellisesti toimintaa havaittiin kokeilut, 42 ja 46 °C (Kuva 1A), jotka olivat lähinnä lämpötilojen Tm Sfßgly (45 °C ). Lisäksi alempi Sfßgly pitoisuus on, sitä lyhyempi aika tarvitaan 42 °C lämpödenaturaatiota vähentää aktiivista entsyymiä väestön murto huonompi, että läsnä 37 °C: ssa, jossa Sfßgly on vakaa., Itse asiassa, 280 nM Sfßgly, kesti 70 min 42 °C vähentää aktiivisen entsyymin pitoisuus tasolle, jolla suhteellinen aktiivisuus oli pienempi kuin 37 °C (Kuva 2A), kun taas tämä kytkentä vaiheessa tapahtui 40 min 140 nM Sfßgly (Kuva 1A). Kun käytettiin pienintä valkuaispitoisuutta (85 nM), suhteellista aktiivisuutta koskevat tiedot 42 ja 37 °C: ssa olivat vaihtaneet positioita jo 10 minuutin kohdalla (Kuva 2b).,
määrittää mekanismi optimaalisen lämpötilan vaihtelu edellä on ehdotettu, me toistetaan sama kokeiluja termofiilinen β-glukosidaasin, bglTm, mistä Thermatoga maritima, joka on Tm ylittää 95 °C , paljon suurempi kuin 46 °C. Näin ollen bglTm on vakaa lämpötila-alueella työskentelee kokeiluja, ja näin ollen väestön aktiivinen entsyymi ei muutu aikana määritys. Tasapaino siirtymien funktiona määritys lämpötila ja entsyymin Tm ei sovelleta täällä, ja kuten lämpötila, suhteellinen aktiivisuus tiedot (Kuva 3A) ei asennot ajan., Lisäksi ”optimaalinen lämpötila juoni” näyttää jatkuvasti kasvava linja, joka johti yksinomaan lämpötilan vaikutus todennäköisyys, että alustan saavuttanut siirtyminen valtion. Tämä juoni ei riippunut määritysajasta (kuva 3b).
a) Bgltm: n suhteellinen aktiivisuus koko määrityksen ajan eri lämpötiloissa. (violetti risti) 29°C; (sininen ympyrä) 33°C; (blue diamond) 37°C: ssa; (punainen neliö) 42°C; (vihreä kolmio) 46°C. B) Vaikutus assay aikaa suhteellinen aktiivisuus., Entsyymipitoisuus oli 7,5 nM. Tämä täydellinen tietokokonaisuus (keskimääräiset suhteelliset toiminnot ja vastaavat poikkeamat) esitetään S3-taulukossa.
näin Ollen, klassinen bell-muotoinen käyrät ”optimaalinen lämpötila tontteja” on havaittu vain, jos entsyymi denatures toiminnan aikana määritys. Näin ollen voidaan kyseenalaistaa, onko suositeltavaa nimittää näiden palstojen korkein kohta ”optimilämpötilaksi”.
nämä huomautukset ulottuvat teknisen kysymyksen ulkopuolelle., Hyödyntäminen ”optimaalinen lämpötila” entsyymi luonnehdinta voi johtaa virheellinen kineettiset parametrit (Km, Ki ja kcat), koska läsnäolo denaturoitu proteiini näytteitä alkuvaiheessa korko määritykset. Tärkeintä, ottaen huomioon sen riippuvuus assay ehtoja, hyväksymistä ”optimaalinen lämpötila” määritetään alla penkki edellytykset laajamittainen käyttö, jotka selvästi eroavat assay kesto ja entsyymin pitoisuus, voi aiheuttaa vähentää reaktio hinnat, alempi tuotteen tuotot ja taloudellisia menetyksiä.