Resultater og diskussion
for At vise, at den optimale enzym temperatur afhænger af analysens betingelser, β-glucosidase Sfßgly blev indgivet til den “klassiske” procedure for optimal temperatur bestemmelse, dvs, dens aktivitet blev bestemt ved forskellige temperaturer (29 til 46 °C) ved hjælp af det samme enzym fusion., Derefter blev Sfggly-aktiviteten i løbet af en fast temperaturanalyse bestemt under anvendelse af det første derivat på specifikke punkter af produktet versus tidskurven (S2 Fig). Baseret på disse resultater blev den relative aktivitet af Sfggly beregnet på forskellige tidspunkter (10 til 120 min), hvilket muliggjorde undersøgelsen af, hvordan de optimale temperaturpartier udviklede sig under assays af det samme en .ym (Fig 1).
A) relativ aktivitet af Sfggly under assays ved forskellige temperaturer., (lilla korset) 29°C; (blå cirkel) 33°C (diamant) 37°C; (rød firkant) 42°C; (grøn trekant) 46°C. Lodrette stiplede linjer fremhæve tre forskellige analysen gange (20, 60 og 120 min). Den relative aktivitet ved 42 og 37 C C ved disse assaytider præsenteres i de afrundede kasser, der illustrerer forskydningen af den optimale temperatur gennem hele assayet. B) ændringer i den optimale temperatur som følge af modifikationer af en .ymassayets varighed. Den røde cirkel og pile fremhæver faldet i en .ymaktiviteten ved 42.C, hvilket var den optimale temperatur i det kortere assay., Den blå cirkel og pil illustrerer stigningen i den relative aktivitet ved 37.C, hvilket kun var den optimale temperatur i længere assaytider. En .ymkoncentrationen var 140 nM. Dette komplette datasæt (gennemsnitlige relative aktiviteter og respektive afvigelser) præsenteres på S1-tabellen.
en oversigt over Fig 1 viser, at den relative position af aktivitetsdataene, der er forbundet med hver temperatur, ændres med assaytid (Fig 1A). For eksempel ved 20 min blev den højeste relative aktivitet, dvs. den optimale temperatur, observeret ved 42 C. C., Omvendt var den optimale temperatur ved 60 minutter 37 C. C. således ændrede den optimale temperatur sig med 5.C ved at modificere assaylængden, medens de resterende betingelser (en .ym-og substratkoncentrationer og buffer) var konstante. Mere dramatisk faldt den relative aktivitet ved 42.C-den tidligere optimale temperatur—i 120—Min-analysen til kun 50%. Derfor viser plots af temperatureffekten på den relative en .ymaktivitet for forskellige assayvarigheder tydeligt forskellige former og maksima, dvs.optimale temperaturer, selv når de produceres fra det samme en .ym (Fig 1B).,
som en yderligere demonstration af, at den optimale temperatur ikke er en konstant parameter, blev eksperimentet beskrevet ovenfor gentaget ved at anvende to forskellige koncentrationer af Sfggly (Fig 2). Det er klart, at den relative positionering af aktivitetsdataene udviklede sig forskelligt i løbet af assayet for forsøgene udført med 85 og 280 nM Sfggly., Afbildninger af temperatur effekt på enzymaktiviteten udarbejdet med data fra 20-min-analyser viste, at den optimale temperatur for 280 nM Sfßgly var 42 °C (Fig 2A), der henviser til, at den optimale temperatur for det samme enzym, der er på 85 nM var 37 °C (Figur 2B). Derfor blev den optimale temperatur også påvirket af en .ymkoncentrationen.
A) relativ aktivitet af Sfggly under analyserne ved forskellige temperaturer i forsøg udført under anvendelse af 280 nM SF .gly og B) 85 nM SF .gly., (lilla korset) 29°C; (blå cirkel) 33°C (diamant) 37°C; (rød firkant) 42°C; (grøn trekant) 46°C. Skær vis den optimale temperatur plot for 20-min-analyser og ved hvert enzym fusion. Sammenligning af de indsatte plots illustrerer det optimale temperaturskift på grund af en .ymfortynding. Dette komplette datasæt (gennemsnitlige relative aktiviteter og respektive afvigelser) præsenteres på S2-tabellen.
Som konklusion ændrede den optimale temperatur med modifikation af assaytiden og en .ymkoncentrationen., Det er således ikke en parameter, der afspejler en iboende en .ymegenskab, men er i stedet en ren konsekvens af assaybetingelserne.
det molekylære grundlag for de observerede modifikationer af relativ aktivitet og optimal temperatur er afhængig af det faktum, at en .ympopulationen ikke er i termodynamisk ligevægt i den “klassiske procedure” for optimal temperaturestimering. Kort sagt, ved temperaturer tæt på og over en .ymets smeltetemperatur (Tm), falder den aktive en .ymkoncentration kontinuerligt i løbet af analysen på grund af termisk denaturering af proteinet., Hastigheden af protein denaturering er meget lavere under Tm, så koncentrationen af det aktive en .ym ændres ikke i dette temperaturområde. Desuden jo højere temperaturen er, desto større er fraktionen af substratpopulationen, der når overgangstilstanden, hvilket øger reaktionshastigheden. Disse tendenser er samtidige i hele en .ymaktivitetsassayet., Ved temperaturer, der tillader faldet i en .ymaktivitet forårsaget af protein denaturering for at overvinde reaktionshastighedsforøgelsen forårsaget af temperatur, falder den detekterede en .ymaktivitet i løbet af assayet. I modsætning hertil ændres den detekterede aktivitet ved temperaturer, hvor der ikke forekommer protein denaturering, ikke som en funktion af tiden. Af denne grund ændres de relative aktivitetsdata under analysen, og den optimale temperatur skifter mod lavere værdier.,
bevis for denne skiftende balance er, at der blev observeret mere markante fald i relativ aktivitet i forsøgene udført ved 42 og 46.c (Fig 1A), som var de tætteste temperaturer til TM for Sfggly (45. C). Desuden, jo lavere Sfßgly koncentration, jo kortere tid, der kræves ved 42 °C til termisk denaturering at reducere det aktive enzym befolkningen til en brøkdel ringere end der er til stede ved 37 °C, hvor Sfßgly er stabil., I virkeligheden, med 280 nM Sfßgly, det tog 70 min ved 42 °C for at reducere aktive enzym fusion til et niveau, hvor den relative aktivitet var lavere end ved 37 °C (Fig 2A), der henviser til, at dette skift sted på 40 min med 140 nM Sfßgly (Figur 1A). Endelig, med den laveste anvendte proteinkoncentration (85 nM), havde de relative aktivitetsdata for 42 og 37.C allerede udvekslet positioner ved 10 min (Fig 2B).,
for At bestemme den mekanisme af den optimale temperatur variation er foreslået ovenfor, gentager vi den samme forsøg med en termofil β-glucosidase, bglTm, fra Thermatoga maritima, som har en Tm over 95 °C , hvilket er langt højere end 46 °C. Således, bglTm er stabil i det temperaturområde, der er ansat i forsøgene, og derfor populationen af aktive enzym ikke ændrer sig i løbet af analysen. Balanceforskydningerne som funktion af analysetemperatur og en .ym Tm gælder ikke her, og som forventet skiftede de relative aktivitetsdata (Fig 3A) ikke positioner over tid., Desuden viser “optimum temperature plot” en kontinuerligt stigende linje, som udelukkende skyldtes temperatureffekten på sandsynligheden for, at substratet nåede overgangstilstanden. Dette plot var ikke afhængigt af assaytiden (Fig 3B).
a) relativ aktivitet af bglTm under hele assayet ved forskellige temperaturer. (lilla Kors) 29; C; (blå cirkel) 33.C; (blå diamant) 37. C; (rød firkant) 42. C; (grøn trekant) 46. C. B) effekt af assay tid på den relative aktivitet., En .ymkoncentrationen var 7,5 nM. Dette komplette datasæt (gennemsnitlige relative aktiviteter og respektive afvigelser) præsenteres på S3-tabellen.
derfor observeres de klassiske klokkeformede kurver af “optimale temperaturplotter” kun, hvis en .ymet denaturerer under aktivitetsassayet. Man kunne således stille spørgsmålstegn ved, om det er tilrådeligt at betegne det højeste punkt i disse plot den “optimale temperatur”.
disse bemærkninger strækker sig ud over et teknisk problem., Udnyttelse af den “optimale temperatur” til en .ymkarakterisering kan resultere i fejlagtige kinetiske parametre (Km, Ki og kcat) på grund af tilstedeværelsen af denatureret protein i prøverne under de indledende hastighedsbestemmelser. Vigtigere er det, i betragtning af dens afhængighed af analysen betingelser, vedtagelsen af den “optimale temperatur” bestemmes under bænken betingelser for large-scale bruger, der er markant anderledes, i analysen varighed og enzym fusion, kan resultere i faldende reaktion priser, lavere udbytter og finansielle tab.