Výsledky a diskuse
prokázat, že optimum enzymu teplota závisí na stanovení podmínek, β-glukosidázy Sfßgly byl předložen „klasický“ postup při optimální teplotě určení, tzn., jeho činnost byla stanovena při různých teplotách (29 až 46 °C) použití stejné koncentrace enzymu., Poté byla aktivita Sfßgly v průběhu testu s pevnou teplotou stanovena pomocí prvního derivátu ve specifických bodech křivky produktu versus čas (S2 Obr). Na základě těchto výsledků, relativní aktivity Sfßgly byla vypočtena v odlišné době (10 až 120 min), který umožnil zkoumání, jak optimální teplota pozemky se vyvinul během zkoušek téhož enzymu (Obr 1).
A) relativní aktivita Sfßgly během testů při různých teplotách., (fialový křížek) 29°C; (modrý kruh) 33°C; (blue diamond) 37°C; (rudé náměstí) 42°C (zelený trojúhelník) 46°C. Svislé přerušované čáry zvýraznit tři různé zkoušky krát (20, 60 a 120 min). Relativní aktivita při 42 a 37°C v těchto testovacích časech je uvedena v zaoblených krabicích, což ilustruje posun optimální teploty v průběhu testu. B) změny optimální teploty vyplývající z modifikací enzymatického testu. Červený kruh a šipky zdůrazňují pokles aktivity enzymu při 42°C, což byla optimální teplota v kratším testu., Modrý kruh a šipka ilustrují zvýšení relativní aktivity při 37°C, což byla optimální teplota pouze pro delší zkušební doby. Koncentrace enzymu byla 140 nM. Tento kompletní datový soubor (střední relativní aktivity a příslušné odchylky) je uveden v tabulce s1.
přehled obr 1 ukazuje, že relativní poloha údajů o aktivitě spojených s každou teplotou se mění s časem testu (obr. 1a). Například při 20 min byla pozorována nejvyšší relativní aktivita, tj. optimální teplota při 42 °C., Naopak, v 60 min, optimální teplota 37 °C. to Znamená, že optimální teplota změní o 5 °C úpravou test délky, zatímco zbývající podmínky (enzymu a substrátu, koncentrace a paměti) byly konstantní. Dramatičtěji, v testu 120-min, relativní aktivita při 42 °C—bývalá optimální teplota-klesla pouze na 50%. Proto, pozemky k vliv teploty na relativní enzymové aktivity pro různé trvání testu jasně ukazují, různých tvarů a maxima, tj. optimální teploty, i když se vyrábí ze stejného enzymu (Obr 1B).,
jako další důkaz, že optimální teplota není konstantním parametrem, byl výše popsaný experiment opakován použitím dvou různých koncentrací Sfßgly (obr. 2). Je zřejmé, že relativní polohování údaje o činnosti vyvíjel odlišně v průběhu testu pro experimenty prováděné s 85 a 280 nM Sfßgly., Pozemky k vliv teploty na aktivitu enzymu připraven s daty od 20-min testy ukázaly, že optimální teplota pro 280 nM Sfßgly bylo 42 °C (Obr 2A), vzhledem k tomu, že optimální teplota pro tento stejný enzym na 85 nM 37 °C (Obr 2B). Proto byla optimální teplota také ovlivněna koncentrací enzymu.
A) relativní aktivita Sfßgly během testů při různých teplotách v experimentech prováděných za použití 280 nM Sfßgly a B) 85 nM Sfßgly., (fialový kříž) 29°C; (modrý kruh) 33°C; (modrý diamant) 37°C; (červený čtverec) 42°C; (zelený trojúhelník) 46°C.vložky ukazují optimální teplotní graf pro 20-min testy při každé koncentraci enzymu. Srovnání vložených ploch ilustruje optimální teplotní posun způsobený ředěním enzymů. Tento kompletní datový soubor (střední relativní aktivity a příslušné odchylky) je uveden v tabulce s2.
Na závěr se optimální teplota změnila s modifikací doby testu a koncentrace enzymu., Nejedná se tedy o parametr, který odráží vlastnost vnitřního enzymu, ale je místo toho pouhým důsledkem testovacích podmínek.
molekulární základ pozorované změny relativní aktivity a optimální teplota se spoléhá na skutečnost, že enzym populace není v termodynamické rovnováze v „klasický postup“ pro optimální teplotu odhad. Stručně řečeno, při teplotách blízkých a nad teplotou tavení enzymu (Tm) se aktivní koncentrace enzymu v průběhu testu kontinuálně snižuje v důsledku tepelné denaturace proteinu., Rychlost denaturace bílkovin je mnohem nižší než Tm, takže koncentrace aktivního enzymu se v tomto teplotním rozmezí nemění. Navíc čím vyšší je teplota, tím větší je frakce populace substrátu, která dosahuje přechodového stavu, což zvyšuje reakční rychlost. Tyto trendy jsou současné v průběhu testu enzymové aktivity., Tedy, při teplotách, které umožňují snížení enzymové aktivity způsobené denaturaci bílkovin překonat rychlost reakce zvýšit způsobené teplotou, zjištěna aktivita enzymu klesá v průběhu testu. Naproti tomu při teplotách, při kterých nedochází k denaturaci bílkovin, se zjištěná aktivita nemění jako funkce času. Z tohoto důvodu se údaje o relativní aktivitě během testu mění a optimální teplota se posune směrem k nižším hodnotám.,
Důkaz tohoto posunu rovnováhy je, že výraznější pokles v relativní aktivitě byly pozorovány v experimentech prováděných na 42 a 46 °C (Obr. 1A), které byly nejblíže teploty Tm pro Sfßgly (45 °C ). Navíc, nižší Sfßgly koncentrace, tím kratší čas potřebný na 42 °C pro tepelné denaturace snížit aktivní enzym obyvatelstva na zlomek horší než ten dárek při 37 °C, při které Sfßgly je stabilní., Ve skutečnosti, s 280 nM Sfßgly, trvalo 70 min při 42 °C, aby se snížilo aktivní enzym koncentrace na úroveň, při které relativní aktivita byla nižší než při 37 °C (Obr 2A), vzhledem k tomu, že tento spínací bod došlo na 40 min s 140 nM Sfßgly (Obr 1A). Konečně, s NEJNIŽŠÍ použitou koncentrací bílkovin (85 nM), údaje o relativní aktivitě pro 42 a 37 °C již vyměnily pozice za 10 min (obr. 2b).,
určit mechanismus optimální teplota změna navrhovaná výše, jsme opakované stejné pokusy s termofilní β-glukosidázy, bglTm, z Thermatoga maritima, který má Tm nad 95 °C , což je mnohem vyšší než 46 °C. to Znamená, bglTm je stabilní v rozmezí teplot zaměstnaných v experimentech, a v důsledku toho, populace aktivní enzym nemá změnit během testu. Posun rovnováhy jako funkce testu teploty a enzymu TM zde neplatí, a jak se očekávalo, údaje o relativní aktivitě (obr. 3a)se v průběhu času nezměnily., Navíc „optimální teplotní graf“ ukazuje neustále se zvyšující linii, která vyplynula výhradně z teplotního účinku na pravděpodobnost, že substrát dosáhl přechodového stavu. Tento pozemek nezávisí na době testu (obr. 3B).
A) relativní aktivita bglTm v průběhu testu při různých teplotách. (fialový kříž) 29°C; (modrý kruh) 33°C; (modrý diamant) 37°C; (červený čtverec) 42°C; (zelený trojúhelník) 46°C.B) vliv času testu na relativní aktivitu., Koncentrace enzymu byla 7,5 nM. Tento kompletní datový soubor (střední relativní aktivity a příslušné odchylky) je uveden v tabulce S3.
proto jsou klasické zvonovité křivky „optimálních teplotních parcel“ pozorovány pouze v případě, že enzym denaturuje během testu aktivity. Dalo by se tedy zpochybnit, zda je vhodné označit nejvyšší bod těchto pozemků za „optimální teplotu“.
tyto poznámky přesahují technický problém., Využití „optimální teplotu“ pro charakterizace enzymu může mít za následek mylné kinetické parametry (Km, v, Ki a kcat) vzhledem k přítomnosti denaturovaného proteinu ve vzorcích během počáteční rychlost stanovení. Důležitější je, vzhledem k jeho závislosti na stanovení podmínek, přijetí „optimální teploty“ rozhodl pod lavice podmínky pro rozsáhlé použití, které se výrazně liší v testu trvání a koncentrace enzymu, může mít za následek snížení reakční rychlosti, nižší výtěžky produktu a finanční ztráty.