Bakterienstämme und Plasmide

In dieser Studie wurden die folgenden E. coli-Stämme verwendet: DH5a, BL21(DE3) (Novagen), CLM24 und Origami2(DE3) gmd::kan ΔwaaL. DH5a wurde zum Klonen und Reinigen von Plasmiden verwendet., BL21 (DE3) wurde zur Expression und Reinigung des scFv13-R4DQNAT-Akzeptorproteins verwendet, das in allen In vitro Glykosylierungsreaktionen verwendet wurde. CLM24 ist ein glykooptimiertes Derivat von W3110, das eine Deletion im Gen trägt, das für die WaaL-Ligase kodiert, wodurch die Akkumulation von vormontierten Glykanen auf Und-PP36 erleichtert wird. CLM24 wurde zur Reinigung des CjOST-Enzyms, zur organischen lösemittelbasierten Extraktion aller LLO sbearing-Bakterienglykane und zum Quellstamm zur Herstellung von Extrakten mit und ohne selektiv angereicherte Glykosylierungskomponenten verwendet., Origami2 (DE3) gmd::kan ΔwaaL wurde zur Herstellung von Man3GlcNAc2-tragenden LLOs verwendet und wurde durch sequentielle Mutation mit P1vir-Phagentransduktion unter Verwendung der jeweiligen Stämme aus der Keio-Collection62 als Spender erzeugt, die vom Coli Genetic Stock Center (CGSC) erhalten wurden. Kurz gesagt, Spenderlysat wurde aus Stamm JW3597-1 (ΔrfaL734::kan) erzeugt und der resultierende Phage wurde verwendet, um Origami2(DE3) – Zielzellen zu infizieren., Nach dem Plattieren von Transformanten auf LB-Platten, die Kanamycin (Kan) enthielten, wurden erfolgreiche Transduktanten ausgewählt und ihre Kan-Widerstandskassetten durch Transformieren mit temperaturempfindlichem Plasmid pCP2063 entfernt. Der resultierende Stamm, Origami2 (DE3) ΔwaaL, wurde dann für die nachfolgende Deletion des gmd-Gens nach einer identischen Strategie unter Verwendung des Spenderstammes JW2038-1 (Δgmd751::kan) verwendet.

Alle in der Studie verwendeten Plasmide sind in ergänzender Tabelle 2 aufgeführt. Plasmide, die in dieser Studie konstruiert wurden, wurden unter Verwendung von Standardklonprotokollen hergestellt und durch DNA-Sequenzierung bestätigt., Dazu gehörten die folgenden. Plasmid pJL1-scFv13-R4DQNAT wurde durch erste PCR-Amplifikation des für scFv13-R4DQNAT kodierenden Gens aus pET28a-scFv13-R4(N34L, N77L)DQNAT erzeugt, wobei die N34L-und N77L-Mutationen eingeführt wurden, um mutmaßliche interne Glykosylierungsstellen in scFv13-R452 zu eliminieren. Das resultierende PCR-Produkt wurde dann zwischen NcoI-und SalI-Restriktionsstellen in Plasmid pJL1, einem pET-basierten Vektor, der für CFPS49 verwendet wird, ligiert. Plasmid pJL1-sfGFP217-DQNAT wurde durch Ligieren eines kommerziell synthetisierten DNA-Fragments erzeugt, das sfGFP217-DQNAT (Integrated DNA Technologies) in pJL1 kodiert., Diese Version von sfGFP enthält eine zusätzliche GT-Einfügung nach K214, die diese flexible Schleife vor dem endgültigen Beta-Sheet64 erweitert. In diese flexible Schleife transplantierten wir unmittelbar nach T216 eine 21-Aminosäuresequenz, die die C. jejuni AcrA N123 Glykosylierungsstelle enthielt34, jedoch mit einer optimalen DQNAT-Sequon anstelle der nativen AcrA-Sequon. Ähnliche Verfahren wurden verwendet, um Plasmide pJL1-sfGFP217-AQNAT, pJL1-hEPO22-DQNAT-26, pJL1-hEPO36-DQNAT-40 und pJL1-hEPO81-DQNAT-85 zu erzeugen., Im Fall von pJL1-hEPO22-DQNAT-26 wurde das Gen für reifes menschliches EPO so konstruiert, dass das native Sequon bei N24 von 22-AENIT-26 in ein optimales bakterielles Sequon, DQNAT, geändert wurde. Identische Klonstrategien wurden durchgeführt, um anstelle der nativen hEPO-Sequonen 36-NENIT-40 und 81-LVNSS-85 optimale DQNAT-Motive separat einzuführen. Die rekombinante Expression des E. coli O9-Primeradapterglykans (Man3GlcNAc) auf Und-PP wurde durch Klonen der Gene erreicht, die für die WbdB-und WbdC-Mannosyltransferase-Enzyme aus E codieren., coli ATCC31616 für die montage der glykan, und RfbK und RfbM, auch abgeleitet von E. coli ATCC31616 für die erhöhung der pool der verfügbaren GDP-mannose, in E. coli MG1655. Plasmid pConYCGmCB wurde durch isotherme Dna-Baugruppe konstruiert und kodiert ein künstliches Operon, bestehend aus: (i) den Hefeglykosyltransferasen Alg13, Alg14, Alg1 und Alg2 für Man3GlcNAc2 Glycan-Biosynthese12 und (ii) den E. coli-Enzymen Phosphomannomutase (ManB) und Mannose-1-Phosphat Guanyltransferase (ManC), die zusammen die Verfügbarkeit von GDP-Mannose-Substraten für die Alg1-und Alg2-Enzyme erhöhen.,

Proteinexpression und-reinigung

Die Reinigung von CjPglB erfolgte nach einem zuvor beschriebenen Protokoll34. Kurz, eine Kolonie von E. coli CLM24 tragen plasmid pSN1865 angebaut wurde über Nacht bei 37 °C in 50 mL Luria-Bertani (LB; 10 g L−1 tryptone, 5 g L−1 Hefeextrakt, 5 g L−1 NaCl, pH 7,2), ergänzt mit ampicillin (Amp) und 0,2% (w/v%) d-glucose. Über Nacht wurden die Zellen in 1 L frische grandiose Brühe subkultiviert (TB; 12 g L−1 Trypton, 24 g L−1 Hefeextrakt, 0,4% (v/v%) Glycerin, 10% (v/v%) 0,17 M KH2PO4/0.,72 M K2HPO4 Phosphatpuffer), ergänzt mit Amp und gewachsen, bis die Absorption bei 600 nm (Abs600) einen Wert von ~0,7 erreichte. Die Inkubationstemperatur wurde auf 16 °C eingestellt, wonach die Proteinexpression durch Zugabe von l-Arabinose auf eine Endkonzentration von 0,02% (w/v%) induziert wurde. Die Proteinexpression konnte 20 h bei 16 °C fortgesetzt werden.Die Zellen wurden durch Zentrifugation geerntet und anschließend mit einem Homogenisator (Avestin C5 EmulsiFlex) gestört. Das Lysat wurde zentrifugiert, um Zellreste zu entfernen, und der Überstand wurde für 2 h bei 4 °C ultrazentrifugiert (100.000×g)., Das resultierende Pellet, das die Membranfraktion enthielt, wurde vollständig mit einem Potter-Elvehjem-Gewebehomogenisator in einem Puffer resuspendiert, der 50 mm HEPES, 250 mM NaCl, 10% (v/v%) Glycerin und 1% (w/v%) n-Dodecyl-β-d-Maltosid (DDM) bei pH 7,5 enthielt. Die Suspension wurde 1 h bei Raumtemperatur inkubiert, um die Waschmittellöslichkeit von CjPglB aus nativen E. coli-Lipiden zu erleichtern, die durch anschließende Ultrazentrifugation (100.000×g) für 1 h bei 4 °C entfernt wurden., Der Überstand, der DDM-solubilisiertes CjPglB enthielt, wurde unter Verwendung von Ni-NTA-Harz (Thermo) gemäß Herstellerspezifikation gereinigt, mit der Ausnahme, dass alle Puffer mit 1% (w/v%) DDM ergänzt wurden. Die Elutionsfraktion aus der Ni-NTA-Reinigung wurde dann einer Größenausschlusschromatographie (SEC) unter Verwendung eines ÄKTA Explorer FPLC-Systems (GE Healthcare) mit Superdex 200 10/300 GL-Säule unterzogen. Gereinigtes Protein wurde in einer Endkonzentration von 1-2 mg mL−1 in einem Speicherpuffer (50 mM HEPES, 100 mM NaCl, 5% (v/v%) Glycerin, 0,01% (w/v%) DDM, pH 7,5) bei 4 °C gelagert., Die Glycerinkonzentration in der Probe wurde zur Langzeitlagerung bei -80 °C auf 20% (v/v%) eingestellt.

Die Reinigung des Akzeptorproteins scFv13-R4DQNAT wurde wie zuvor beschrieben52. Kurz gesagt wurde der E. coli-Stamm BL21(DE3) mit dem Plasmid pET28a-scFv13-R4(N34L, N77L)DQNAT in 1 L TB gezüchtet, das mit Kanamycin geliefert wurde. Die Kultur wurde bei 37 °C inkubiert, bis Abs600 ~0,7 erreichte, wobei die Proteinexpression durch Zugabe von Isopropyl β-d-1-Thiogalactopyranosid (IPTG) zu einer Endkonzentration von 0,1 mM induziert wurde., Die Zellen wurden wie oben beschrieben geerntet und zerstört. Das scFv13-R4CQNAT-Protein wurde unter Verwendung von Ni-NTA-Harz gereinigt, gefolgt von SEC gemäß den Protokollen des Herstellers. Protein wurde in einer Endkonzentration von 1-2 mg mL−1 im Speicherpuffer (50 mM HEPES, 250 mM NaCl, 1 mM EDTA, pH 7,5) bei 4 °C gelagert

Extraktion von LLOs

Das Protokoll zur organischen Lösungsmittelextraktion von LLOs aus E. coli-Membranen wurde aus einem zuvor beschriebenen Protokoll adaptiert34,66., In den meisten Fällen wurde eine einzelne Kolonie des Stammes CLM24, die ein Plasmid für die Zielglykanbiosynthese trug (Ergänzende Tabelle 2), über Nacht in LB-Medien gezüchtet. Die bemerkenswerten Ausnahmen waren LLOs mit dem W. succinogenes N-glycan (WsLLOs), die unter Verwendung von DH5a-Zellen mit dem pEpiFOS-5pgl5-Fosmid (freundlicherweise zur Verfügung gestellt von Dr. Markus Aebi) hergestellt wurden, und LLO sb-Man3GlcNAc2, die unter Verwendung von Origami2(DE3) gmd::kan ΔwaaL-Zellen mit plasmid pConYCGmCB hergestellt wurden. Über Nacht wurden Zellen in 1 L TB subkultiviert, die mit einem geeigneten Antibiotikum ergänzt und gezüchtet wurden, bis der Abs600 ~0,7 erreichte., Die Inkubationstemperatur wurde auf 30 °C für die Biosynthese aller Glykane mit Ausnahme von Man3GlcNAc2 eingestellt, die auf 16 °C eingestellt wurde. Für Plasmid pMW07-pglΔB wurde die Proteinexpression mit l-Arabinose in einer Endkonzentration von 0,2% (w/v%) induziert, während für Fosmid pEpiFOS-5pgl5 die Induktion mit Isopropyl β-d-1-Thiogalactopyranosid (IPTG) in einer Endkonzentration von 1 mM erfolgte.promotoren und somit keine chemischen Induktoren erforderlich. Nach 16 h wurden die Zellen durch Zentrifugation geerntet und Zellpellets lyophilisiert, um die Trockenheit bei -70 °C zu beenden., Für die Extraktion von CjLLOs, nativen und engineered ClLLOs, E. coli O9 Primer-Adaptor LLOs und WsLLOs wurden die Lyophilisate in 10:20:3 Volumenverhältnis von CHCl3:CH3OH:H2O-Lösung suspendiert und bei Raumtemperatur für 15 min inkubiert, um die Extraktion von LLOs zu erleichtern. Zur Extraktion von LLO sb-Man3GlcNAc2-Glykan wurde Lyophilisat sukzessive in 10:20 (v/v%) CHCl3:CH3OH-Lösung, Wasser und 10:20:3 CHCl3: CH3OH suspendiert: H2O-Lösung mit 15 min Inkubation bei Raumtemperatur zwischen jedem Schritt., In jedem Fall wurde die endgültige Suspension 15 min lang zentrifugiert (4000×g), wonach die organische Schicht (untere Schicht) gesammelt und mit einem Vakuumkonzentrator getrocknet wurde, gefolgt von einer Lyophilisierung. Lyophilisates mit aktiven LLOs wurden resuspendiert, die in cell-free Glykosylierung-Puffer (10 mM HEPES, pH 7,5, 10 mM von mncl2 und 0,1% (w/v%) DDM) und Lagerung bei 4 °C.

Vorbereitung von Rohöl S30 Extrakten

CLM24 Quelle Sorten angebaut wurden in 2×YTPG (10 g L−1 Hefeextrakt, 16 g L−1 tryptone, 5 g L−1 NaCl, 7 g L−1 K2HPO4, 3 g L−1 KH2PO4, 18 g L−1 glucose, pH 7,2), bis die Abs600 erreicht ~3., Um OST-angereicherten Extrakt zu erzeugen, wurde CLM24-Plasmid pSF-CjPglB, pSF-CcPglB, pSF-DdPglB, pSF-DgPglB oder pSF-DvPglB52 als Quellstamm verwendet. Zur Erzeugung von LLO-angereichertem Extrakt wurde CLM24-Plasmid pMW07-pglΔB als Quellstamm verwendet. Um einen Ein-Topf-Extrakt zu erzeugen, der sowohl OST als auch LLOs enthielt, wurde CLM24 mit pMW07-pglΔB und pSF-CjOST als Quellstamm verwendet. Bei Bedarf wurde die Expression von Glykosylierungskomponenten mit l-Arabinose bei einer Endkonzentration von 0,02% (w/v%) induziert., Nach Induktion durfte die Proteinexpression bei 30 °C auf eine Dichte von OD600 ~3 übergehen, wobei die Zellen durch Zentrifugation (5000×g) bei 4 °C für 15 min geerntet wurden. Alle nachfolgenden Schritte wurden bei 4 °C durchgeführt, sofern nicht anders angegeben. Pelletierte Zellen wurden dreimal in S30-Puffer gewaschen (10 mM Tris-Acetat, 14 mM Magnesiumacetat, 60 mM Kaliumacetat, pH 8.2). Nach dem letzten Waschen wurden die Zellen 10 min bei 7000×g pelletiert und auf flüssigem Stickstoff flashgefroren. Um Lysat herzustellen, wurden die Zellen aufgetaut und in 1 ml S30-Puffer pro 1 g nasser Zellmasse zur Homogenität resuspendiert., Die Zellen wurden mit einem Avestin EmulsiFlex-B15 Hochdruckhomogenisator bei 20,000-25,000 psi mit einem einzigen Durchgang gestört. Das Lysat wurde dann zweimal bei 30.000×g für 30 min zentrifugiert, um Zellreste zu entfernen. Der Überstand wurde in ein neues Gefäß überführt und mit 250 U / min-Schütteln bei 37 °C für 60 min inkubiert, um endogene mRNA-Transkripte abzubauen und vorhandene Polysomenkomplexe im Lysat zu stören. Nach der Zentrifugation (15.000×g) für 15 min bei 4 °C wurde der Überstand gesammelt, aliquoted, in flüssigem Stickstoff flashgefroren und bei -80 °C gelagert., S30-Extrakt war etwa drei Freeze-Thaw-Zyklen aktiv und enthielt ~40 g L−1 Gesamtprotein, gemessen durch Bradford-Assay.

Zellfreie Glykoproteinsynthese

Zur In-vitro-Glykosylierung von gereinigtem Akzeptorprotein wurden Reaktionen in einem 50 µL-Volumen durchgeführt, das 3 µg scFv13-R4DQNAT, 2 µg gereinigtes CjPglB und 5 µg extrahierte LLOs (im Fall von Man3GlcNAc2 LLOs wurden 20 µg verwendet) In-vitro-Glykosylierungspuffer (10 mM HEPES, pH 7,5, 10 mM MnCl2 und 0,1 mm% (w/v%) DDM). Das Reaktionsgemisch wurde bei 30 ° C für 16 h inkubiert., Für die rohextraktbasierte Expression von Glykoproteinen wurde ein zweiphasiges Schema implementiert. In der ersten Phase wurde die Proteinsynthese mit einem modifizierten PANOx-SP System67 durchgeführt. Insbesondere wurden 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen mit 15-µL-Reaktionen geladen, die 200 ng Plasmid-DNA, 30% (v/v%) S30-Extrakt und Folgendes enthielten: 12 mM Magnesiumglutamat, 10 mM Ammoniumglutamat, 130 mM Kaliumglutamat, 1,2 mM Adenosintriphosphat (ATP), 0,85 mM Guanosintriphosphat( GTP), 0,85 mM Uridintriphosphat (UTP), 0,85 mM Cytidintriphosphat (CTP), 0,034 mg mL−1 Folinsäure, 0.,171 mg ml-1 E. coli tRNA (Roche), je 2 mM 20 Aminosäuren, 30 mM Phosphoenolpyruvat (PEP, Roche), 0,4 mm Nicotinamidadenindinukleotid (NAD), 0,27 mm Coenzym-A (CoA), 4 mM Oxalsäure, 1 mm Putrescin, 1,5 mm Spermidin und 57 mm HEPES. Für scFv13-R4DQNAT, hEPO22-DQNAT-26, hEPO36-DQNAT-40 und hEPO81-DQNAT85 wurde diese Phase bei 30 °C für 4 h unter oxidierenden Bedingungen durchgeführt, während für sfGFP217-DQNAT und sfGFP217-AQNAT diese Phase bei 30 °C für 5 min unter reduzierenden Bedingungen durchgeführt wurde., Für oxidierende Bedingungen wurde der Extrakt mit 750 µM Iodacetamid im Dunkeln bei Raumtemperatur für 30 min vorkonditioniert und die Reaktionsmischung mit 200 mm Glutathion im Verhältnis 3:1 zwischen oxidierten und reduzierten Formen zugeführt. Die aktiven sfGFP-Ausbeuten aus zellfreien Reaktionen wurden quantifiziert, indem Fluoreszenz-In-Lysat gemessen und unter Verwendung einer zuvor beschriebenen Standardkurve in Konzentration umgewandelt wurde39. In der zweiten Phase wurde die Proteinglykosylierung durch Zugabe von MnCl2 und DDM bei einer Endkonzentration von 10 mM und 0 eingeleitet.,Bei Bedarf wurden die Reaktionen mit 2 µg gereinigtem CjPglB (d. H. Für CFGpS mit LLO-angereicherten Extrakten) oder 5 µg lösungsmittelextrahiertem CjLLOs (d. H. Für CFGpS mit LLO-angereicherten Extrakten) ergänzt. Alle Reaktionen wurden durch Zugabe von Laemmli-Probenpuffer mit 5% ßME gestoppt, wonach die Proben 15 min bei 100 °C gekocht und durch SDS-PAGE und Western Blotting analysiert wurden.

Western-Blot-Analyse

Proben mit 0,5 µg Akzeptorprotein wurden in SDS-PAGE-Gele geladen., Nach der elektrophoretischen Trennung wurden Proteine gemäß Herstellerprotokoll von Gelen auf Immobilion-P-Polyvinyliden-Difluorid (PVDF) – Membranen (0,45 µm) übertragen. Membranen wurden zweimal mit TBS-Puffer gewaschen (80 g L−1 NaCl, 20 g L−1 KCl und 30 g L−1 Tris-Base), gefolgt von einer Inkubation für 1 h in Blockierungslösung (50 g L−1 fettfreie Milch in TBST (TBS mit 0,05% (v/v%) Tween-20))). Nach dem Blockieren wurden die Membranen 4 mal mit TBST mit 10 min Inkubation zwischen jeder Wäsche gewaschen., Eine erste Membran wurde mit 6xHis-polyklonalem Antikörper (Abcam, ab137839, 1:7500) untersucht, der spezifisch Hexahistidin-Epitop-Tags erkennt, während eine zweite Replikatmembran mit einem der folgenden untersucht wurde: hR6 (1:10.000) Serum vom Kaninchen, das die nativen C. jejuni und C. lari glycan sowie engineered C. lari glycan oder ConA-HRP (Sigma, L6397, 1:2500) erkennt, die Man3GlcNac und Man3GlcNAc2 erkennen. Das Sondieren von Membranen wurde für mindestens 1 h mit Schütteln bei Raumtemperatur durchgeführt, wonach Membranen wie oben beschrieben mit TBST gewaschen wurden., Für die Entwicklung wurden Membranen kurz bei Raumtemperatur mit Western ECL Substrat (BioRad) inkubiert und mit einem ChemiDocTM XRS+System abgebildet. Die mit Extrakten angereicherten Enzyme wurden durch ein identisches SDS-PAGE-Verfahren nachgewiesen, gefolgt von einer Western-Blot-Analyse mit einem für das FLAG-Epitop-Tag spezifischen polyklonalen Antikörper (Abcam, ab49763, 1:7500). Die Glykankomponente von LLOs, angereichert mit Extrakten, wurde nachgewiesen, indem 10 µL Extrakte direkt auf Nitrozellulosemembranen gespritzt und anschließend mit hR6-Serum nachgewiesen wurden. Nicht abgeschnittene Immunoblot-Bilder sind in der Abb. 8.,

MS-Analyse

Ungefähr 2 µg scFv13-R4CQNAT-Protein in Lösung wurden mit 6 M Harnstoff denaturiert, mit 10 mM DTT reduziert, bei 34 °C für 1 h inkubiert, dann mit 58 mM Iodoacetamid für 45 min im Dunkeln bei Raumtemperatur alkyliert und mit abschließender 36 mM DTT abgeschreckt. Die Lösung wurde dann vor der Trypsinverdauung mit 50 mm Ammoniumbicarbonat (pH 8,0) auf eine Endpufferkonzentration von 1 M Harnstoff verdünnt. Die Probe wurde mit 0,2 µg Trypsin für 18 h bei 37 °C verdaut. Die Verdauung wurde durch Zugabe von TFA auf einen endgültigen pH–Wert von 2,2-2,5 gestoppt., Die Proben wurden anschließend mit SOLA HRP SPE Cartridge (ThermoFisher Scientific) entsalzt. Die Kartuschen wurden mit 1 × 0,5 ml 90% Methanol, 0,1% Fluoressigsäure (TFA) konditioniert und mit 2 × 0,5 ml 0,1% (v/v%) TFA ausgeglichen. Die Proben wurden 1:1 mit 0,2% (v/v%) TFA verdünnt und laufen langsam durch die Kartuschen. Nach dem Waschen mit 2 × 0,5 ml Gleichgewichtslösung wurden Peptide um 1 × 0,5 ml 50% (v/v%) Acetonitril (ACN), 0,1% (v/v%) TFA eluiert und in einer Geschwindigkeitsvakuumzentrifuge getrocknet.,

Die nanoLC-MS / MS-Analyse wurde mit UltiMate3000 RSLCnano (Dionex) durchgeführt, gekoppelt mit einem Orbitrap Fusion (ThermoFisher Scientific) Massenspektrometer, das mit einer Nanospray Flex-Ionenquelle ausgestattet ist. Jede Probe wurde in 22 µL von 0,5% (w/v%) FA rekonstituiert und 10 µL wurde auf eine Acclaim PepMap 100 C18 Trap−Säule (5 µm, 100 µm × 20 mm, 100 Å, ThermoFisher Scientific) mit nanoViper Fittings bei 20 µL min-1 von 0,5% FA für Online-Entsalzung geladen., Nach 2 min schaltete das Ventil, damit Peptide auf einer Acclaim PepMap C18 Nano−Säule (3 µm, 75 µm × 25 cm, ThermoFisher Scientific) in einem 90-Min-Gradienten von 5 bis 23% bis 35% B bei 300 nL min-1 (3 bis 73 bis 93 min) getrennt werden konnten, gefolgt von einem 9-min-Ramping auf 90% B, einem 9-min-Halt bei 90% B und einem schnellen Wechsel auf 5% B in 1 min. Die Säule wurde mit 5% B für 20 min vor dem nächsten Lauf wieder ausgeglichen. Die Orbitrap-Fusion funktionierte im positiven Ionen-Modus mit Nanospray-Spannung auf 1,7 kV und Quellentemperatur auf 275 °C., Vor der Analyse wurde eine externe Kalibrierung für FT -, IT-und Quadrupol-Massenanalysatoren durchgeführt. Dem Orbitrap Full MS Survey Scan (m/z 400-1800) folgten Top 3 s datenabhängige höhere Kollisions Dissoziationsprodukt Ion triggered ETD (HCD-pd-ETD) MS/MS Scans nach Vorläuferpeptiden mit 2-7 Ladungen über einer Schwelle Ionenzahl von 50.000 mit normalisierter Kollisionsenergie von 32%., MS Umfrage durchsucht erworben wurden bei einem Auflösungsvermögen von 120.000 (FWHM bei m/z 200), mit Automatische Gin Control (AGC) = 2e5 und maximale Einspritz-Zeit (Max ES) = 50 ms, und HCD-MS/MS-scans bei einer Auflösung von 30.000 mit AGC = 5e4, Max, IT = 60 ms und mit F Isolierung Fenster (m/z) in 3 für den Massenbereich von m/z 105-2000. Dynamische Ausschlussparameter wurden auf 1 innerhalb von 60 s Ausschlussdauer mit ±10 ppm Ausschlussmassenbreite eingestellt. Produkt-Ionen-trigger-Liste Bestand des peaks bei 204.0867 Da (HexNAc oxonium-Ionen), 138.0545 Da (HexNAc-fragment) und 366.1396 Da (HexHexNAc oxonium-Ionen)., Wenn eines der HCD-Produktionen in der Liste nachgewiesen wurde, wurden zwei ladungsabhängige ETD-MS/MS-Scans (EThcD) mit HCD-Zusatzaktivierung (SA) auf demselben Vorläuferion ausgelöst und in einer linearen Ionenfalle gesammelt. Für doppelt geladene Vorläufer wurde die ETD-Reaktionszeit als eingestellt 150 ms und die SA-Energie auf 30% eingestellt, während die gleichen Parameter bei 125 ms bzw. Für beide Ionen ausgelöste Scans wurde das Fluoranthen-ETD-Reagenzziel auf 2e5, das AGC-Ziel auf 1e4, das Max-IT auf 105 ms und das Isolationsfenster auf 3 gesetzt. Alle Daten wurden mit Xcalibur 3 erfasst.,0 operationssoftware und Orbitrap Fusion Tune Anwendung v. 2.1 (ThermoFisher Scientific).

Alle MS-und MS/MS-Rohspektren aus jeder Probe wurden mit Byonics v. 2.8.2 (Proteinmetriken) unter Verwendung der E coli-Proteindatenbank mit hinzugefügter scFv13-R4DQNAT-Proteinzielsequenz durchsucht. Die Peptidsuchparameter waren wie folgt: zwei verpasste Spaltung für die vollständige Trypsinverdauung mit fester Carbamidmethylmodifikation von Cystein, variable Modifikationen der Methioninoxidation und Desamidierung an Asparagin/Glutaminresten., Die Peptidmassentoleranz betrug 10 ppm und die Fragmentmassentoleranzwerte für HCD-und EThcD-Spektren betrugen 0,05 bzw. Sowohl die maximale Anzahl gängiger als auch seltener Modifikationen wurde auf zwei festgelegt. Die Glykan-Suche wurde gegen eine Liste von 309 Säugetier-N-verknüpften Glykanen in Byonic Software durchgeführt. Identifizierte Peptide wurden für maximal 2% FDR filtriert. Die Software exportierte die Ergebnisse der Suche in eine Tabelle.

GFP-Fluoreszenzaktivität

Die Aktivität von zellfrei abgeleitetem sfGFP wurde unter Verwendung einer zuvor beschriebenen In-Lysat-Fluoreszenzanalyse bestimmt39., Kurzzeitig wurden 2 µL zellfrei synthetisierte glykosylierte sfGFP-Reaktion in 48 µL Nanopure-Wasser verdünnt. Die Lösung war dann in einem Costar 96-well black assay-Platte (Corning). Anregungs – und Emissionswellenlängen für sfGFP-Fluoreszenz waren 485 bzw.

Enzym-linked-Immuno-Analyse (ELISA)

Costar 96-well-ELISA-Platten (Corning) beschichtet wurden über Nacht bei 4 °C mit 50 µl 1 mg mL−1 E. coli-β-gal – (Sigma-Aldrich) in 0,05 M Natrium-Carbonat-Puffer (pH 9.6)., Nach Blockierung mit 5% (w/v%) Rinderserumalbumin (BSA) in PBS für 3 h bei Raumtemperatur wurden die Platten viermal mit PBST-Puffer (PBS, 0,05% (v/v%) Tween-20, 0,3% (w/v%) BSA) gewaschen und mit seriell verdünnten gereinigten scFv13-R4-Proben oder löslichen Fraktionen von CFGpS-Lysaten für 1 h bei Raumtemperatur inkubiert. Die Proben wurden durch den Bradford-Assay quantifiziert und eine äquivalente Menge an Gesamtprotein wurde auf die Platte aufgebracht. Nach viermaligem Waschen mit demselben Puffer wurde jedem Schacht 1 h lang anti-6×-His-HRP konjugierter Kaninchen-polyklonaler Antikörper (Abcam) in 3% PBST zugesetzt., Die Platten wurden gewaschen und mit Standardprotokollen entwickelt.

In vitro cell Proliferation Assay

Humane Erythroleukämie TF-1–Zellen (Sigma), die Granulozyten-Makrophagen-Kolonie-stimulierender Faktor (GM-CSF), Interleukin 3 (IL-3) oder hEPO für Wachstum und Überleben erfordern, wurden verwendet. Zellen gehalten wurden in RPMI-1640 Medium, ergänzt mit 10% FBS, 50 U mL−1 penicillin, 50 mg mL−1 streptomycin, 2 mM Glutamin und 2 ng mL−1 GM-CSF bei 37 °C in einer befeuchteten Atmosphäre mit 5% CO2., Nach 16 h Inkubation in RPMI-1640 Medien ohne GM-CSF wurden Zellen gezählt, geerntet und in frischen Medien resuspendiert. 5 × 103 TF-1-Zellen pro Vertiefung wurden in einer 96-Well-Assayplatte ausgesät, und EPO-Standards oder-Proben wurden zu den endgültigen gewünschten Konzentrationen zu jeder Vertiefung hinzugefügt. Die Zellen wurden mit für 6 h im feuchten Inkubator inkubiert, bevor AlamarBlue ® hinzugefügt wurde. Nach 12 h wurde das Fluoreszenzsignal bei 560 nm/590 nm Anregungs – /Emissionswellenlänge gemessen.,

Datenverfügbarkeit

Alle während der Studie generierten Daten sind in diesem Artikel und seinen ergänzenden Informationsdateien enthalten und stehen den Autoren auf angemessene Anfrage zur Verfügung.