Laborstandorte

Alle DNA-Arbeiten mit den modernen Verwandten wurden an der Universität von Leicester durchgeführt. Männlich-Linie verwandten eingegeben wurden, mit Promega PowerPlex Y23 und für SNPs definiert die wichtigsten europäischen Y-Haplogruppen in Leicester mit einer Teilmenge der Eingabe wird bestätigt an der Université Paul Sabatier. Weibliche Verwandte wurden für das gesamte mitochondriale Genom an der Universität von Leicester sequenziert., DNA wurde aus alten Zähnen und Knochen an der Universität von York und der Université Paul Sabatier, Toulouse extrahiert. Bibliotheksvorbereitung und Zielanreicherung wurden an der Universität von York durchgeführt. Die Single-End-100-bp-Sequenzierung mit einem HiSeq 2000 (Illumina, CA, USA) wurde in der Kopenhagener Sequenzierungsanlage durchgeführt. Die gezielte Sequenzierung sowohl moderner als auch alter DNA wurde auch auf der genomischen technischen Plattform PlaGe (Genopole, Toulouse, Frankreich) und im Protein Nucleinsäure Chemistry Laboratory der Universität Leicester durchgeführt. Nachfolgend finden Sie eine komprimierte Version der verwendeten Methoden., Für jeden Schritt finden Sie vollständige Informationen in den ergänzenden Methoden. Einzelheiten zu den umfangreichen genealogischen Untersuchungen, die für dieses Projekt durchgeführt wurden, finden Sie in der ergänzenden Anmerkung 2.

Sample collection

die DNA extrahiert wurde aus Speichelproben der modernen verwandten von Richard III und alle Teilnehmer rekrutiert wurden mit informierter Einwilligung folgenden review des Projekts von der University of Leicester Research Ethics Committee.

Skelett 1 wurde ausgegraben und Proben unter sauberen Bedingungen entnommen37., Alle, die an der Ausgrabung auf dem Gelände der Grey Friars, dem Clean Laboratory in Leicester und den an den Labors und Laborarbeiten Beteiligten beteiligt waren, hatten ihre mitochondrialen und, für Männer, Y-Chromosomen getippt. DNA wurde aus Speichelproben extrahiert und alle Teilnehmer wurden mit informierter Zustimmung rekrutiert.

DNA Extraktion antiker Proben

Aus Zähnen und Knochen (Femur) wurde DNA extrahiert. Alle Verfahren wurden in speziellen alten DNA-Labors an der Universität von York und der Université Paul Sabatier in Toulouse mit geeigneten Kontaminationsvorkehrungen durchgeführt., Zwei Extraktionsrohlinge wurden aufgenommen und während des gesamten Prozesses genau so behandelt, als wären sie Extrakte. PCRs und Bibliotheksexperimente enthielten auch weitere leere Steuerelemente.

Sex-Typing-Assay durchgeführt am Skelett 1

Ein neu entwickelter Sex-Typing-Assay bestehend aus PCR-Primern zur Co-Amplifikation des SRY-Fragments mit UTX-und UTY-homologen Regionen wurde verwendet. Dieser Assay wurde entwickelt, um es relativ kleinen Fragmenten von SRY, UTX und UTY zu ermöglichen, aus Proben, die wahrscheinlich degradiertes DNA10 enthalten, coamplifiziert zu werden.,

Mitochondriale Kontrollregion Die Analyse des Skeletts 1

Die Analyse der hypervariablen Segmente (HV1, HV2 und HV3)der mtDNA-Kontrollregion erfolgte durch Amplifikation und direkte Sequenzierung mehrerer überlappender Fragmente von 153 bis 250 bp Größe (http://forensic.yonsei.ac.kr/protocol/mtDNA-midi-mini.pdf) 22. Eine Auswahl von Amplicons wurde zum Klonen der PCR-Produkte im Labor in Toulouse verwendet. Die Sequenzierung erfolgte mit dem Big Dye Terminator V3.,1 cycle Sequencing Kit (Applied Biosystems) und durch Kapillarelektrophorese an einem ABI Prism 3730 Genetic Analyser (Applied Biosystems) am Protein Nucleinsäure Chemistry Laboratory der University of Leicester oder an der genomic Technical Platform PlaGe (Genopole).

Mitochondriales Genom / Y-SNP / HIrisplex Typisierung von Skelett 1

Bibliotheken wurden nach Meyer und Kircher16 gebaut, mit der Ausnahme,dass der erste Filtrationsschritt zwischen der stumpfen Endreparatur und der Adapterligatur durch Wärmeinaktivierung der Enzyme ersetzt wurde38, 39., Zwei Mikroarrays wurden entwickelt, eine für die mtDNA-Anreicherung und eine für die nukleare SNP-Anreicherung. Die DNA-Anreicherung erfolgte durch Hybridisierungserfassung unter Verwendung des Agilent 244k DNA SureSelect Microarrays (Agilent, Böblingen, Deutschland). Für die nukleare Abscheidung wurden Y-Chromosomensonden entwickelt, um die SNPs abzudecken, die für die wichtigsten europäischen Linien14 relevant sind. Weitere Sonden wurden entwickelt, um die für die HIrisplex31-Marker relevanten SNPs abzudecken. Diese beiden Sätze von Sonden (mitochondriale und SNPs) wurden separat verwendet, um die beiden verschiedenen Microarray-Designs eines 1 × 244K-Formats zu füllen., Für jedes Mikroarray wurde das Capture-Protokoll nach Hodges et al.15 mit den von Zhang et al.40 und Fortes und Paijmans38. Die Bibliotheken wurden in äquimolaren Mengen gebündelt und auf zwei Spuren der Illumina HiSeq 2000-Plattform im 100-SE-Modus in der Sequenzierungseinrichtung der Universität Kopenhagen, Dänemark, sequenziert.

Die Rohlesungen aus jeder Bibliothek wurden basierend auf dem Sechs-Nukleotid-Index sortiert, der während der Bibliotheksvorbereitung verwendet wurde. Für weitere Analysen wurden nur Lesevorgänge mit einer 100% igen Übereinstimmung mit dem Index ausgewählt., Liest kürzer als 25 Nukleotide wurden aus der weiteren Analyse verworfen. Die getrimmten Lesevorgänge wurden Autosomen und Geschlechtschromosomen aus dem menschlichen Referenzgenom Build 37 (GRCh37) und dem rCRS (NC_012920.1) mit bwa 0.7.5 a-r405 (ref. 41). In jeder Ausrichtung wurden die Ausgabe-BAM-Dateien mit SAMtools 0.1.19 (ref. 41) und PCR-Duplikate wurden anschließend entfernt. Die zugeordneten Lesevorgänge wurden basierend auf einer Mapping-Qualität >29 und ihrer Ausrichtung auf eindeutige Positionen entlang der Referenzsequenz gefiltert.,

Polymorphe Positionen wurden mit SAMtools (SAMtools 0.1.19) und bcftools identifiziert. Schließlich, vcfutils.pl wurde verwendet, um die Liste der Varianten nach einem Phred-skalierten Genotyp posterior probability quality >20 und einer Lesetiefe höher als 10 zu filtern. Um Fehlkalkulationen aufgrund des Desaminierungsmusters antiker DNA-Moleküle zu vermeiden, wurden alle in der VCF-Ausgabedatei gemeldeten polymorphen Positionen mit dem Auge überprüft., Im Falle des mitochondrialen Genoms wurde die Anordnung zu der Referenz in IGV42 visualisiert, während die Ausrichtung des Gens, das die SNPs enthält, zu den Referenzchromosomen unter Verwendung von IGV43 visualisiert wurde.

SNP-Typisierung mittels PCR

Der Capture-Ansatz ergab eine unzureichende Abdeckung für alle HIrisPlex-und Y-Chromosom-SNPs und daher wurden Primer entwickelt, um Amplikons zu erzeugen, die diese SNPs enthalten, sowie zwei SNPs, die die Y-Chromosom-Haplogruppe G weiter definieren: M285 (G1) und P287 (G2) (ref. 14). Diese wurden im Rahmen von Multiplexreaktionen nach Römpler et al. verstärkt.,44 oder Singleplex-Reaktionen (mit 40 Zyklen und ohne sekundäre Verstärkung) und sequenziert auf dem Ionenstrom nach Bibliotheksvorbereitung mit Ion PGM 200 Xpress Template Kit und PGM 200 Sequencing Kit. Um die Abdeckung zu erhöhen, wurde die Singleplex-PCR und Sequenzierung eines Markers (rs28777) gemäß Binladen et al.45

Die Typisierung der Haplogruppe G mit SNPs (M201, M285 und P287) wurde in Toulouse mit Singleplex-PCRs wiederholt. Die Sequenzierung dieser PCR-Produkte wurde mit Big-Dye Terminator V3 durchgeführt.,1 cycle sequencing kit (Applied Biosystems) analysiert, durch Kapillarelektrophorese auf einem ABI Prism 3730 Genetic Analyzer (Applied Biosystems) in der genomischen technische Plattform PlaGe (Genopole).

Y-chromosomale Haplotypanalyse

Die Y-chromosomalen Haplotypen alter und moderner Proben wurden unter Verwendung des PowerPlex Y23-Systems (Promega) erhalten und mittels Kapillarelektrophorese an einem ABI Prism 3730 Genetic Analyser (Applied Biosystems) auf der genomic Technical Platform PlaGe (Genopole) und an einem ABI Prism 3130xl Genetic Analyser (Applied Biosystems) an der Universität Leicester analysiert., Für Skeleton 1 wurde dies an drei separaten Extrakten (RM2, LM1 und LM3) in zwei verschiedenen alten DNA-Labors (York und Toulouse) durchgeführt. Für die modernen Verwandten wurde dies an zwei verschiedenen Extrakten in zwei verschiedenen modernen Labors (Leicester und Toulouse) durchgeführt.

Y-chromosomale SNP-Analyse moderner Proben

Nach der Bestimmung des Y-Haplotyps für die modernen männlichen Linienproben wurde die vorhergesagte Haplogruppe unter Verwendung des Haplogruppenprädiktors von Whit Athey bestimmt (http://www.hprg.com/hapest5/hapest5a/hapest5.htm?order=num)., Binäre Marker, die diese und verwandte Linien abdeckten, wurden in zwei Multiplexe durch das SNaPshot-Minisequenzierungsverfahren (Applied Biosystems) und einen ABI3130xl-genetischen Analysator (Applied Biosystems) eingegeben, gefolgt von einer Bestätigung durch Sanger-Sequenzierung. Somerset 3 wurde als Hg I (M170+ M223−, M253−)14 abgeleitet, was durch das Labor in Toulouse weiter bestätigt wurde. Somersets 1,2,4 und 5 wurden bestimmt, um für R1b-U152 abgeleitet zu werden. Somersets 1,2,4 und 5 wurden auf SNPs getestet, die diese Clade13 (Z56, M126, Z36, Z192, M160 und L2) unter Verwendung der Sanger-Sequenzierung in beiden Labors unterteilten.,

Moderne mtDNA-Analyse

Beide Proben wurden zweimal repliziert.

Die Proben wurden mit Oragene DNA Collection Kits (DNA Genotek) entnommen und mit zwei verschiedenen Methoden extrahiert: dem Qiacube Blood and Body Fluid Protocol (200 µl mit 200 µl Elution) und dem Oragene Protocol. Um den Kontrollbereich zu analysieren, wurden die Proben zweimal in Vorwärts-und Rückwärtsrichtung sequenziert, wobei zwei überlappende Primersätze (15973-296 und 16524-614) unter Verwendung des Big-Dye-Terminators V 3.1 (Applied Biosystems) verwendet wurden. Keine Unterschiede wurden zwischen repliziert oder zwischen den Proben.,

Proben wurden für das komplette mitochondriale Genom aus beiden Extraktionen nach Meyer et al. amplifiziert.26 PCR-Amplicons wurden auf einem Ion314 PGM-Sequenzer auf einem Ion314-Chip sequenziert. Bibliotheken wurden mit dem Ion Xpress Plus gDNA Fragment Library Preparation Kit vorbereitet, während die Schablonenvorbereitung und die Sequenzierung mit dem Ion PGM 200 Xpress Template Kit bzw. dem Ion PGM 200 Sequencing Kit durchgeführt wurden. Raw-Lesevorgänge wurden mithilfe der im Ion Alignment Plugin 3.2.1 (Torrent Suite Software 3.2) enthaltenen TMAP-Software auf die rCRS (NC_012920.1) zurückgemappt.,1) auf dem Ion Torrent Server. Doppelte Lesevorgänge und Variantenaufrufe wurden mit SAMtools 0.1.19 (ref. 41) und die lokale Neuausrichtung wurde mit dem Genomanalysewerkzeug Kit46 durchgeführt. Variantenstellen wurden nach Basisqualität 20, Kartierungsqualität 50 und Deckungstiefe 30 gefiltert, wonach 33 polymorphe Stellen beibehalten wurden. Alle diese Sites wurden manuell überprüft und durch Sanger-Sequenzierung in beide Richtungen bestätigt und zweimal repliziert.,

Kontaminationskontrolle und Quantifizierung

Die moderne DNA-Kontamination der antiken Überreste wurde mit folgenden Methoden kontrolliert:

  1. 1

    Die Ausgrabung wurde unter sauberen Bedingungen durchgeführt (siehe ergänzende Methoden)

  2. 2

    Proben wurden in sauberen Labors gelagert und alte DNA-Arbeiten wurden nur in speziellen alten DNA-Einrichtungen durchgeführt.

  3. 3

    Separate alte Proben wurden in separaten Labors verarbeitet, um die Ergebnisse zu replizieren.,

  4. 4

    Alle Labormitglieder und Ausgrabungsteilnehmer hatten ihre mtDNA typisiert und Y-Chromosom-Typisierung wurde an allen beteiligten Männern durchgeführt. Keiner hatte einen passenden mtDNA – oder Y-Chromosomentyp.

Als Beweis für eine signifikante Kontamination zeigt die DNA-Analyse von Skeleton 1 eine perfekte mtDNA-Übereinstimmung mit ML1 und eine Single-Base-Differenz mit ML2. Es zeigt auch einen klaren Y-STR-Haplotyp, der mit einer Reihe von Extrakten repliziert wurde, die in zwei separaten Labors generiert und getestet wurden., Schließlich unterstützt dies auch eine Untersuchung (siehe ergänzende Methoden) des Substitutionsmusters in unserer Studie.

Statistische Analyse

Wir haben bei jedem Schritt einen konservativen Ansatz gewählt und für jeden beobachteten Beweis eine Wahrscheinlichkeit unter zwei gegensätzlichen Hypothesen berechnet: Hypothese 1 (H1): Skelett 1 ist Richard III und Hypothese 2 (H2): Skelett 1 ist nicht Richard III.,

Da davon auszugehen war, dass alle verschiedenen Beweislinien unabhängig waren, wurde die gemeinsame Wahrscheinlichkeit aller Beweisstücke durch Multiplikation der einzelnen Wahrscheinlichkeiten unter jeder Hypothese erhalten. Das Gewicht des Beweises für H1, das als Wahrscheinlichkeitsverhältnis (LR) bezeichnet wird, wurde dann durch das Verhältnis der Wahrscheinlichkeit unter H1 zu der unter H2 angegeben. Wir sagen, dass eine Annahme „konservativ“ ist, wenn sie die LR reduziert.

Die LR kann in eine Wahrscheinlichkeit umgewandelt werden, dass H1 wahr ist, eine vorherige Wahrscheinlichkeit gegeben., Wir haben den Moment als Ausgangspunkt genommen, in dem Skelett 1 zuerst als menschliches Skelett beobachtet und erkannt wurde, aber bevor irgendwelche Einschätzungen von Alter, Geschlecht, Gesundheitszustand und Todesursache vorgenommen wurden. Zu diesem Zeitpunkt gab es wesentliche Beweise dafür, dass ein Skelett, das in dem gefunden wurde, von dem angenommen wird, dass es der Ort des Leicester Grey Friars Choir war, der von Richard III sein könnte. Alle Informationen, die zu dem Zeitpunkt verfügbar waren, als Skelett 1 ausgegraben wurde, einschließlich seiner genauen Lage und der Art des Grabes, wurden für diese Analyse als Hintergrundinformationen angesehen, die die vorherige Wahrscheinlichkeit informieren können., Auf der Grundlage dieser Informationen glauben wir, dass ein skeptischer Beobachter vernünftigerweise keine vorherige Wahrscheinlichkeit von weniger als 1 von 40 hätte zuweisen können. Dieser Wert wurde in einer früheren Analyse vorgeschlagen (http://rationalgareth.com/), basierend auf dem, was wir als skeptische Bewertungen beurteilen. Die höchste Wahrscheinlichkeit, die durch die vorherigen Beweise gerechtfertigt werden könnte, könnte 1 zu 2 sein.

Soweit möglich haben wir relevante, verfügbare Daten verwendet. Zwangsläufig sind subjektive Urteile erforderlich, beispielsweise über die relevanten Referenzpopulationen und über die Fehlerwahrscheinlichkeiten in gemeldeten Tatsachen., Soweit es möglich und vernünftig erschien, strebten wir nach konservativem Ansatz, zum Beispiel mit einer Pseudocount-Methode, um die LR auf einen neutralen Wert von 1 zu verzerren, wodurch falsche große Werte von niedrigen beobachteten Frequenzen vermieden werden. Einzelheiten zu den Daten und Methoden, die bei der statistischen Analyse der Radiokohlenstoffdaten verwendet werden, Alter und Geschlecht des Skeletts, Vorhandensein von Skoliose, Vorhandensein von Perimortemwunden, Y-Chromosom-und mtDNA-Frequenzdaten finden Sie in den ergänzenden Methoden. Um die Ergebnisse zusammenzufassen: Die Radiokohlenstoffdaten ergaben ein Wahrscheinlichkeitsverhältnis von 1.,84 repräsentieren eine eingeschränkte Unterstützung für H1. Die Alters – und Geschlechtsdaten ergaben eine Wahrscheinlichkeitsration von 5.25, was wiederum eine begrenzte Unterstützung für H1 darstellt. Das Vorhandensein einer Schulter, die höher als die andere war und zu Richards Lebzeiten berichtet wurde, könnte auf Skoliose (Skelett 1 hatte eine schwere idiopathische Skoliose bei Jugendlichen) oder zwei andere bekannte Zustände zurückgeführt werden, Erb-Lähmung und Sprengel-Deformität, die beide sehr selten sind. Unter H1 geben die obigen Raten eine geschätzte Wahrscheinlichkeit von 0 an.,90 der Beobachtung der Skoliose angesichts der Beschreibung des körperlichen Aussehens von Richard III (=die Skolioserate dividiert durch die Summe der drei Raten), die wir mit 0,95 multiplizierten, um die Möglichkeit zu ermöglichen, dass die aufgezeichnete Beschreibung falsch war. Dies führte zu einer LR von 212, die H1 mäßig stark unterstützt. Das Vorhandensein von Perimortemverletzungen ergab eine LR von 42, und so moderate Unterstützung für H1. Das Y-Chromosom des Skeletts 1 entsprach nicht dem genealogisch ermittelten patrilinealen Verwandten von Richard III., Dies könnte durch ein falsches Vaterschaftsereignis in einer oder mehreren der 19 mutmaßlichen Vater-Sohn–Verbindungen zwischen Richard III und Henry Somerset, fünfter Herzog von Beaufort, erklärt werden. Die Y-Chromosomenergebnisse deuten auch auf ein weiteres falsches Vaterschaftsereignis zwischen Henry Somerset und seinen fünf zeitgenössischen, mutmaßlichen patrilinearen Nachkommen hin. Um konservativ zu sein, haben wir eine veröffentlichte falsche Vaterschaftsrate ausgewählt,die (1) niedriger war als jede andere veröffentlichte Rate, die wir betrachtet17, 47 und (2) basierend auf genealogischen Daten18., Dazu fügen wir das Ereignis der falschen Vaterschaft in den 19 mutmaßlichen Vater-Sohn-Verbindungen zwischen Henry Somerset und fünf zeitgenössischen männlichen Somersets hinzu. Dies ergibt eine Wahrscheinlichkeit von mindestens einem falschen Vaterschaftsereignis in den 19 mutmaßlichen Vater-Sohn-Verbindungen zwischen Richard III und Henry Somerset von 0.16. Angesichts der Tatsache, dass ein falsches Vaterschaftsereignis unter H1 aufgetreten sein muss, ist die Populationshäufigkeit des Y-Haplotyps von Skeleton 1 unter H1 und H2 gleich und wird in der LR-Berechnung aufgehoben. Somit ist die LR 0.16, was begrenzte Beweise gegen H1 darstellt.,

Die mtDNA-Sequenzen von Skeleton 1 und der mutmaßliche 19-Meiose-matrilineare Verwandte von Richard III, Michael Ibsen, stimmten vollständig überein. Ein 21-Meiose-Verwandter stimmte ebenfalls überein, außer an einer Basis (8994). Die letztere Beobachtung ist unter H1 und H2 angesichts der beobachteten Sequenz von Michael Ibsen gleichermaßen wahrscheinlich und hebt sich daher in der LR auf. Daher brauchen wir nur Wahrscheinlichkeiten für die Beobachtung der Sequenz, die Michael Ibsen und Skeleton 1 teilen.

Um die Wahrscheinlichkeit unter H1 zu erhalten, benötigen wir die mtDNA-Mutationsrate, und in diesem Fall sind hohe Schätzungen konservativ. Parsons et al.,28 Bericht 10 Mutationen der Kontrollregion in 327 Generationen unter Verwendung genealogischer Daten. Da dies auf eine höhere Rate als andere veröffentlichte Schätzungen hindeutet und auf genealogischen Daten basiert, haben wir daraus eine Wahrscheinlichkeit von 0, 52 für keine Mutation bei 19 Meiosen abgeleitet.

Für die Wahrscheinlichkeit unter H2 benötigen wir die Populationsfraktion des Skelett-1-Haplotyps. Obwohl wir die vollständige mtDNA-Genomsequenz aus Skeleton 1 erhalten haben, haben wir wenig veröffentlichte Gesamtgenomvergleichsdaten aus England identifiziert., So verwendeten wir für die statistische Analyse nur die mtDNA-Kontrollregionen zwischen den Positionen 16.093 und 16.320 und zwischen 00073 und 00188,für die wir geeignete englische Vergleichsdaten aus einem Update von Röhl et al.30, ergänzt mit mtDNA-Sequenzen von Roots for Real (Genetic Ancestor Ltd. Clare, Suffolk, Vereinigtes Königreich). Die Verwendung nur dieser kurzen Abschnitte des Kontrollbereichs unter H2 ist konservativ, da der Populationsanteil der beobachteten Kontrollbereichssequenzen nicht geringer sein kann als der des vollständigen mtDNA-Genoms., Die relevante Referenzpopulation ist in der Vergangenheit über 500 Jahre alt, aber aufgrund der großen Bevölkerungsgröße im betrachteten Zeitraum erwarten wir, dass sich die Populationsfrequenzen in den letzten fünf Jahrhunderten kaum verändert haben. Wir fanden die Häufigkeit des Skelett-1-Haplotyps unter 1823 in der Datenbank als 0, zu der wir die eine Instanz hinzufügen, die in Michael Ibsen beobachtet wurde. Dieser Ansatz ist wieder konservativ wie Michael abgetastet wurde aufgrund seiner bekannten genealogischen Beziehung zu Richard III. Dies führt zu einer LR von 478 darstellt mäßig starke Evidenz für H1.,

We also noted that there were no matches in a database of 26,127 European mitochondrial control region haplotypes (www.empop.org) 29. Wir verlassen uns nicht auf diese Datenbank, weil sie europaweit und nicht spezifisch für England ist und aufgrund von Ermittlungsproblemen, aber sie legt nahe, dass der Skelett-1-Haplotyp viel seltener sein kann, als aus unserer kleineren englischen Datenbank abgeleitet werden kann. Wir stellen auch fest, dass die Mobilität von Frauen im europäischen Adel aufgrund von Ehepraktiken im Zusammenhang mit der Bildung politischer Bündnisse wahrscheinlich viel höher war als für die allgemeine Bevölkerung., Solche Praktiken würden eine gewisse Rechtfertigung für die Verwendung der europäischen mtDNA-Datenbank liefern und daher den in Skeleton 1 und Michael Ibsen gefundenen Haplotyp als äußerst selten betrachten. In der ergänzenden Tabelle 10 zeigen wir einige anschauliche Ergebnisse, die die europäische Datenbank verwenden, um die Auswirkungen der Feststellung zu demonstrieren, dass der Haplotyp Skelett 1 so selten ist, wie von dieser Datenbank vorgeschlagen.

Die LRs für verschiedene Kombinationen der Evidenz und zwei hintere Wahrscheinlichkeiten sind in ergänzender Tabelle 10 dargestellt., Unter Verwendung aller Beweise ist die Unterstützung für H1 mit einem LR von 6.7 Millionen äußerst stark, so dass unser Skeptiker zu dem Schluss kommen würde, dass die Wahrscheinlichkeit, dass Skelett 1 nicht Richard III ist, weniger als 1 in 100.000 ist, während für diejenigen, die eine 1 in 2 Startposition einnehmen, diese Wahrscheinlichkeit viel weniger als 1 in einer Million ist. Unter Berücksichtigung der konservativen Annahmen, die unserer oben beschriebenen Berechnung zugrunde liegen, betrachten wir dies als zweifelsfreie Feststellung der Wahrheit von H1.