estirpes Bacterianas e plasmídeos
As seguintes cepas de E. coli foram utilizados neste estudo: DH5a, BL21(DE3) (Novagen), CLM24, e Origami2(DE3) gmd::kan ΔwaaL. DH5a foi usado para clonagem e purificação de plasmídeos., O BL21(de3) foi utilizado para a expressão e purificação da proteína aceitadora do scFv13-R4DQNAT que foi utilizada em todas as reacções in vitro de glicosilação. CLM24 é um derivado Glico-otimizado de W3110 que carrega uma deleção no gene que codifica a ligase WaaL, facilitando assim a acumulação de glicanos pré-montados em Und-PP36. O CLM24 foi utilizado para a purificação da enzima CjOST, para a extracção orgânica com solvente de todos os glicanos bacterianos resistentes à LLO e para a estirpe de origem para a preparação de extractos com e sem componentes de glicosilação enriquecidos selectivamente., Origami2(DE3) gmd::kan ΔwaaL foi usado para a produção de Man3GlcNAc2-rolamento LLOs e foi gerado pelo sequencial de mutação com P1vir fago transdução utilizando as respectivas cepas de Keio collection62 como doadores, que foram obtidos a partir da Coli Genética Centro de Estoque (CGSC). Em resumo, o lisato dador foi gerado a partir da estirpe JW3597-1 (ΔrfaL734::kan) e a praga resultante foi usada para infectar as células alvo Origami2(DE3)., Após o revestimento de transformadores em placas LB contendo canamicina (Kan), transdutores bem sucedidos foram selecionados e suas cassettes de resistência Kan foram removidas através da transformação com plasmídeo pcp2063 sensível à temperatura. A estirpe resultante, Origami2 (de3) ΔwaaL, foi então utilizada para a eliminação subsequente do gene gmd de acordo com uma estratégia idêntica, mas utilizando a estirpe dadora JW2038-1 (Δgmd751::kan).todos os plasmídeos utilizados no estudo estão listados no quadro complementar 2. Os plasmídeos construídos neste estudo foram feitos usando protocolos de clonagem padrão e confirmados por sequenciação de DNA., Estes incluíram o seguinte. Plasmídeo pJL1-scFv13-R4DQNAT foi gerado pelo primeiro PCR a amplificação do gene que codifica a scFv13-R4DQNAT de pET28a-scFv13-R4(N34L, N77L)DQNAT, onde o N34L e N77L mutações foram introduzidas para eliminar putativo interno glycosylation sites em scFv13-R452. O produto PCR resultante foi então ligado entre os locais de restrição NcoI e SalI em plasmid pJL1, um vetor baseado em pET usado para CFPS49. Plasmídeo pJL1-sfGFP217-DQNAT foi gerado por ligação comercialmente sintetizado fragmento de DNA de codificação sfGFP217-DQNAT (Integrated DNA Technologies) em pJL1., Esta versão do sfGFP contém uma inserção GT adicional após o K214, que estende este loop flexível antes do beta sheet64 final. Neste ciclo flexível, imediatamente após o T216, enxertamos uma sequência de 21 aminoácidos contendo o C. jejuni AcrA N123 glicosilação site34, mas com um sequão dqnat ideal no lugar do sequão Acra nativo. Procedimentos semelhantes foram utilizados para gerar os plasmídeos pJL1-sfGFP217-AQNAT, pJL1-hEPO22-DQNAT-26, pJL1-hEPO36-DQNAT-40, e pJL1-hEPO81-DQNAT-85., No caso de pJL1-hEPO22-DQNAT-26, o gene para EPO humano maduro foi projetado de tal forma que o sequão nativo em N24 foi alterado de 22-AENIT-26 para um ótimo sequão bacteriano, DQNAT. Estratégias idênticas de clonagem foram realizadas para introduzir separadamente os motivos ideais de DQNAT em vez dos sequões hEPO nativos 36-NENIT-40 e 81-LVNSS-85. A expressão recombinante do E. coli O9 primer-adaptador glicano (Man3GlcNAc) em Und-PP foi obtida através da clonagem dos genes que codificam as enzimas WbdB e wbdc manosiltransferase derivadas de E., coli ATCC31616 for assembling the glycan, and RfbK and RfbM, also derived from E. coli ATCC31616 for increasing the pool of available GDP-manose, in E. coli MG1655. Plasmídeo pConYCGmCB foi construído por isotérmica Gibson montagem e codifica uma artificial operon composto de: (i) o fermento glycosyltransferases Alg13, Alg14, Alg1 e Alg2 para Man3GlcNAc2 glycan biosynthesis12 e (ii) a E. coli enzimas phosphomannomutase (ManB) e manose-1-fosfato guanylyltransferase (ManC), que, juntos, aumentar a disponibilidade do PIB-manose substratos para a Alg1 e Alg2 enzimas.,a expressão e purificação proteicas e a purificação da CjPglB foram realizadas de acordo com um protocol34 anteriormente descrito. Brevemente, uma única colônia de E. coli CLM24 carregando plasmídeo pSN1865 foi cultivado durante a noite a 37 °C em 50 mL de Luria-Bertani (LB; 10 g L−1 tryptone, 5 g L−1 de extrato de levedura, 5 g L−1 de NaCl, pH 7,2) suplementado com ampicilina (Amp) e 0,2% (w/v%) a d-glicose. As células da noite foram subculturadas em 1 L de caldo fresco fantástico( TB; 12 g de triptona L−1, extrato de levedura l−1 de 24 g, 0,4% (v/v%) de glicerol, 10% (v/v%) 0,17 m KH2PO4/0.,Tampão fosfato de 72 M K2HPO4), completado com Amp e cultivado até a absorvância a 600 nm (Abs600) atingir um valor de ~0,7. A temperatura de incubação foi ajustada para 16 ° C, após o que a expressão proteica foi induzida pela adição de L-arabinose a uma concentração final de 0,02% (m/v%). A expressão proteica foi autorizada durante 20 h a 16 ° C. As células foram colhidas por centrifugação e depois interrompidas utilizando um homogeneizador (Avestin C5 Emulsiflex). O lisato foi centrifugado para remover os detritos das células e o sobrenadante foi ultracentrifugado (100 000×g) durante 2 h a 4 ° C., O pellet resultante contendo a fração de membrana foi totalmente em suspensão com um Potter-Elvehjem tecido homogenizador em tampão contendo 50 mM de HEPES, 250 mM NaCl, 10% (v/v%) de glicerol, e de 1% (w/v%) de n-dodecil-β-d-maltoside (DDM), pH 7.5. A suspensão foi incubada à temperatura ambiente durante 1 h para facilitar a solubilização do detergente CjPglB a partir de lípidos nativos de E. coli, que foram removidos por ultracentrifugação subsequente (100.000×g) durante 1 h a 4 ° C., O sobrenadante contendo cjpglb DDM-solubilado foi purificado utilizando resina Ni-neta (Termo) de acordo com as especificações do fabricante, com a excepção de que todos os tampões foram suplementados com 1% (M/v%) DDM. A fração de eluição da purificação Ni-NTA foi então submetida a cromatografia de exclusão de tamanho (SEC) usando um sistema FPLC ÄKTA Explorer (GE Healthcare) com coluna Superdex 200 10/300 GL. A proteína purificada foi armazenada numa concentração final de 1-2 mg mL – 1 em tampão de armazenamento OST (50 mM HEPES, 100 mM NaCl, 5% (v/v%) de glicerol, 0, 01% (M / v%) DDM, pH 7, 5) a 4 °C., A concentração de glicerol na amostra foi ajustada para 20% (v/v%) para armazenamento a longo prazo a -80 °C. A depuração da proteína aceitante scFv13-R4DQNAT foi efectuada como descrito anteriormente52. Brevemente, a estirpe BL21(DE3) de E. coli transportando plasmídeo pET28a-scFv13-R4(N34L, N77L)DQNAT foi cultivada em 1 L de TB fornecido com canamicina. A cultura foi incubada a 37 °C até Abs600 alcançado ~0.7, no ponto em que a expressão da proteína foi induzida pela adição de isopropil β-d-1-thiogalactopyranoside (IPTG) para uma concentração final de 0,1 mM. A expressão da proteína foi autorizado a seguir para 20 h a 25 °C., As células foram colhidas e perturbadas de forma idêntica, tal como acima descrito. A proteína scFv13-R4DQNAT foi purificada utilizando resina Ni-neta seguida de SEC de acordo com os protocolos do fabricante. A proteína foi armazenada numa concentração final de 1−2 mg mL-1 em tampão de armazenamento (50 mM HEPES, 250 mM NaCl, 1 mM EDTA, pH 7,5) a 4 °C. A extracção de LLOs
o Protocolo para a extracção com solventes orgânicos de elos a partir das membranas de E. coli foi adaptado a partir de um protocol34, 66 anteriormente descrito., Na maioria dos casos, uma única colónia da estirpe CLM24 transportando um plasmídeo para a biossíntese do glicano-alvo (tabela complementar 2) foi cultivada de um dia para o outro em meio LB. As exceções notáveis foram LLOs de rolamento o W. succinogenes N-glycan (WsLLOs), que foram produzidos usando DH5a células levando o pEpiFOS-5pgl5 fosmid (gentilmente cedido pelo Dr. Markus Aebi), e LLO sbearing Man3GlcNAc2, que foram produzidos usando Origami2(DE3) gmd::kan ΔwaaL células carregando plasmídeo pConYCGmCB. As células Overnight foram subculturadas em 1 L de TB suplementadas com um antibiótico apropriado e cultivadas até o Abs600 atingir ~0.7., A temperatura de incubação foi ajustado para 30 °C para a biossíntese de todos os glycans, exceto para Man3GlcNAc2, que foi ajustado para 16 °C. Para plasmídeo pMW07-pglΔB, a expressão da proteína foi induzida com l-arabinose a uma concentração final de 0,2% (w/v%), enquanto que fosmid pEpiFOS-5pgl5 de indução foi com isopropil β-d-1-thiogalactopyranoside (IPTG) a uma concentração final de 1 mM. Todos os outros plasmídeos envolvidos constitutivo promotores e, portanto, não requerem químicos indutores. Após 16 h, as células foram colhidas por centrifugação e os pellets celulares foram liofilizados para secura completa a -70 °C., Para extração de CjLLOs, nativo e engenharia ClLLOs, E. coli O9 primer-adaptador LLOs, e WsLLOs, o lyophilisates foram suspensos em 10:20:3 volumétrica taxa de CHCl3:CH3OH:H2O solução e incubadas à temperatura ambiente por 15 minutos, para facilitar a extração de LLOs. Para extração do glicano MAN3GLCNAC2 llo sbearing, o liofilizado foi suspenso sucessivamente em 10:20 (v/v%) CHCl3:solução CH3OH, água, e 10:20:3 CHCl3:CH3OH:solução H2O com 15 minutos de incubação à temperatura ambiente entre cada etapa., Em cada caso, a suspensão final foi centrifugada (4000×g) durante 15 minutos, após o que a camada orgânica (camada inferior) foi recolhida e seca com um concentrador de vácuo seguido de liofilização. Lyophilisates contendo active LLOs estavam em suspensão em célula-livre glycosylation tampão (10 mM HEPES, pH 7.5, 10 mM de MnCl2, e de 0,1% (w/v%) DDM) e armazenado a 4 °C.
de Preparação do petróleo bruto S30 extrai
CLM24 fonte de estirpes foram cultivadas em 2×YTPG (10 g L−1 de extrato de levedura, de 16 g L−1 tryptone, 5 g L−1 de NaCl, 7 g L−1 K2HPO4, 3 g L−1 KH2PO4, 18 g L−1 de glicose, pH 7,2) até o Abs600 alcançado ~3., Para gerar OST-enriquecido com extrato de CLM24 carregando plasmídeo pSF-CjPglB, pSF-CcPglB, pSF-DdPglB, pSF-DgPglB, ou pSF-DvPglB52 foi utilizado como fonte de tensão. Para gerar extrato enriquecido com LLO, o CLM24 Carregando plasmídeo pMW07-pglΔB foi usado como a estirpe de origem. Para gerar extrato de um pote contendo OST e LLOs, o CLM24 transportando pMW07-pglΔB e pSF-cjost foi utilizado como estirpe de origem. Conforme necessário, a expressão dos componentes de glicosilação foi induzida com L-arabinose na concentração final de 0, 02% (M/v%)., Após a indução, a expressão proteica foi autorizada a prosseguir a 30 ° C até uma densidade de OD600 ~3, altura em que as células foram colhidas por centrifugação (5000×g) a 4 °C durante 15 minutos. Todas as etapas subsequentes foram realizadas a 4 °C, salvo indicação em contrário. As células granuladas foram lavadas três vezes em tampão S30 (acetato de tris de 10 mM, acetato de magnésio de 14 mM, acetato de potássio de 60 mM, pH 8.2). Após a última lavagem, as células foram granuladas a 7000×g durante 10 minutos e congeladas em azoto líquido. Para fazer lisato, as células foram descongeladas e re-suspensas até à homogeneidade em 1 mL de tampão S30 por 1 g de massa de células húmidas., As células foram interrompidas usando um homogeneizador de alta pressão Avestin Emulsiflex-B15 a 20.000-25.000 psi com uma única passagem. O lisato foi então centrifugado duas vezes a 30.000×g por 30 minutos para remover os detritos celulares. O sobrenadante foi transferido para um novo recipiente e incubado com uma agitação de 250 rpm a 37 °C durante 60 minutos, a fim de degradar as transcrições endógenas de mRNA e perturbar os complexos polissémicos existentes no lisato. Após centrifugação (15 000×g) durante 15 minutos a 4 ° C, o sobrenadante foi recolhido, aliquotado, congelado em azoto líquido e armazenado a -80 °C., O S30 extract foi activo durante cerca de três ciclos de degelo e continha ~40 g de proteína total L-1, medida pelo ensaio de Bradford.
Cell-free glicoproteína síntese
Para in vitro glycosylation purificados acceptor proteína, as reações foram realizadas em 50 µL de volume contendo 3 µg de scFv13-R4DQNAT, 2 µg de purificada CjPglB, e 5 µg extraídos LLOs (no caso de Man3GlcNAc2 LLOs, 20 µg foi usado) em in vitro glycosylation tampão (10 mM HEPES, pH 7.5, 10 mM de MnCl2, e de 0,1% (w/v%) DDM). A mistura de reacção foi incubada a 30 ° C durante 16 horas., Para a expressão de glicoproteínas baseada em extratos brutos, foi implementado um esquema de duas fases. Na primeira fase, a síntese de proteínas foi realizada com um sistema PANOx-SP modificado 67. Especificamente, tubos de microcentrífuga de 1,5 mL foram acusados de 15 µL de reações contendo 200 ng de DNA do plasmídeo, 30% (v/v%) S30 extrair e a seguinte: 12 mM de magnésio glutamato, 10 mM de amónio glutamato, 130 mM de potássio glutamato, 1,2 mM de trifosfato de adenosina (ATP), 0,85 mM de guanosina trifosfato (GTP), 0,85 mM uridine trifosfato (UTP), 0,85 mM citidina trifosfato (CTP), 0.034 mg mL−1 folinic ácido, 0.,171 mg mL−1 E. coli tRNA (Roche), 2 mM de cada um dos 20 aminoácidos, 30 mM phosphoenolpyruvate (PEP, Roche), 0,4 mM de nicotinamida adenina dinucleotídeo (NAD), de 0,27 mM coenzima A (CoA), com 4 mM de ácido oxálico, 1 mM putrescina, 1,5 mM spermidine, e 57 mM HEPES. Para scFv13-R4DQNAT, hEPO22-DQNAT-26, hEPO36-DQNAT-40, e hEPO81-DQNAT85, esta fase foi realizada a 30 °C por 4 h sob condições oxidantes, enquanto para sfGFP217-DQNAT e sfGFP217-AQNAT esta fase foi realizada a 30 °C por 5 min sob condições redutoras., Para condições oxidantes, o extracto foi pré-condicionado com iodoacetamida de 750 µM no escuro à temperatura ambiente durante 30 minutos e a mistura de reacção foi fornecida com glutationa de 200 mM a uma razão de 3:1 entre formas oxidadas e reduzidas. Os rendimentos activos do sfGFP a partir de reacções sem células foram quantificados através da medição da fluorescência em lisato e da conversão em concentração utilizando uma curva padrão, como descrito anteriormente 39. Na segunda fase, a glicosilação proteica foi iniciada pela adição de MnCl2 e DDM a uma concentração final de 10 mM e 0.,1% (M/v%), respectivamente, e autorizado a prosseguir a 30 ° C durante 16 h. Se necessário, as reacções foram complementadas com 2 µg de CjPglB purificado (isto é, para CFGpS com extractos enriquecidos em LLO) ou 5 µg de CjLLOs extraídos com solvente (isto é, para CFGpS com extractos enriquecidos em OST). Todas as reações foram interrompidas pela adição de tampão de amostra de Laemmli contendo 5% ßME, após o que as amostras foram fervidas a 100 °C durante 15 minutos e analisadas pela SDS-PAGE e western blotting.
Western blot analysis
Samples containing 0, 5 µg of acceptor protein were loaded into SDS-PAGE gels., Após a separação electroforética, as proteínas foram transferidas de géis para membranas de Difluoreto de polivinilideno-P (PVDF) (0,45 µm) de acordo com o protocolo do fabricante. As membranas foram lavadas duas vezes com tampão TBS (80 g L−1 de NaCl, 20 g L−1 de KCl, e 30 g L−1 de Tris-base), seguido de incubação por 1 h em solução de bloqueio (50 g L−1 de leite desnatado em TBST (TBS fornecido com 0,05% (v/v%) Tween-20)). Após o bloqueio, As membranas foram lavadas 4 vezes com TBST com 10 minutos de incubação entre cada lavagem., Uma primeira membrana foi sondado com 6xHis-anticorpo policlonal (Abcam, ab137839, 1:7500) que reconhece especificamente hexahistidine epítopo marcas, enquanto uma segunda replicar membrana foi sondado com um dos seguintes: hR6 (1:10000) de soro de coelho que reconhece o nativo C. jejuni e C. lari glycan bem como de engenharia de C. lari glycan ou ConA-HRP (Sigma, L6397, 1:2500) que reconhece Man3GlcNac e Man3GlcNAc2. A sonda das membranas foi realizada durante, pelo menos, 1 h com agitação à temperatura ambiente, após o que as membranas foram lavadas com TBST da mesma forma como descrito acima., Para o desenvolvimento, as membranas foram incubadas brevemente à temperatura ambiente com substrato de ECL Ocidental (BioRad) e fotografadas usando um sistema ChemiDocTM XRS+. As enzimas OST enriquecidas em extractos foram detectadas por um procedimento idêntico de páginas SDS seguido de análise Western blot com um anticorpo policlonal específico da marca EPÍTOPE FLAG (Abcam, ab49763, 1:7500). O componente glicano dos elos enriquecidos em extractos foi detectado através da detecção directa de 10 µL de extractos em membranas nitrocelulose, seguida de detecção com soro hR6. As imagens imunoblot não cortadas são mostradas em Figo suplementar. 8.,a análise
MS
aproximadamente 2 µg de proteína scFv13-R4DQNAT em solução foi desnaturada com 6 m de ureia, reduzida com 10 mM de TDT, incubada a 34 °C durante 1 h, depois alquilada com 58 mM de iodoacetamida durante 45 minutos, no escuro, à temperatura ambiente, e reduzida por 36 mM de TDT final. A solução foi então diluída com bicarbonato de amónio de 50 mM (pH 8, 0) até uma concentração final de 1 m de ureia antes da digestão da tripsina. A amostra foi digerida com 0,2 µg de tripsina durante 18 h a 37 °C. A digestão foi interrompida por adição de TFA a um pH final de 2.2–2.5., As amostras foram então dessalinizadas com cartucho SPE SOLA HRP (ThermoFisher Scientific). Os cartuchos foram condicionados com 1 × 0, 5 mL de 90% de metanol, ácido trifluoroacético a 0, 1% (TFA) e equilibrados com 2 × 0, 5 mL de TFA a 0, 1% (V/v%). As amostras foram diluídas 1: 1 com 0, 2% (V/v%) de TFA e passam lentamente através dos cartuchos. Após lavagem com 2 × 0.5 mL de solução de equilíbrio, os peptídeos foram eluídos por 1 × 0.5 mL de 50% (v/v%) de acetonitrilo (ACN), 0,1% (v/v%) de TFA e secos numa Centrifugadora de vácuo de velocidade.,
a análise nanoLC–MS/MS foi realizada usando UltiMate3000 RSLCnano (Dionex) acoplado a um espectrômetro de massa de fusão Orbitrap (Thermofisher Scientific) equipado com uma fonte de íon Flex de nanospray. Cada amostra foi reconstituído em 22 µL de 0,5% (w/v%) FA e 10 µL foi carregado para uma Aclamação PepMap 100 C18 armadilha coluna (5 µm, 100 µm × 20 mm, 100 Å, ThermoFisher Científica) com nanoViper Acessórios em 20 µL min−1 de 0,5% (FA) na linha de dessalinização., Depois de 2 min, a válvula de comutação para permitir peptídeos ser separados em uma Aclamação PepMap C18 nano coluna (3 µm, 75 µm × 25 cm, ThermoFisher Científica), em 90 min gradiente de 5% a 23% para 35% B a 300 nL min−1 (3 73 a 93 min, respectivamente), seguido por um de 9 min rampa para 90% B, 9 min mantenha-90% de B e rápida troca de 5% de B em 1 min. A coluna foi reequilibrada com 5% B durante 20 minutos antes da próxima corrida. A fusão Orbitrap estava operando em modo iônico positivo com tensão de nanospray definida a 1,7 kV e temperatura de fonte a 275 ° C., A calibração externa para os analisadores de massa FT, IT e quadrupole foi realizada antes da análise. O Orbitrap full MS survey scan (m/z 400-1800) foi seguido por Top 3 S dados-dependente de dissociação mais alta produto de dissociação de colisão ião ativado ETD (HCD-pd-ETD) MS/MS scans para os peptídeos precursores com 2-7 cargas acima de um limiar de íon Contagem de 50.000 com energia de colisão normalizada de 32%., MS inquérito exames foram adquiridas em um poder de resolução de 120.000 (FWHM em m/z 200), com sistema Automático de Gin Controle (AGC) = 2e5 e máximo de injeção (tempo de Max IT) = 50 ms, e HCD MS/MS varreduras com resolução de 30.000 AGC = 5e4, Max IT = 60 ms e com Q o isolamento da janela (m/z) em 3 para os valores de massa m/z 105-2000. Os parâmetros de exclusão dinâmicos foram fixados em 1 com uma duração de exclusão de 60 s com uma largura de massa de exclusão de ±10 ppm. A lista de desencadeadores iónicos consistiu em picos a 204.0867 Da (ião HexNAc oxónio), 138.0545 Da (fragmento HexNAc) e 366.1396 Da (iões Hexnac oxónio)., Se um dos iões do produto HCD da lista tiver sido detectado, duas varreduras ETD MS/MS (etcd) dependentes de carga com ativação suplementar HCD (SA) no mesmo íon precursor foram ativadas e coletadas em uma Armadilha de íons lineares. Por duplamente cobrado precursores, o ETD tempo de reação como o conjunto de 150 ms e a SA de energia foi fixado em 30%, enquanto os mesmos parâmetros de 125 ms e 20%, respectivamente, foram utilizados para mais cobrado precursores. Para ambas as varreduras iônicas, o alvo do reagente ETD fluoranteno foi fixado em 2e5, o alvo AGC em 1e4, o máximo em 105 ms e a janela de isolamento em 3. Todos os dados foram adquiridos usando Xcalibur 3.,0 software de operação e aplicação de fusão da Orbitrap v. 2.1 (ThermoFisher Scientific).todos os espectros em E MS / MS de cada amostra foram pesquisados usando Byonics v. 2.8.2 (Protein Metrics) usando a base de dados proteica de E coli com a sequência-alvo de proteína scFv13-R4DQNAT adicionada. Os parâmetros de pesquisa dos peptídeos foram os seguintes: duas clivagens falhadas para a digestão completa da tripsina com modificação fixa da carbamidometil da cisteína, modificações variáveis da oxidação da metionina e desamidação dos resíduos de asparagina/glutamina., A tolerância à massa do péptido foi de 10 ppm e os valores de tolerância à massa dos fragmentos para os espectros HCD e etcd foram de 0,05 e 0,6 Da, respectivamente. Tanto o número máximo de modificações comuns quanto raras foram definidas em duas. A busca glycan foi realizada contra uma lista de 309 mamíferos n-linked glycans em software Byonic. Os peptídeos identificados foram filtrados para um máximo de 2% de FDR. O software exportou os resultados da pesquisa para uma planilha.
GFP actividade de fluorescência
a actividade de sfGFP derivado sem células foi determinada através de uma análise de fluorescência em liso, como descrito anteriormente 39., Brevemente, 2 µL de reacção sfgfp sintetizada sem células foi diluído em 48 µL de água de nanopura. A solução foi então colocada numa placa de ensaio Costar 96-well black (Corning). Os comprimentos de onda de excitação e emissão para a fluorescência do sfGFP foram de 485 e 528 nm, respectivamente.as placas ELISA (Corning) de 96 poços do Costar foram revestidas durante a noite a 4 °C com 50 µl de 1 mg mL-1 E. coli β−gal (Sigma-Aldrich) em 0,05 M de tampão de carbonato de sódio (pH 9.6)., Após o bloqueio com 5% (m/v%) albumina de soro bovino (BSA) em PBS por 3 h à temperatura ambiente, as placas foram lavadas quatro vezes com PBST tampão (PBS, de 0,05% (v/v%) Tween-20, de 0,3% (w/v%) BSA) e incubadas com diluídas serialmente purificada scFv13-R4 ou amostras solúveis em frações de CFGpS os lisados por 1 h à temperatura ambiente. As amostras foram quantificadas pelo ensaio de Bradford e foi aplicada à placa uma quantidade equivalente de proteína total. Após lavagem quatro vezes com o mesmo tampão, adicionou-se anticorpos policlonais anti-6× – HRP conjugados de coelho (Abcam) em 3% de PBST a cada poço durante 1 h., As placas foram lavadas e desenvolvidas usando protocolos padrão.foram utilizados
ensaio in vitro de proliferação celular
eritroleucemia humana células TF-1 (Sigma) que requerem o factor estimulador de colónias de granulócitos–macrófagos (GM-CSF), interleucina 3 (IL-3) ou hEPO para o crescimento e sobrevivência. As células foram mantidas em RPMI-1640 meios completados com 10% de FBS, 50 U mL−1 penicilina, 50 mg mL-1 estreptomicina, 2 mM glutamina e 2 ng mL−1 GM-CSF a 37 °C numa atmosfera humidificada contendo 5% de CO2., Após a incubação de 16 h em RPMI-1640 meios sem GM-CSF, as células foram contadas, colhidas e ressuspendidas em meios frescos. 5 × 103 células TF-1 por alvéolo foram semeadas numa placa de ensaio de 96 alvéolos e os padrões EPO ou amostras foram adicionados às concentrações finais desejadas para cada alvéolo. As células foram incubadas com 6 h em incubadora úmida antes de adicionar alamarBlue®. Após 12 h, o sinal de fluorescência foi medido a 560 nm/590 nm de excitação/comprimento de onda de emissão.,
disponibilidade de dados
todos os dados gerados durante o estudo estão incluídos neste artigo e nos seus ficheiros de informações suplementares, e estão disponíveis junto dos autores mediante pedido razoável.