locais de laboratório

todo o trabalho de DNA envolvendo os parentes modernos foi realizado na Universidade de Leicester. Os familiares das linhas masculinas foram dactilografados utilizando o Promega PowerPlex Y23 e para o SNPs que definem os principais grupos europeus de Y-haplogroups em Leicester, sendo confirmado um subconjunto da dactilografia na Université Paul Sabatier. Parentes de linha feminina foram sequenciados para todo o genoma mitocondrial na Universidade de Leicester., O DNA foi extraído de antigos dentes e ossos na Universidade de York e na Université Paul Sabatier, Toulouse. A preparação da biblioteca e o enriquecimento alvo foram feitos na Universidade de York. A sequenciação Single-end 100-bp usando um HiSeq 2000 (Illumina, CA, EUA) foi realizada no Copenhagen Sequencing Facility. A sequenciação de DNA moderno e antigo também foi realizada na plataforma técnica genômica PlaGe (Genopole, Toulouse, França) e no Laboratório de Química de ácidos nucleicos proteicos da Universidade de Leicester. Abaixo Nós fornecemos uma versão condensada dos métodos utilizados., Para cada etapa, a informação completa pode ser encontrada nos métodos suplementares. Os pormenores relativos à extensa investigação Genealógica realizada para este projecto podem ser encontrados na Nota complementar 2.a coleta de amostras de DNA foi extraída de amostras de saliva dos parentes modernos de Ricardo III e todos os participantes foram recrutados com consentimento informado após a revisão do projeto pelo Comitê de Ética de pesquisa da Universidade de Leicester.o esqueleto 1 foi escavado e as amostras colhidas em condições limpas 37., Todos os envolvidos nas escavações no local dos Frades cinzentos, no laboratório limpo de Leicester e nos laboratórios e trabalhos de laboratório tiveram os seus cromossomas mitocondriais e, para os machos, cromossomas Y. O DNA foi extraído de amostras de saliva e todos os participantes foram recrutados com consentimento informado.a extracção de ADN de amostras antigas foi extraída de amostras de dentes e ossos (fémur). Todos os procedimentos foram realizados em laboratórios de DNA antigos dedicados na Universidade de York e na Université Paul Sabatier, Toulouse, com as devidas precauções de contaminação em vigor., Dois esboços de extração foram incluídos e tratados exatamente como se fossem extratos ao longo de todo o processo. As experiências com PCRs e bibliotecas também incluíram outros controles em branco.foi utilizado um ensaio de tipagem sexual recentemente concebido, incluindo iniciadores PCR para co-amplificação do fragmento SRY com regiões homólogas UTX e UTY. Este ensaio foi concebido para permitir que fragmentos de SRY, UTX e UTY de tamanho relativamente pequeno fossem Co-amplificados a partir de amostras susceptíveis de conter DNA10 degradados.,

região de controlo Mitocondrial análise do Esqueleto 1

a Análise dos hypervariable segmentos (HV1, HV2 e HV3) do dnamt região de controle foi realizada pela amplificação e diretamente seqüenciamento de vários sobreposição de fragmentos que variam de 153 250 bp em tamanho (http://forensic.yonsei.ac.kr/protocol/mtDNA-midi-mini.pdf)22. Uma seleção de amplicons foi usada para clonar os produtos PCR no laboratório em Toulouse. A sequenciação foi feita usando o grande terminador V3.,1 cycle sequencing kit (Applied Biosystems) and by capillary electroforese on an ABI Prism 3730 Genetic Analyser (Applied Biosystems) at the Protein Nucleic Acid Chemistry Laboratory at the University of Leicester or at the genomic technical platform PlaGe (Genopole).

genoma Mitocondrial/Y-SNP/HIrisplex de digitação do Esqueleto 1

Bibliotecas foram construídas seguinte Meyer e Kircher16, com a exceção de que a primeira etapa de filtração entre o fim brusco de reparação e o adaptador de ligadura foi substituído pelo calor inativação da enzymes38,39., Dois microarrays foram projetados, um para o enriquecimento mtDNA e outro para o enriquecimento nuclear SNP. O enriquecimento do ADN foi realizado por captura de hibridação utilizando o microarray Agilent 244k DNA SureSelect (Agilent, Böblingen, Alemanha). Para a captura nuclear, as sondas de cromossomas Y foram concebidas para cobrir os PND relevantes para as principais linhas14 Europeias. Outras sondas foram projetadas para cobrir os SNPs relevantes para os marcadores HIrisplex31. Estes dois conjuntos de sondas (mitocondrial e SNPs) foram usados separadamente para preencher os dois diferentes projetos de microarray de um formato 1 × 244K., Para cada microarray, o protocolo de captura foi realizado seguindo Hodges et al.15 com as modificações propostas por Zhang et al.40 e Fortes e Paijmans38. As bibliotecas foram agrupadas em quantidades equimolares e sequenciadas em duas faixas da plataforma Illumina HiSeq 2000 em 100 se mode na instalação de sequenciamento da Universidade de Copenhague, Dinamarca.

As leituras em bruto de cada biblioteca foram ordenadas com base no índice de seis nucleótidos usado durante a preparação da biblioteca. Apenas leituras com 100% de correspondência com o índice foram selecionadas para mais análises., Lê-se que menos de 25 nucleótidos foram descartados a partir de análises posteriores. As leituras aparadas foram mapeadas para autossomas e cromossomas sexuais do genoma humano de referência build 37 (GRCh37) e para o rCRS (NC_012920.1) usando bwa 0.7.5 a-r405 (ref. 41). Em cada alinhamento, os arquivos bam de saída foram reunidos usando SAMtools 0.1.19 (ref. 41) e duplicados PCR foram removidos posteriormente. As leituras mapeadas foram filtradas com base em uma qualidade de mapeamento >29 e seu alinhamento a posições únicas ao longo da sequência de referência.,as posições polimórficas foram identificadas usando SAMtools (SAMtools 0.1.19) e bcftools. Por último, vcfutils.pl foi usado para filtrar a lista de variantes de acordo com um genótipo de escala Phred com qualidade de probabilidade posterior >20 e uma profundidade de leitura superior a 10. Para evitar erros devido ao padrão de desaminação de moléculas de DNA antigas, todas as posições polimórficas relatadas no arquivo de saída vcf foram verificadas por olho., No caso do genoma mitocondrial, a montagem para a referência foi visualizada na tabela 42, enquanto o alinhamento das leituras contendo o SNPs para os cromossomos de referência foi visualizado usando IGV43.

SNP tipagem por PCR

A captura de abordagem rendeu cobertura suficiente para todos os HIrisPlex e cromossoma Y SNPs e, portanto, os primers foram desenhados para gerar amplicons contendo estes SNPs, bem como dois SNPs, que definir mais o cromossomo Y haplogroup G: M285 (G1) e P287 (G2) (ref. 14). Estes foram amplificados como parte de reacções multiplexadas após Römpler et al.,44 e sequenciadas na torrente de iões após a preparação da Biblioteca utilizando um kit de teste iónico PGM 200 Xpress e um Kit de sequenciação PGM 200. Para aumentar a cobertura, a PCR singleplex e a sequenciação de um marcador (rs28777) foram realizadas de acordo com Binladen et al.45

ipagem do haplogrupo G que define SNPs (M201, M285 e P287) foi repetida em Toulouse utilizando PCRs singleplex. A sequenciação destes produtos PCR foi realizada usando um terminador de grande Corante V3.,1 cycle sequencing kit (Applied Biosystems) analysed by capillary electroforese on an ABI Prism 3730 Genetic Analyser (Applied Biosystems) at the genomic technical platform PlaGe (Genopole).

Y cromossômicas análise de haplótipos

o Antigo e o moderno amostras de Y-cromossômicas haplótipos foram obtidos utilizando o PowerPlex Y23 System (Promega) e analisados por eletroforese capilar no ABI Prism 3730 Genetic Analyser (applied Biosystems) no genoma plataforma técnica PlaGe (Genopole) e no ABI Prism 3130xl Genetic Analyser (applied Biosystems), na Universidade de Leicester., Para o esqueleto 1, Isto foi realizado em três extratos separados (RM2, LM1 e LM3) em dois diferentes laboratórios de DNA antigos (York e Toulouse). Para os parentes modernos, isto foi realizado em dois extratos diferentes em dois laboratórios diferentes modernos (Leicester e Toulouse).

Y-análise da SNP cromossómica de amostras modernas

após a determinação do haplótipo Y para as amostras de linha masculina modernas, o haplogrupo previsto foi determinado utilizando o predictor do haplogrupo de Whit Athey (http://www.hprg.com/hapest5/hapest5a/hapest5.htm?order=num)., Marcadores binários cobrindo estas e linhagens relacionadas foram digitados em dois multiplexes pelo SNaPshot minissequencing procedure (Applied Biosystems) e um An ABI3130xl Genetic Analyzer (Applied Biosystems) seguido de confirmação usando sequenciação de Sanger. Somerset 3 was determined to be Hg i (M170+ M223−, M253−)14 derived, further confirmed by the lab in Toulouse. Somersets 1,2,4 and 5 were determined to be derived for R1b-U152. Somersets 1,2,4 and 5 were tested for SNPs subdividing this clade13 (Z56, M126, Z36, Z192, M160 and L2) using Sanger sequencing in both labs.,ambas as amostras foram replicadas duas vezes.as amostras foram colhidas utilizando kits de recolha de ADN de Oragene (DNA Genotek) e ADN extraído utilizando dois métodos diferentes: o QIAcube Blood and Body Fluid protocol (200 µl com 200 µl de eluição) e o Oragene protocol. Para analisar a região de controlo, as amostras foram sequenciadas duas vezes, tanto na direcção da frente como na direcção inversa, utilizando dois conjuntos de iniciadores sobrepostos (15973-296 e 16524-614) utilizando o terminador de Corante V 3.1 (sistemas biológicos aplicados). Não foram encontradas diferenças entre os replicados ou entre as amostras.,

Samples were amplified for the complete mitochondrial genome from both extractions following Meyer et al.26 amplicons PCR foram sequenciados em um sequenciador PGM de torrente de íons em um Chip Ion314. As bibliotecas foram preparadas usando o Kit de preparação de fragmentos de íon Xpress mais gDNA, enquanto a preparação de modelos e a sequenciação foram realizadas usando o Kit de Modelagem ion PGM 200 Xpress e o Kit de sequenciação Ion PGM 200, respectivamente. As leituras Raw foram mapeadas de volta para o rCRS (NC_012920.1) usando o software TMAP incluído no plugin de alinhamento iônico 3.2.1 (Torrent Suite Software 3.2.,1) no servidor de torrente de iões. Duplicate reads removal and variant calling were performed using SAMtools 0.1.19 (ref. 41) e o realinhamento local foi realizado com a Ferramenta de análise do genoma Kit46. Sítios variantes foram filtrados para qualidade de Base 20, qualidade de mapeamento 50 e profundidade de cobertura 30, após o que 33 locais polimórficos foram mantidos. Todos esses sites foram verificados e confirmados manualmente pela sequenciação de Sanger em ambas as direções e replicados duas vezes.,

controle de Contaminação e quantificação

Moderna DNA contaminação da antiga permanece era controlada pelos seguintes métodos:

  1. 1

    Escavação foi realizada sob condições de limpeza (ver Métodos Complementares)

  2. 2

    as Amostras foram armazenadas em local limpo e laboratórios, o DNA antigo, o trabalho é realizado apenas na dedicado DNA antigo instalações.

  3. 3

    amostras antigas separadas foram processadas em laboratórios separados para replicar resultados.,

  4. 4

    Todos os membros do Laboratório e participantes de escavação tiveram a sua mtDNA tipada e a tipagem do cromossoma Y foi realizada em todos os homens envolvidos. Nenhum tinha um tipo de cromossoma Y ou mtDNA correspondente.

como evidência contra contaminação significativa, a análise de ADN do esqueleto 1 mostra uma combinação perfeita de mtDNA com o ML1 e uma diferença de base única com o ML2. Ele também mostra um claro haplótipo Y-STR, que foi replicado usando uma série de extratos gerados e testados em dois laboratórios separados., Finalmente, um exame (ver Métodos suplementares) do padrão de substituição em nossas leituras também apoia isso.

análise estatística

tomando uma abordagem conservadora em cada etapa, calculamos uma probabilidade para cada item de evidência observada sob cada uma de duas hipóteses opostas: hipótese 1 (H1): esqueleto 1 é Ricardo III, e hipótese 2 (H2): esqueleto 1 não é Ricardo III.,como era razoável supor que todas as diferentes linhas de evidência eram independentes, a probabilidade conjunta de todas as evidências foi obtida pela multiplicação dos likelihoods individuais sob cada hipótese. O peso dos elementos de prova para o H1, denominado “rácio de probabilidade” (LR), foi então indicado pela relação entre a probabilidade de H1 e a probabilidade de H2. Dizemos que uma suposição é “conservadora” se reduz a RL.

O LR pode ser convertido em uma probabilidade de que H1 é verdadeiro, dada uma probabilidade anterior., Tomamos como ponto de partida o momento em que o esqueleto 1 foi observado e reconhecido pela primeira vez como um esqueleto humano, mas antes de qualquer avaliação da idade, sexo, estado de saúde e causa de morte foram feitas. Neste ponto, há substancial evidência de que um esqueleto encontrado em que se acredita ter sido o local de Leicester Cinza Frades coro poderia ser a de Richard III. Todas as informações disponíveis no momento em que o Esqueleto 1 foi revelada, incluindo a sua localização exacta e a natureza da sepultura, foi considerado para esta análise, como informações de plano de fundo que pode informar a probabilidade anterior., Com base nessa informação, consideramos que um observador céptico não poderia ter atribuído uma probabilidade anterior inferior a 1 em 40. Este valor foi proposto em uma análise anterior (http://rationalgareth.com/), com base no que julgamos ser avaliações céticas. A probabilidade mais elevada que pode ser justificada pelas provas anteriores pode ser de 1 em 2.sempre que possível, utilizámos dados relevantes e disponíveis. Inevitavelmente, são necessários julgamentos subjetivos, por exemplo, as populações de referência relevantes e sobre as probabilidades de erro nos fatos relatados., Na medida do possível e razoável, esforçámo-nos por ser conservadores na nossa abordagem, por exemplo, usando um método de pseudocontagem para influenciar a RL em direcção a um valor neutro de 1, tendendo assim a evitar grandes valores espúrios a partir de frequências baixas observadas. Detalhes dos dados e métodos utilizados na análise estatística dos dados de radiocarbono, idade e sexo do esqueleto, presença de escoliose, presença de feridas perimortem, cromossomas Y e dados de frequência mtDNA podem ser encontrados nos métodos suplementares. Para resumir os resultados: os dados de radiocarbono apresentaram uma relação de probabilidade de 1.,84 representando um apoio limitado para o H1. Os dados relativos à idade e ao sexo revelaram uma taxa de probabilidade de 5,25, representando novamente um apoio limitado à H1. A presença de um ombro mais alto do que o outro, relatada durante a vida de Ricardo, pode ser atribuída à escoliose (esqueleto 1 tinha escoliose idiopática grave adolescente) ou duas outras condições conhecidas, paralisia de Erb e deformidade de Sprengel, ambas muito raras. Em H1, as taxas acima dão uma probabilidade estimada de 0.,90 de observar a escoliose dada a descrição da aparência física de Ricardo III (=a taxa de escoliose dividida pela soma das três taxas), que nós multiplicamos por 0,95 para permitir a possibilidade de que a descrição registrada era incorreta. Isto levou a um LR de 212, proporcionando um apoio moderadamente forte para H1. A presença de lesões perimortem deu um LR de 42, e assim suporte moderado para H1. O cromossoma Y do esqueleto 1 não corresponde ao dos parentes patrilineares determinados genealogicamente de Ricardo III., Isto pode ser explicado por um evento de falsa paternidade em um ou mais dos 19 vínculos pai-filho putativos entre Ricardo III e Henrique Somerset, quinto Duque de Beaufort. Os resultados do cromossoma Y também indicam um outro evento de falsa paternidade entre Henry Somerset e seus cinco descendentes patrilineares contemporâneos. Para ser conservador, selecionamos uma taxa de paternidade falsa publicada que foi (1) menor do que qualquer outra taxa publicada que consideramos 17,47 e (2) com base em dados genealógicos 18., A isto acrescentamos o evento de falsa paternidade nos 19 vínculos pai-filho putativos entre Henry Somerset e cinco somersets masculinos contemporâneos. Isso dá uma probabilidade de pelo menos um falso evento de paternidade nos 19 vínculos pai–filho putativos entre Ricardo III e Henrique Somerset de 0,16. Dado que um evento de falsa paternidade deve ter ocorrido sob H1, a frequência populacional do haplótipo Y do esqueleto 1 é a mesma em H1 e H2 e cancela no cálculo LR. Assim, o LR é 0,16, representando evidências limitadas contra H1.,

As sequências mtDNA do esqueleto 1 e o presumível parente matrilinear de 19-meiose de Ricardo III, Michael Ibsen, corresponderam completamente. Um parente de 21-meiose também correspondeu, exceto em uma base (8994). Esta última observação é igualmente provável sob H1 e H2 dada a sequência observada de Michael Ibsen, e assim cancela no LR. Assim, só precisamos de likelihoods para a observação da sequência partilhada por Michael Ibsen e pelo esqueleto 1.

para obter a probabilidade de H1, precisamos da taxa de mutação mtDNA, e neste caso as estimativas elevadas são conservadoras. Parsons et al.,28 relatem 10 mutações na região de controlo em 327 gerações utilizando dados genealógicos. Como isso sugere uma taxa mais alta do que outras estimativas publicadas, e é baseado em dados genealógicos, nós o usamos para derivar uma probabilidade de 0,52 para nenhuma mutação em 19 meioses.

para a probabilidade de H2, precisamos da fracção populacional do haplótipo esqueleto 1. Embora tenhamos obtido a sequência completa do genoma mtDNA do esqueleto 1, identificamos poucos dados publicados de comparação do genoma integral da Inglaterra., Assim, para a análise estatística, utilizamos apenas as regiões de controle mtDNA entre as posições 16.093 e 16.320 e entre 00073 e 00188, para as quais obtivemos dados de comparação adequados em inglês a partir de uma atualização de Röhl et al.30, complementado com sequências mtDNA fornecidas por raízes para o Real (Genetic Ancestor Ltd., Clare, Suffolk, UK). A utilização de apenas estas secções curtas da região de controlo em H2 é conservadora, uma vez que a fracção populacional das sequências observadas na região de controlo não pode ser inferior à do genoma total do mtDNA., A população de referência relevante é de mais de 500 anos no passado, mas devido ao grande tamanho da população ao longo do período considerado, esperamos que as frequências da população tenham mudado pouco ao longo dos últimos cinco séculos. Descobrimos que a frequência do haplótipo esqueleto 1 era 0 entre 1823 na base de dados, a que adicionamos a única instância observada em Michael Ibsen. Esta abordagem é, mais uma vez, conservadora como Michael foi amostrado devido à sua conhecida relação genealógica com Ricardo III. isto leva a um LR de 478 representando evidências moderadamente fortes para H1. ,

Nós também observou que não houve partidas em um banco de dados de 26,127 Europeu de controlo mitocondrial região haplótipos (www.empop.org)29. Nós não contam com esse banco de dados porque ele está em toda a Europa, ao invés de específicos para a Inglaterra, devido a constatação de problemas, mas ele sugere que o Esqueleto 1 haplótipo pode ser muito mais raro do que pode ser inferida a partir de nossos pequenos inglês de banco de dados. Notamos também que a mobilidade feminina entre a nobreza europeia é provável que tenha sido muito mais elevada do que para a população em geral, devido às práticas matrimoniais relacionadas com a formação da aliança política., Tais práticas forneceriam alguma justificação para a utilização da base de dados europeia mtDNA, e assim para considerar o haplótipo encontrado no esqueleto 1 e Michael Ibsen como sendo extremamente raro. Na tabela complementar 10, mostramos alguns resultados ilustrativos utilizando a base de dados Europeia para demonstrar as implicações de estabelecer que o haplótipo esqueleto 1 é tão raro como sugerido por essa base de dados.

As RL para diferentes combinações da evidência, e duas probabilidades posteriores, são mostradas no quadro suplementar 10., Usando todas as evidências, o suporte para H1 é extremamente forte com um LR de 6,7 milhões, de modo que o nosso cético seria levado à conclusão de que a probabilidade de que o esqueleto 1 não é Ricardo III é inferior a 1 em 100.000, enquanto para aqueles que tomam uma posição inicial de 1 em 2 essa probabilidade é muito menor que 1 em um milhão. Tendo em conta os pressupostos conservadores subjacentes ao nosso cálculo acima descrito, consideramos que isto estabelece a verdade de H1 sem qualquer dúvida razoável.