bacteriestammen en plasmiden

in deze studie werden de volgende E. coli-stammen gebruikt: DH5a, BL21(de3) (Novagen), CLM24 en Origami2(DE3) gmd::kan δwaal. DH5a werd gebruikt voor plasmide het klonen en zuivering., BL21 (DE3) werd gebruikt voor expressie en zuivering van de scfv13-R4DQNAT acceptorproteã ne die in alle in vitro glycosylatiereacties werd gebruikt. CLM24 is een glyco-geoptimaliseerd derivaat van W3110 dat een schrapping in het gen draagt dat de waalligase codeert, waardoor de accumulatie van voorgemonteerde glycanen op Und-PP36 wordt vergemakkelijkt. CLM24 werd gebruikt voor de zuivering van het cjost-enzym, organische extractie op basis van oplosmiddelen van alle LLO-dragende bacteriële glycanen, en de bronst voor het bereiden van extracten met en zonder selectief verrijkte glycosyleringscomponenten., Origami2 (DE3) gmd::kan ΔwaaL werd gebruikt voor de productie van Man3GlcNAc2-dragende LLOs en werd gegenereerd door een sequentiële mutatie met p1vir-faagtransductie waarbij de respectieve stammen uit de Keio-collectie62 als donors werden gebruikt, die werden verkregen uit het Coli Genetic Stock Center (CGSC). In het kort, werd donorlysaat geproduceerd uit stam JW3597-1(ΔrfaL734::kan) en de resulterende faag werd gebruikt om Origami2 (DE3) doelcellen te infecteren., Na het Plateren van transformatoren op lb platen die kanamycine (Kan) bevatten, werden succesvolle transductanten geselecteerd en hun kan resistentiecassettes werden verwijderd door te transformeren met temperatuurgevoelige plasmide pCP2063. De resulterende stam, Origami2 (de3) ΔwaaL, werd vervolgens gebruikt voor de daaropvolgende deletie van het GMD-gen volgens een identieke strategie, maar met behulp van donorstam JW2038-1 (Δgmd751::kan).

alle in het onderzoek gebruikte plasmiden zijn vermeld in aanvullende tabel 2. De plasmiden die in deze studie worden geconstrueerd werden gemaakt gebruikend standaard het klonen protocollen en bevestigd door het rangschikken van DNA., Deze omvatten het volgende. Plasmide pJL1-scFv13-R4DQNAT werd gegenereerd door de eerste PCR-versterking van het gen dat codeert voor scFv13-R4DQNAT uit pET28a-scFv13-R4(N34L, N77L)DQNAT, waar de n34l-en N77L-mutaties werden geïntroduceerd om vermeende interne glycosylatieplaatsen in scFv13-R452 te elimineren. De resulterende PCR product werd vervolgens geligated tussen NCOI en SalI restrictie sites in plasmide pJL1, een pET-gebaseerde Vector gebruikt voor CFPS49. Plasmide pJL1-sfGFP217-DQNAT werd gegenereerd door een commercieel gesynthetiseerd DNA-fragment dat sfGFP217-DQNAT (geïntegreerde DNA-technologieën) codeert in pJL1 te ligeren., Deze versie van sfGFP bevat een extra GT insertion na K214, die deze flexibele lus voor de laatste beta sheet64 uitbreidt. In deze flexibele lus, direct na T216, hebben we een 21-aminozuursequentie geënt die de C. jejuni AcrA N123 glycosylatiesite34 bevat, maar met een optimaal dqnat sequon in plaats van het inheemse AcrA sequon. Soortgelijke procedures werden gebruikt om plasmiden pJL1-sfGFP217-AQNAT, pJL1-hEPO22-dqnat-26, pJL1-hEPO36-dqnat-40 en pJL1-hEPO81-dqnat-85 te genereren., In het geval van pJL1-hEPO22-DQNAT-26 werd het gen voor volwassen humaan EPO zo ontworpen dat het inheemse sequon bij N24 werd veranderd van 22-AENIT-26 naar een optimaal bacterieel sequon, DQNAT. Identieke kloonstrategieën werden uitgevoerd om afzonderlijk optimale dqnat-motieven te introduceren in plaats van de inheemse Hepo-sequons 36-NENIT-40 en 81-LVNSS-85. Recombinante expressie van de E. coli O9 primer-adaptor glycaan (Man3GlcNAc) op Und-PP werd bereikt door het klonen van de genen die coderen voor de wbdb en wbdc mannosyltransferase enzymen afgeleid van E., coli ATCC31616 voor het assembleren van de glycaan, en RfbK en RfbM, ook afgeleid van E. coli ATCC31616 voor het vergroten van de pool van beschikbare GDP-mannose, in E. coli MG1655. Plasmide pConYCGmCB werd gebouwd door isotherme Gibson montage en codeert een kunstmatige operon bestaat uit: (i) de gist glycosyltransferases Alg13, Alg14, Alg1, en Alg2 voor Man3GlcNAc2 glycan biosynthesis12 en (ii) de E. coli-enzymen phosphomannomutase (ManB) en mannose-1-fosfaat guanylyltransferase (ManC), die samen verhogen de beschikbaarheid van het BBP-mannose substraten voor de Alg1 en Alg2 enzymen.,

eiwitexpressie en zuivering

zuivering van CjPglB werd uitgevoerd volgens een eerder beschreven protocol34. In het kort werd een enkele kolonie E. coli CLM24 met plasmide pSN1865 ‘ s nachts bij 37 °C gekweekt in 50 mL Luria-Bertani (LB; 10 g L−1 trypton, 5 g L−1 gistextract, 5 g L−1 NaCl, pH 7,2) aangevuld met ampicilline (Amp) en 0,2% (g/v%) d-glucose. Overnight cellen werden gesubcultureerd in 1 L verse geweldige bouillon (TB; 12 g L-1 trypton, 24 g L-1 gistextract, 0,4% (v/v%) glycerol, 10% (v/v%) 0,17 m KH2PO4/0.,72 M k2hpo4 fosfaatbuffer), aangevuld met Amp en gegroeid tot de absorptie bij 600 nm (Abs600) bereikte een waarde van ~0,7. De incubatietemperatuur werd aangepast aan 16 °C, waarna eiwitexpressie werd geïnduceerd door de toevoeging van L-arabinose aan een uiteindelijke concentratie van 0,02% (w/v%). Eiwitexpressie werd toegestaan om 20 uur bij 16 °C. cellen werden geoogst door middel van centrifugeren en vervolgens verstoord met behulp van een homogenisator (Avestin C5 EmulsiFlex). Het lysaat werd gecentrifugeerd om celresten te verwijderen en het supernatant werd ultracentrifuged (100.000×g) gedurende 2 uur bij 4 °C., De resulterende pellet met de membraanfractie werd volledig geresuspendeerd met een pottenbakker-Elvehjem weefselhomogenisator in buffer met 50 mM HEPES, 250 mM NaCl, 10% (v/v%) glycerol en 1% (w/v%) n-dodecyl-β-d-maltoside (DDM) bij pH 7,5. De suspensie werd gedurende 1 uur bij kamertemperatuur geïncubeerd om de oplosbaarheid van cjpglb in detergenten uit inheemse E. coli-lipiden te vergemakkelijken, die vervolgens door ultracentrifugatie (100.000×g) gedurende 1 uur bij 4 °C werden verwijderd., Het supernatans met DDM-opgeloste CjPglB werd gezuiverd met behulp van Ni – Nta-hars (Thermo) volgens de specificaties van de fabrikant, met uitzondering van alle buffers werden aangevuld met 1% (w/v%) DDM. De elutiefractie van Ni-NTA-zuivering werd vervolgens onderworpen aan size exclusion chromatography (SEC) met behulp van een ÄKTA Explorer fplc-systeem (GE Healthcare) met superdex 200 10/300 GL-kolom. Gezuiverd eiwit werd opgeslagen in een eindconcentratie van 1-2 mg mL – 1 in Ost-opslagbuffer (50 mM HEPES, 100 mM NaCl, 5% (v/v%) glycerol, 0,01% (w/v%) DDM, pH 7,5) bij 4 °C., De glycerolconcentratie in het monster werd aangepast tot 20% (v/v%) voor langdurige opslag bij -80 °C.

zuivering van het acceptoreiwit scFv13-R4DQNAT werd uitgevoerd zoals eerder beschreven 52. Kort, E. coli stam BL21(DE3) dragende plasmide pET28a-scFv13-R4 (N34L, N77L)DQNAT werd gekweekt in 1 L van TB geleverd met kanamycine. De kweek werd geïncubeerd bij 37 °C totdat Abs600 ~ 0,7 bereikte, waarna de eiwitexpressie werd geïnduceerd door toevoeging van isopropyl β-d-1-thiogalactopyranoside (IPTG) aan een uiteindelijke concentratie van 0,1 mM., Cellen werden geoogst en verstoord identiek zoals hierboven beschreven. Het scfv13-R4DQNAT-eiwit werd gezuiverd met behulp van Ni-NTA-hars gevolgd door SEC volgens de protocollen van de fabrikant. Eiwit werd opgeslagen in een eindconcentratie van 1-2 mg mL−1 in opslagbuffer (50 mM HEPES, 250 mM NaCl, 1 mM EDTA, pH 7,5) bij 4 °C.

extractie van LLOs

het protocol voor organische solventextractie van LLOs uit E. coli membranen werd aangepast aan een eerder beschreven protocol34,66., In de meeste gevallen werd een enkele kolonie van Stam CLM24 met een plasmide voor de biosynthese van doelglycaan (aanvullende tabel 2) ‘ s nachts gekweekt in lb media. De uitzonderingen waren LLOs lager de W. succinogenes N-glycan (WsLLOs), die werden geproduceerd met behulp van DH5a cellen dragen de pEpiFOS-5pgl5 fosmid (verzorgd door Dr. Markus Aebi), en LLO sbearing Man3GlcNAc2, die zijn geproduceerd met behulp van Origami2(DE3) gmd::kan ΔwaaL cellen dragen plasmide pConYCGmCB. Overnight cellen werden gesubcultureerd in 1 L TB aangevuld met een geschikt antibioticum en gegroeid tot de Abs600 bereikt ~0,7., De incubatietemperatuur werd aangepast tot 30 °C voor de biosynthese van alle glycanen, behalve voor Man3GlcNAc2, die werd aangepast tot 16 °C. Voor plasmide pMW07-pglΔB werd de eiwitexpressie geïnduceerd met L-arabinose in een eindconcentratie van 0,2% (w/v%), terwijl voor fosmide pEpiFOS-5pgl5 inductie met isopropyl β-d-1-thiogalactopyranoside (IPTG) in een eindconcentratie van 1 mM was. geen chemische inductoren nodig. Na 16 uur werden de cellen geoogst door middel van centrifugering en werden de celkorrels gevriesdroogd tot volledige droogheid bij -70 °C., Voor de extractie van cjllos, native en engineered ClLLOs, E. coli O9 primer-adapter LLOs en WsLLOs werden de lyofilisaten gesuspendeerd in 10:20:3 volumetrische Verhouding van CHCl3:CH3OH:H2o-oplossing en gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur geïncubeerd om de extractie van LLOs te vergemakkelijken. Voor de extractie van LLO sbearing man3glcnac2 glycaan werd lyofilisaat achtereenvolgens gesuspendeerd in 10:20 (v/v%) CHCl3:CH3OH-oplossing, water, en 10:20:3 CHCl3:CH3OH:H2o-oplossing met 15 minuten incubatie bij kamertemperatuur tussen elke stap., In elk geval werd de uiteindelijke suspensie gedurende 15 minuten gecentrifugeerd (4000×g), waarna de organische laag (onderste laag) werd verzameld en gedroogd met een vacuümconcentrator gevolgd door lyofilisatie. Lyophilisates met actieve LLOs werden geresuspendeerd in cel-gratis glycosylation buffer (10 mM HEPES, pH 7,5, 10 mM MnCl2, en 0,1% (w/v%) DDM) en bewaard bij 4 °C.

Voorbereiding van ruwe S30 extracten

CLM24 bron stammen waren gegroeid in 2×YTPG (10 g L−1 gistextract, 16 g L−1 tryptone, 5 g L−1 NaCl, 7 g L−1 K2HPO4, 3 g L−1 KH2PO4, 18 g L−1 glucose, pH 7,2) tot de Abs600 bereikt ~3., Om OST-verrijkt extract te genereren, werd CLM24 dragende plasmide pSF-CjPglB, pSF-CcPglB, pSF-DdPglB, pSF-DgPglB, of pSF-DvPglB52 gebruikt als de bron stam. Om LLO-verrijkt extract te genereren, werd CLM24 dragende plasmide pMW07-pglΔB gebruikt als de bron stam. Om een-pot extract dat zowel OST en LLOs bevat, CLM24 dragen pMW07-pglΔB en pSF-CjOST werd gebruikt als de bron stam te genereren. Indien nodig werd de expressie van glycosyleringscomponenten geïnduceerd met L-arabinose bij een eindconcentratie van 0,02% (g/v%)., Na inductie werd eiwitexpressie toegestaan om bij 30 °C verder te gaan tot een dichtheid van OD600 ~3, op welk punt cellen werden geoogst door centrifugeren (5000×g) bij 4 °C gedurende 15 min. Alle volgende stappen werden uitgevoerd bij 4 °C, tenzij anders vermeld. Gepelleteerde cellen werden driemaal gewassen in S30-buffer (10 mM tris-acetaat, 14 mM magnesiumacetaat, 60 mM kaliumacetaat, pH 8,2). Na de laatste wasbeurt werden de cellen gedurende 10 minuten gepelleteerd bij 7000×g en gevroren op vloeibare stikstof. Om lysaat te maken, werden de cellen ontdooid en geresuspendeerd tot homogeniteit in 1 mL S30-buffer per 1 g natte celmassa., De cellen werden verstoord gebruikend een Avestinemulsiflex-B15 hoge druk homogenisator bij 20,000-25,000 psi met één enkele passage. Het lysaat werd vervolgens tweemaal gecentrifugeerd bij 30.000×g gedurende 30 minuten om celresten te verwijderen. Supernatant werd overgebracht naar een nieuw vat en geïncubeerd met 250 rpm schudden bij 37 °C gedurende 60 min om endogene mRNA transcripten te degraderen en bestaande polysoomcomplexen in het lysaat te verstoren. Na centrifugering (15.000×g) gedurende 15 minuten bij 4 °C werd het supernatant verzameld, aliquoteerd, ingevroren in vloeibare stikstof en opgeslagen bij -80 °C., S30 extract was actief voor ongeveer drie freeze-thaw cycli en bevatte ~40 g L-1 totale eiwit zoals gemeten door Bradford assay.

celvrije glycoproteïnesynthese

voor in vitro glycosylering van gezuiverd acceptoreiwit werden reacties uitgevoerd in een volume van 50 µL met 3 µg scFv13-R4DQNAT, 2 µg gezuiverde CjPglB en 5 µg geëxtraheerde LLOs (in het geval van Man3GlcNAc2 LLOs werd 20 µg gebruikt) in in vitro glycosylatiebuffer (10 mM HEPES, pH 7,5, 10 mM MnCl2, en 0,1% (w/V%) DDM). Het reactiemengsel werd gedurende 16 uur bij 30 ° C geïncubeerd., Voor ruwe extract-gebaseerde expressie van glycoproteïnen werd een tweefasenschema geïmplementeerd. In de eerste fase werd eiwitsynthese uitgevoerd met een gemodificeerd PANOx-SP-systeem67. In het bijzonder werden 1,5 mL microcentrifugebuizen geladen met 15 µL reacties die 200 ng plasmide DNA bevatten, 30% (v/v%) S30 extract en het volgende: 12 mM magnesiumglutamaat, 10 mM ammoniumglutamaat, 130 mM kaliumglutamaat, 1,2 mM adenosinetrifosfaat (ATP), 0,85 mM guanosinetrifosfaat (GTP), 0,85 mM uridinetrifosfaat (UTP), 0,85 mM cytidinetrifosfaat (CTP), 0,034 mg ml-1 folinezuur, 0.,171 mg mL-1 E. coli tRNA (Roche), elk 2 mM van 20 aminozuren, 30 mM fosfoenolpyruvaat (PEP, Roche), 0,4 mM nicotinamide adenine dinucleotide (NAD), 0,27 mM co-enzym-A (CoA), 4 mM oxaalzuur, 1 mM putrescine, 1,5 mM spermidine en 57 mM HEPES. Voor scFv13-R4DQNAT, hEPO22-DQNAT-26, hEPO36-DQNAT-40, en hEPO81-DQNAT85 deze fase werd uitgevoerd bij 30 °C gedurende 4 uur onder oxiderende omstandigheden, terwijl voor sfGFP217-DQNAT en sfGFP217-AQNAT deze fase werd uitgevoerd bij 30 °C gedurende 5 min onder reducerende omstandigheden., Voor oxiderende omstandigheden werd het extract in het donker bij kamertemperatuur gedurende 30 minuten voorgeconditioneerd met 750 µM jodoaceetamide en het reactiemengsel werd geleverd met 200 mM glutathion in een verhouding van 3:1 tussen geoxideerde en gereduceerde vormen. De actieve sfgfp opbrengsten van celvrije reacties werden gekwantificeerd door het meten van fluorescentie in-lysaat en het omzetten in concentratie met behulp van een standaardcurve zoals eerder beschreven 39. In de tweede fase werd de eiwitglycosylering geïnitieerd door de toevoeging van MnCl2 en DDM in een uiteindelijke concentratie van 10 mM en 0.,1% (w/v%), respectievelijk, en toegestaan om te gaan bij 30 °C gedurende 16 uur. indien nodig, reacties werden aangevuld met 2 µg gezuiverd CjPglB (d.w.z., voor CFGpS met LLO-verrijkte extracten) of 5 µg oplosmiddel-geëxtraheerde CjLLOs (d.w.z., voor CFGpS met OST-verrijkte extracten). Alle reacties werden gestopt door het toevoegen van laemmli monsterbuffer met 5% ßME, waarna de monsters werden gekookt bij 100 °C gedurende 15 min en geanalyseerd door SDS-PAGE en western blotting.

Western blot analysis

monsters met 0,5 µg acceptoreiwit werden in SDS-pagina gels geladen., Na elektroforetische scheiding werden eiwitten overgedragen van gels op Immobilon-p polyvinylideendifluoride (PVDF) membranen (0,45 µm) volgens het Protocol van de fabrikant. Membranen werden tweemaal gewassen met TBS−buffer (80 g L−1 NaCl, 20 g L−1 KCL en 30 g L-1 Tris−base) gevolgd door incubatie gedurende 1 uur in blokkeringsoplossing (50 g L-1 vetvrije melk in TBST (TBS geleverd met 0,05% (v/v%) Tween-20)). Na blokkering werden membranen 4 keer gewassen met TBST met 10 minuten incubatie tussen elke wasbeurt., Een eerste membraan werd gesondeerd met 6xHis-polyclonal antilichaam (Abcam, ab137839, 1:7500) dat specifiek hexahistidine epitope tags herkent, terwijl een tweede replicaat membraan werd gesondeerd met een van de volgende: HR6 (1:10.000) serum van konijn dat de inheemse C. jejuni en C. lari glycaan herkent, evenals geconstrueerde C. lari glycaan of ConA-HRP (Sigma, L6397, 1:2500) dat Man3GlcNac en Man3GlcNAc2 herkent. De membranen werden gedurende ten minste 1 uur met schudden bij kamertemperatuur gesondeerd, waarna de membranen op dezelfde wijze als hierboven beschreven met TBST werden gewassen., Voor de ontwikkeling werden membranen kort bij kamertemperatuur geïncubeerd met Western ECL substraat (BioRad) en afgebeeld met behulp van een ChemiDocTM XRS+systeem. Ost enzymen verrijkt in extracten werden gedetecteerd door een identieke SDS-pagina procedure gevolgd door Western blot analyse met een polyclonal antilichaam specifiek voor de vlag epitope tag (Abcam, ab49763, 1: 7500). De glycaancomponent van LLOs verrijkt met extracten werd gedetecteerd door 10 µL extracten direct op nitrocellulosemembranen te spotten, gevolgd door detectie met HR6-serum. Uncropped immunoblot beelden worden weergegeven in aanvullende Fig. 8.,

MS-analyse

ongeveer 2 µg scFv13-R4DQNAT-eiwit in oplossing werd gedenatureerd met 6 M ureum, gereduceerd met 10 mM DTT, geïncubeerd bij 34 °C gedurende 1 uur, vervolgens gealkyleerd met 58 mM joodaceetamide gedurende 45 minuten in het donker bij kamertemperatuur en gedoofd met uiteindelijke 36 mM DTT. De oplossing werd vervolgens verdund met 50 mM ammoniumbicarbonaat (pH 8,0) tot een uiteindelijke bufferconcentratie van 1 m ureum vóór de vertering van trypsine. Het monster werd verteerd met 0,2 µg trypsine gedurende 18 uur bij 37 °C. de spijsvertering werd gestopt door toevoeging van TFA aan een uiteindelijke pH 2,2–2,5., De monsters werden vervolgens ontzouten met SOLA HRP SPE Cartridge (ThermoFisher Scientific). De patronen werden geconditioneerd met 1 × 0,5 mL 90% methanol, 0,1% trifluorazijnzuur (TFA) en in evenwicht gebracht met 2 × 0,5 mL 0,1% (v/V%) TFA. De monsters werden 1:1 verdund met 0,2% (v/v%) TFA en liepen langzaam door de patronen. Na het wassen met 2 × 0,5 mL equilibratieoplossing werden peptiden geëlueerd met 1 × 0,5 mL van 50% (v/v%) acetonitril (ACN), 0,1% (v/v%) TFA en gedroogd in een speed vacuümcentrifuge.,

de nanoLC-MS / MS-analyse werd uitgevoerd met UltiMate3000 RSLCnano (Dionex) gekoppeld aan een Orbitrap Fusion (Thermofisher Scientific) massaspectrometer uitgerust met een nanospray Flex-Ionenbron. Elk monster werd gereconstitueerd in 22 µL 0,5% (w/v%) FA en 10 µL werd geladen in een Pepmap 100 C18−valkolom (5 µm, 100 µm × 20 mm, 100 Å, Thermofisher Scientific) met nanoViper-Fittings bij 20 µL min-1 van 0,5% FA voor online ontzouting., Na 2 minuten schakelde de Klep over om peptiden te scheiden op een Acclaim PepMap C18 nano kolom (3 µm, 75 µm × 25 cm, Thermofisher Scientific), in een 90 min gradiënt van 5 tot 23% tot 35% B bij 300 nL min−1 (3 tot 73 tot 93 min, respectievelijk), gevolgd door een 9 min hellingshoek naar 90% B, een 9 min hold bij 90% B en een snelle schakelaar naar 5% B in 1 min. De kolom werd opnieuw in evenwicht gebracht met 5% B gedurende 20 minuten voorafgaand aan de volgende run. De Orbitrap-fusie werkte in positieve ionmodus met nanospray-spanning ingesteld op 1,7 kV en brontemperatuur op 275 °C., Externe kalibratie voor FT, IT en quadrupole massa analyzers werd uitgevoerd voorafgaand aan de analyse. De Orbitrap full MS survey scan (m/z 400-1800) werd gevolgd door top 3 s data-dependent Higher Collision dissociation product ion triggered ETD (HCD-pd-ETD) MS / MS scans voor precursor peptiden met 2-7 ladingen boven een drempel ion telling van 50.000 met genormaliseerde botsing energie van 32%., Ms survey scans werden verkregen met een oplossend vermogen van 120.000 (FWHM bij M/Z 200), met automatische Gin Control (AGC) = 2e5 en maximale injectietijd (Max IT) = 50 ms, en HCD MS/MS scans met een resolutie van 30.000 met AGC = 5e4, Max IT = 60 ms en met Q isolatievenster (m/z) bij 3 Voor het massabereik m/z 105-2000. Dynamische uitsluitingsparameters werden ingesteld op 1 binnen 60 s uitsluitingsduur met ± 10 ppm uitsluitingsmassabreedte. Product Ion trigger list bestond uit pieken bij 204.0867 Da (HexNAc oxonium ion), 138.0545 Da (HexNAc fragment), en 366.1396 Da (HexHexNAc oxonium ionen)., Als een van de HCD-productionen in de lijst werd gedetecteerd, werden twee ladingsafhankelijke ETD MS/MS-scans (EThcD) met HCD-aanvullende activering (SA) op dezelfde precursor-ion geactiveerd en verzameld in een lineaire ionenval. Voor precursoren met dubbele lading werd de EBR-reactietijd vastgesteld op 150 ms en de SA-energie op 30%, terwijl dezelfde parameters op respectievelijk 125 ms en 20% werden gebruikt voor precursoren met hogere lading. Voor beide ionen veroorzaakte aftasten, werd het doel van de fluorantheen ETD-reagens geplaatst bij 2e5, AGC-doel bij 1e4, maximum het bij 105 lidstaten en isolatievenster bij 3. Alle gegevens werden verkregen met behulp van Xcalibur 3.,0 operatiesoftware en Orbitrap Fusion Tune applicatie v. 2.1 (Thermofisher Scientific).

alle MS-en MS/MS-RAW-spectra van elk monster werden doorzocht met behulp van Byonics v. 2.8.2 (Eiwitmetingen) met behulp van de E coli-eiwitdatabase met toegevoegde scFv13-R4DQNAT-eiwitdoelsequentie. De peptide zoekparameters waren als volgt: twee gemiste splitsing voor volledige trypsine spijsvertering met vaste carbamidomethyl modificatie van cysteïne, variabele modificaties van methionine oxidatie en deamidatie op asparagine/glutamine residuen., De peptide massa tolerantie was 10 ppm en fragment massa tolerantie waarden voor HCD en EThcD spectra waren 0,05 en 0,6 Da, respectievelijk. Zowel het maximum aantal gemeenschappelijke als zeldzame wijzigingen werd vastgesteld op twee. Het glycaanonderzoek werd uitgevoerd tegen een lijst van 309 zoogdiern-gelinkte glycanen in Byonische software. Geà dentificeerde peptiden werden gefilterd voor maximum 2% FDR. De software exporteerde de resultaten van de zoekopdracht naar een spreadsheet.

GFP-fluorescentieactiviteit

de activiteit van Cell-free-derived sfGFP werd bepaald met behulp van een in-lysaat-fluorescentieanalyse zoals eerder beschreven 39., Kort, werd 2 µL cel-vrije gesynthetiseerde geglycosyleerde sfGFP reactie verdund in 48 µL nanopurewater. De oplossing werd vervolgens in een costar 96-well black assay plate (Corning) geplaatst. Excitatie en emissie golflengten voor sfGFP fluorescentie waren 485 en 528 nm, respectievelijk.

Enzyme-linked immunosorbent analysis (ELISA)

Costar 96-well ELISA−platen (Corning) werden gedurende de nacht bij 4 °C gecoat met 50 µl 1 mg mL-1 E. coli β-gal (Sigma-Aldrich) in 0,05 M natriumcarbonaatbuffer (pH 9,6)., Na blokkering met 5% (g/v%) bovine serum albumine (BSA) in PBS gedurende 3 uur bij kamertemperatuur, werden de platen vier keer gewassen met PBST-buffer (PBS, 0,05% (v/v%) Tween-20, 0,3% (g/v%) BSA) en geïncubeerd met serieel verdunde gezuiverde scFv13-R4-monsters of oplosbare fracties van CFGpS-lysaten gedurende 1 uur bij kamertemperatuur. De monsters werden gekwantificeerd door de Bradford-test en een equivalente hoeveelheid totaal eiwit werd op de plaat aangebracht. Na vier keer wassen met dezelfde buffer, werd anti-6×-His-HRP geconjugeerd konijn polyclonal antilichaam (Abcam) in 3% PBST toegevoegd aan elk putje gedurende 1 uur., Platen werden gewassen en ontwikkeld met behulp van standaardprotocollen.

in vitro celproliferatietest

Humane erytroleukemie Tf-1–cellen (Sigma) die granulocyt-macrofaagkoloniestimulerende factor (GM-CSF), interleukine 3 (IL-3) of hEPO nodig hebben voor groei en overleving werden gebruikt. Cellen werden gehandhaafd in rpmi-1640 media aangevuld met 10% FBS, 50 U mL−1 penicilline, 50 mg ml−1 streptomycine, 2 mM glutamine en 2 ng mL−1 GM-CSF bij 37 °C in een bevochtigde atmosfeer met 5% CO2., Na 16 uur incubatie in rpmi-1640 media zonder GM-CSF, werden cellen geteld, geoogst en geresuspendeerd in verse media. 5 × 103 TF-1 cellen per putje werden gezaaid in een 96-well assay plaat, en EPO normen of monsters werden toegevoegd aan de uiteindelijke gewenste concentraties aan elk putje. Cellen werden gedurende 6 uur geïncubeerd in een vochtige incubator voordat alamarBlue®werd toegevoegd. Na 12 uur werd het fluorescentiesignaal gemeten bij 560 nm/590 nm excitatie / emissiegolflengte.,

beschikbaarheid van gegevens

alle gegevens die tijdens de studie zijn gegenereerd, zijn opgenomen in dit artikel en de aanvullende informatiebestanden en zijn op redelijk verzoek beschikbaar bij de auteurs.