Laboratoriumlocaties

alle DNA-onderzoeken met betrekking tot de moderne familieleden werden uitgevoerd aan de Universiteit van Leicester. Man-lijn verwanten werden getypt gebruikend Promega PowerPlex Y23 en voor SNPs bepalende naar de belangrijkste Europese Y-haplogroups ter Leicester met te subset van naar de typering wezen bevestigd ter naar de Université Paul Sabatier. Vrouwelijke-lijn familieleden werden sequenced voor het gehele mitochondriale genoom aan de Universiteit van Leicester., DNA werd gewonnen uit oude tanden en botten aan de Universiteit van York en de Université Paul Sabatier, Toulouse. Bibliotheekvoorbereiding en doelverrijking werden gedaan aan de Universiteit van York. Single-end 100-bp het rangschikken gebruikend een Hiseq 2000 (Illumina, CA, USA) werd uitgevoerd bij de het rangschikken faciliteit van Kopenhagen. Het doelgerichte rangschikken van zowel modern als oud DNA werd ook uitgevoerd bij genomic technisch platform PlaGe (Genopole, Toulouse, Frankrijk) en bij het laboratorium van de Eiwitnucleic zuur chemie aan de Universiteit van Leicester. Hieronder geven we een verkorte versie van de gebruikte methoden., Voor elke stap is volledige informatie te vinden in de aanvullende methoden. Details over het uitgebreide genealogisch onderzoek dat Voor dit project is uitgevoerd, zijn te vinden in de aanvullende aantekening 2.

monsterverzameling

DNA werd geëxtraheerd uit speekselmonsters van de moderne familieleden van Richard III en alle deelnemers werden met geïnformeerde toestemming aangeworven na projectbeoordeling door de University of Leicester Research Ethics Committee.

skelet 1 werd uitgegraven en monsters werden onder schone omstandigheden genomen 37., Iedereen die betrokken was bij de opgraving op de Grey Friars site, het clean laboratory in Leicester en degenen die betrokken waren bij de laboratoria en het laboratoriumwerk lieten hun mitochondriale en, voor mannen, Y-chromosomen typeren. DNA werd gewonnen uit speeksel monsters en alle deelnemers werden gerekruteerd met geà nformeerde toestemming.

DNA-extractie van oude monsters

DNA werd geëxtraheerd uit tanden-en botmonsters (femur). Alle procedures werden uitgevoerd in speciale oude DNA-laboratoria aan de Universiteit van York en de Université Paul Sabatier, Toulouse met de juiste voorzorgsmaatregelen voor besmetting., Twee extractie blanks werden opgenomen en precies behandeld alsof het extracten waren gedurende het hele proces. PCR ‘ s en bibliotheekexperimenten omvatten ook verdere blanco controles.

Geslachtstyperingstest uitgevoerd op skelet 1

een nieuw ontworpen geslachtstyperingstest bestaande uit PCR-primers voor co-amplificatie van het SRY-fragment met UTX-en UTY-homologe gebieden werd gebruikt. Deze analyse werd ontworpen om vrij kleine formaatfragmenten van SRY, UTX en UTY toe te laten om van steekproeven worden mede-versterkt waarschijnlijk om gedegradeerde DNA10 te bevatten.,

mitochondriale controle Regio analyse van skelet 1

analyse van de hypervariabele segmenten (HV1, HV2 en HV3) van de mtDNA controle regio werd uitgevoerd door het versterken en direct sequencen van meerdere overlappende fragmenten variërend van 153 tot 250 bp in grootte (http://forensic.yonsei.ac.kr/protocol/mtDNA-midi-mini.pdf)22. Een selectie van amplicons werd gebruikt voor het klonen van de PCR-producten in het lab in Toulouse. Het rangschikken werd uitgevoerd gebruikend groot-kleurstof Terminator V3.,1 cycle sequencing kit (Applied Biosystems) en door capillaire elektroforese op een ABI Prism 3730 Genetic Analyser (Applied Biosystems) bij het Eiwitnucleic Acid Chemistry Laboratory aan de Universiteit van Leicester of op het genomic technical platform PlaGe (Genopole).

mitochondriale genoom/Y-SNP/HIrisplex typering van skelet 1

bibliotheken werden gebouwd na Meyer en Kircher16, met uitzondering van het feit dat de eerste filtratiestap tussen de stompe eind reparatie en de adapter ligatie werd vervangen door warmte-inactivatie van de enzymen38,39., Twee microarrays werden ontworpen, één voor de mtDNA-verrijking en een andere voor nucleaire SNP-verrijking. De verrijking van DNA werd uitgevoerd door kruisingvangst gebruikend Agilent 244k DNA sureselect microarray (Agilent, Böblingen, Duitsland). Voor de nucleaire vangst werden y-chromosoomsondes ontworpen om de SNP ‘ s te bestrijken die relevant zijn voor de belangrijkste Europese lijnen14. Verdere sondes werden ontworpen om de SNPs relevant voor de hirisplex31 markers te dekken. Deze twee sets van sondes (mitochondriale en SNPs) werden afzonderlijk gebruikt om de twee verschillende microarray ontwerpen van een 1 × 244K formaat te vullen., Voor elke microarray, werd het vangstprotocol uitgevoerd na Hodges et al.15 met de wijzigingen voorgesteld door Zhang et al.40 en Fortes en Paijmans38. De bibliotheken werden samengevoegd in equimolaire hoeveelheden en gesequenced op twee rijstroken van het Illumina hiseq 2000 platform in 100 se mode in de sequencing faciliteit van de Universiteit van Kopenhagen, Denemarken.

de ruwe reads van elke bibliotheek werden gesorteerd op basis van de zes-nucleotide index die werd gebruikt tijdens de bibliotheekvoorbereiding. Alleen reads met een 100% match met de index werden geselecteerd voor verdere analyses., Reads korter dan 25 nucleotiden werden verworpen van verdere analyse. De bijgesneden reads werden in kaart gebracht aan autosomen en geslacht chromosomen van de menselijke referentie genoom build 37 (GRCh37) en aan de rCRS (NC_012920.1) met behulp van bwa 0.7.5 a-r405 (ref. 41). In elke uitlijning werden de uitvoer bam bestanden samengevoegd met SAMtools 0.1.19 (ref. 41) en PCR duplicaten werden vervolgens verwijderd. De afgebeelde reads werden gefilterd op basis van een afbeeldingskwaliteit >29 en hun uitlijning naar unieke posities langs de referentiesequentie.,

polymorfe posities werden geïdentificeerd met behulp van SAMtools (SAMtools 0.1.19) en bcftools. Tot slot, vcfutils.pl werd gebruikt om de lijst van varianten te filteren volgens een Phred-scaling genotype posterior probability quality > 20 en een leesdiepte hoger dan 10. Om miscalling vanwege het deaminatiepatroon van oude DNA-moleculen te voorkomen, werden alle polymorfe posities gerapporteerd in het VCF-uitvoerbestand gecontroleerd met het oog., In het geval van het mitochondriale genoom, werd de assemblage aan de verwijzing gevisualiseerd in Tablet42, terwijl de uitlijning van Leest die SNPs aan de referentiechromosomen bevatten werd gevisualiseerd gebruikend IGV43.

SNP typeren door PCR

De capture benadering leverde onvoldoende dekking voor alle HIrisPlex en Y-chromosoom SNPs en daarom primers werden ontworpen voor het genereren van amplicons bevatten deze SNPs evenals twee SNPs, die verder Y-chromosoom haplogroup g definiëren: M285 (G1) en P287 (G2) (ref. 14). Deze werden versterkt als onderdeel van multiplexreacties na Römpler et al.,44 of singleplex reacties (met behulp van 40 cycli en zonder secundaire versterking) en gesequenced op de Ion Torrent na bibliotheekvoorbereiding met behulp van Ion PGM 200 Xpress Template Kit en PGM 200 Sequencing Kit. Om de dekking te vergroten, werd singleplex PCR en sequencing van één marker (rs28777) uitgevoerd volgens Binladen et al.45

typen van de haplogroup g definiëren SNPs (M201, M285 en P287) werd herhaald in Toulouse gebruik singleplex PCRs. Het rangschikken van deze PCR-producten werd uitgevoerd gebruikend groot-kleurstof Terminator V3.,1 cycle sequencing kit (Applied Biosystems) geanalyseerd door capillaire elektroforese op een ABI Prism 3730 Genetic Analyser (Applied Biosystems) op het genomic technical platform PlaGe (Genopole).

y-chromosomale haplotypeanalyse

oude en moderne monsters’ Y-chromosomale haplotypes werden verkregen met behulp van het PowerPlex Y23-systeem (Promega) en geanalyseerd met capillaire elektroforese op een ABI-Prism 3730 genetische analysator (Applied Biosystems) op het genomische technische platform PlaGe (Genopole) en op een ABI-Prism 3130xl genetische analysator (Applied Biosystems) aan de Universiteit van Leicester., Voor skelet 1 werd dit uitgevoerd op drie afzonderlijke extracten (RM2, LM1 en LM3) in twee verschillende oude DNA-laboratoria (York en Toulouse). Voor de moderne verwanten werd dit uitgevoerd op twee verschillende extracten in twee verschillende moderne laboratoria (Leicester en Toulouse).

Y-chromosomale SNP analyse van moderne samples

volgende bepaling van de Y-haplotype voor de moderne man-lijn monsters, de voorspelde haplogroup was bepaald gebruik Whit Athey ‘haplogroup predictor (http://www.hprg.com/hapest5/hapest5a/hapest5.htm?order=num)., De binaire tellers die deze en verwante lijnen behandelen werden getypt in twee multiplexen door de procedure van SNaPshot minisequencing (Toegepaste Biosystems) en een ABI3130xl genetische Analyzer (Toegepaste Biosystems) die door bevestiging wordt gevolgd gebruikend sanger het rangschikken. Somerset 3 werd vastgesteld als Hg I (M170+ M223−, M253−)14 afgeleid, verder bevestigd door het lab in Toulouse. Somersets 1,2,4 en 5 werden bepaald te worden afgeleid voor R1b-U152. Somersets 1,2,4 en 5 werden getest voor SNPs die deze clade13 onderverdelen (Z56, M126, Z36, Z192, M160 en L2) gebruikend sanger rangschikken in beide laboratoria.,

moderne mtDNA-analyse

beide monsters werden tweemaal gerepliceerd.

monsters werden genomen met behulp van Oragene DNA Collection kits (DNA Genotek) en DNA geëxtraheerd met behulp van twee verschillende methoden: het Qiacube bloed en lichaamsvloeistof protocol (200 µl met 200 µl elutie) en het Oragene protocol. Om het controlegebied te analyseren, werden de monsters tweemaal gesequenced in zowel voorwaartse als omgekeerde richting met behulp van twee overlappende primersets (15973-296 en 16524-614) met behulp van Big-Dye Terminator V 3.1 (Applied Biosystems). Er werden geen verschillen gevonden tussen duplo ‘ s of tussen monsters.,

monsters werden versterkt voor het volledige mitochondriale genoom uit beide extracties volgend op Meyer et al.26 PCR amplicons werden gesequenced op een Ion Torrent PGM Sequencer op een Ion314 Chip. De bibliotheken werden voorbereid gebruikend de ionenxpress Plus de Voorbereidingsuitrusting van de de Fragmentbibliotheek van gDNA, terwijl de malplaatjevoorbereiding en het rangschikken werden uitgevoerd gebruikend de Ionenpgm 200 Xpress Malplaatjeuitrusting en de Ionenpgm 200 rangschikkend uitrusting, respectievelijk. Raw reads werden teruggekoppeld naar de rCRS (NC_012920.1) met behulp van TMap software opgenomen in de Ion Alignment plugin 3.2.1 (Torrent Suite Software 3.2.,1) op de Ion Torrent server. Duplicaat reads verwijdering en variant bellen werden uitgevoerd met behulp van SAMtools 0.1.19 (ref. 41) en lokale realigning werd uitgevoerd met de Genome Analysis Toolkit46. Variant sites werden gefilterd voor basiskwaliteit 20, Mapping Kwaliteit 50 en diepte van de dekking 30 waarna 33 polymorfe sites werden behouden. Al deze plaatsen zijn handmatig gecontroleerd en bevestigd door sanger die in beide richtingen rangschikken en tweemaal herhaald.,

contaminatie controle en kwantificering

moderne DNA-contaminatie van de oude resten werd gecontroleerd met de volgende methoden:

  1. 1

    graafwerk werd uitgevoerd onder schone omstandigheden (zie aanvullende methoden)

  2. 2

    monsters werden opgeslagen in schone laboratoria en DNA-onderzoek in de oude tijd werd alleen uitgevoerd in speciale DNA-faciliteiten.

  3. 3

    afzonderlijke antieke monsters werden in afzonderlijke laboratoria verwerkt om de resultaten te repliceren.,

  4. 4

    bij alle lableden en deelnemers aan de opgraving werd mtDNA getypt en bij alle betrokken mannen werd y-chromosoomtypering uitgevoerd. Geen had een passend mtDNA-of Y-chromosoomtype.

als bewijs tegen significante contaminatie toont DNA-analyse van skelet 1 een perfecte mtDNA overeenkomst met ML1 en een single-base verschil met ML2. Het toont ook een duidelijk y-STR haplotype, dat is gerepliceerd met behulp van een aantal extracten gegenereerd en getest in twee afzonderlijke laboratoria., Ten slotte ondersteunt een onderzoek (zie aanvullende methoden) van het substitutiepatroon in onze reads dit ook.

statistische analyse

uitgaande van een conservatieve benadering bij elke stap, berekenden we een waarschijnlijkheid voor elk item van waargenomen bewijs onder elk van twee tegengestelde hypothesen: hypothese 1 (H1): skelet 1 is Richard III, en hypothese 2 (H2): skelet 1 is niet Richard III.,aangezien redelijkerwijs kon worden aangenomen dat alle verschillende bewijselementen onafhankelijk waren, werd de gezamenlijke waarschijnlijkheid van al het bewijsmateriaal verkregen door vermenigvuldiging van de individuele waarschijnlijkheden onder elke hypothese. Het gewicht van het bewijs voor H1, genaamd de waarschijnlijkheid ratio (LR), werd vervolgens gegeven door de verhouding van de waarschijnlijkheid onder H1 tot die onder H2. We zeggen dat een aanname ‘conservatief’ is als het de LR verlaagt.

de LR kan worden omgezet in een waarschijnlijkheid dat H1 waar is, gegeven een eerdere waarschijnlijkheid., We namen als uitgangspunt het moment dat skelet 1 Voor het eerst werd waargenomen en herkend als een menselijk skelet, maar voordat enige beoordeling van leeftijd, geslacht, gezondheidstoestand en doodsoorzaak werd gemaakt. Op dat moment was er substantieel bewijs dat een skelet gevonden in wat vermoedelijk de locatie was van het Leicester Grey Friars choir dat van Richard III zou kunnen zijn. alle informatie die beschikbaar was op het moment dat skelet 1 werd opgegraven, inclusief de precieze locatie en de aard van het graf, werd voor deze analyse beschouwd als achtergrondinformatie die de eerdere waarschijnlijkheid kan informeren., Op basis van die informatie zijn wij van mening dat een sceptische waarnemer redelijkerwijs geen eerdere waarschijnlijkheid van minder dan 1 op 40 had kunnen vaststellen. Deze waarde werd voorgesteld in een eerdere analyse (http://rationalgareth.com/), gebaseerd op wat wij als sceptische beoordelingen beschouwen. De hoogste waarschijnlijkheid die door het voorafgaande bewijs kan worden gerechtvaardigd, zou 1 op 2 kunnen zijn.

waar mogelijk hebben we relevante, beschikbare gegevens gebruikt. Onvermijdelijk zijn subjectieve oordelen vereist, bijvoorbeeld de relevante referentiepopulaties en over de kans op fouten in gerapporteerde feiten., Voor zover mogelijk en redelijk leek, streefden we naar conservatief te zijn in onze benadering, bijvoorbeeld door een pseudocountmethode te gebruiken om de LR te vertekenen naar een neutrale waarde van 1, waardoor we de neiging hadden om valse grote waarden van lage waargenomen frequenties te vermijden. Details van de gegevens en methoden die worden gebruikt bij de statistische analyse van de gegevens over koolstof, leeftijd en geslacht van het skelet, aanwezigheid van scoliose, aanwezigheid van perimortem wonden, Y-chromosoom en mtDNA frequentie gegevens kunnen worden gevonden in de aanvullende methoden. Om de resultaten samen te vatten: de koolstofgegevens leverden een waarschijnlijkheidsratio van 1 op.,84 die beperkte steun voor H1 vertegenwoordigt. De leeftijd en het geslacht gegevens leverden een waarschijnlijkheid rantsoen van 5,25, wederom een beperkte ondersteuning voor H1. De aanwezigheid van een schouder hoger dan de andere, gemeld tijdens Richard ’s leven, kan worden toegeschreven aan scoliose (skelet 1 had ernstige idiopathische puber-onset scoliose) of twee andere bekende aandoeningen, Erb’ s verlamming en Sprengel ‘ s misvorming, die beide zeer zeldzaam zijn. Onder H1 geven bovenstaande percentages een geschatte waarschijnlijkheid van 0.,90 van het observeren van scoliose gegeven de beschrijving van Richard III ‘ s fysieke verschijning (=de scoliose snelheid gedeeld door de som van de drie tarieven), die we vermenigvuldigd met 0,95 om rekening te houden met de mogelijkheid dat de geregistreerde beschrijving onjuist was. Dit leidde tot een LR van 212, die matig sterke ondersteuning voor H1. De aanwezigheid van perimortem verwondingen gaf een LR van 42, en dus matige ondersteuning voor H1. Het Y-chromosoom van skelet 1 kwam niet overeen met dat van genealogisch bepaalde patrilineale familieleden van Richard III., Dit kan worden verklaard door een foutieve vaderschapsgebeurtenis in een of meer van de 19 vermeende vader-zoon banden tussen Richard III en Henry Somerset, vijfde Hertog van Beaufort. De resultaten van het Y-chromosoom wijzen ook op een andere fout-vaderschap gebeurtenis tussen Henry Somerset en zijn vijf hedendaagse, veronderstelde patrilineaire afstammelingen. Om conservatief te zijn,selecteerden we een gepubliceerd fout vaderschap percentage dat (1) lager was dan elk ander gepubliceerd percentage dat we beschouwden 17, 47 en (2) op basis van genealogische gegevens18., Hieraan voegen we de fout-vaderschap gebeurtenis toe in de 19 vermeende vader–zoon banden tussen Henry Somerset en vijf hedendaagse mannelijke Somersets. Dit geeft een waarschijnlijkheid van ten minste één valse vaderschapsgebeurtenis in de 19 veronderstelde Vader–Zoon banden tussen Richard III en Henry Somerset van 0,16. Gezien het feit dat een fout-vaderschap gebeurtenis moet hebben plaatsgevonden onder H1, is de populatiefrequentie van het Y-haplotype van skelet 1 hetzelfde onder H1 en H2 en annuleert in de LR berekening. De LR is dus 0,16, wat een beperkt bewijs tegen H1 vertegenwoordigt.,

de mtDNA-sequenties van skelet 1 en de veronderstelde 19-meiosis matrilineaire verwant van Richard III, Michael Ibsen, kwamen volledig overeen. Een 21-meiosis familielid kwam ook overeen, behalve op één basis (8994). De laatste waarneming is even waarschijnlijk onder H1 en H2 gezien de waargenomen sequentie van Michael Ibsen, en dus annuleert in de LR. We hebben dus alleen waarschijnlijkheden nodig voor de observatie van de sequentie die Michael Ibsen en skelet 1 delen.

om de waarschijnlijkheid onder H1 te verkrijgen, hebben we de mtDNA mutatiesnelheid nodig, en in dit geval zijn hoge schattingen conservatief. Parsons et al.,Rapporteer 10 mutaties in het controlegebied in 327 generaties aan de hand van genealogische gegevens. Omdat dit een hoger percentage suggereert dan andere gepubliceerde schattingen, en gebaseerd is op genealogische gegevens, hebben we het gebruikt om een waarschijnlijkheid van 0,52 af te leiden voor geen mutatie in 19 meioses.

voor de waarschijnlijkheid onder H2, hebben we de populatiefractie van het skelet 1 haplotype nodig. Hoewel we de volledige mtDNA genoomsequentie van Skeleton 1 verkregen, identificeerden we weinig gepubliceerde gehele genoom vergelijkingsgegevens uit Engeland., Voor de statistische analyse gebruikten we dus alleen de mtDNA-controlegebieden tussen posities 16,093 en 16,320 en tussen 00073 en 00188, waarvoor we geschikte Engelse vergelijkingsgegevens verkregen uit een update van Röhl et al.30, aangevuld met mtDNA sequenties geleverd door wortels voor echte (Genetic Ancestor Ltd., Clare, Suffolk, UK). Het gebruik van slechts deze korte secties van het controlegebied onder H2 is conservatief, aangezien de populatiefractie van de waargenomen controlegebiedsequenties niet kleiner kan zijn dan die van het volledige mtDNA-genoom., De relevante referentiepopulatie is in het verleden meer dan 500 jaar oud, maar gezien de grote bevolkingsomvang in de beoordelingsperiode, verwachten we dat de populatiefrequenties in de afgelopen vijf eeuwen weinig zijn veranderd. We vonden de frequentie van het skelet 1 haplotype 0 tussen 1823 in de database, waaraan we de ene instantie waargenomen in Michael Ibsen toevoegen. Deze benadering is, opnieuw, conservatief omdat Michael werd bemonsterd vanwege zijn bekende genealogische relatie met Richard III. Dit leidt tot een LR van 478 die matig sterk bewijs voor H1 vertegenwoordigt.,

we merkten ook op dat er geen overeenkomsten waren in een database van 26.127 Europese mitochondriale controle Regio haplotypes (www.empop.org 29. we vertrouwen niet op deze database omdat het Europa-breed is in plaats van specifiek voor Engeland en vanwege de vaststelling van problemen, maar het suggereert dat het skelet 1 haplotype veel zeldzamer kan zijn dan kan worden afgeleid uit onze kleinere Engelse database. We merken ook op dat de mobiliteit van vrouwen onder de Europese adel waarschijnlijk veel groter is geweest dan onder de algemene bevolking, als gevolg van huwelijkspraktijken met betrekking tot politieke alliantievorming., Dergelijke praktijken zouden enige rechtvaardiging bieden voor het gebruik van de Europese mtDNA database, en dus voor het beschouwen van het haplotype gevonden in Skeleton 1 en Michael Ibsen als uiterst zeldzaam. In aanvullende tabel 10 geven we enkele illustratieve resultaten aan met behulp van de Europese databank om de implicaties aan te tonen van de vaststelling dat het haplotype skelet 1 zo zeldzaam is als in die databank wordt gesuggereerd.

De LRs voor verschillende combinaties van het bewijs en twee latere waarschijnlijkheden zijn weergegeven in aanvullende tabel 10., Op basis van al het bewijs is de steun voor H1 extreem sterk met een LR van 6,7 miljoen, zodat onze scepticus tot de conclusie zou worden gedreven dat de kans dat skelet 1 niet Richard III is minder is dan 1 op 100.000, terwijl voor degenen die een 1 op 2 startpositie innemen die kans veel minder is dan 1 op een miljoen. Rekening houdend met de conservatieve veronderstellingen die ten grondslag liggen aan onze hierboven beschreven berekening, beschouwen wij dit als een bevestiging van de waarheid van H1 zonder redelijke twijfel.