실험실 위
모든 DNA 작업을 포함하는 현대적인 친척들이었다 수행의 대학에서 레스터. 남자 라인 친척의 입력을 사용하여 Promega PowerPlex Y23 및 Snp 정의 주요 유럽 Y-haplogroups 에서 레스터의 일부 입력하고 확인서 대학교 Paul Sabatier. 여성 라인 친척은 레스터 대학의 전체 미토콘드리아 게놈에 대해 서열화되었다., DNA 는 요크 대학(University Of York)과 툴루즈 대학(Université Paul Sabatier)의 고대 치아와 뼈에서 추출되었습니다. 도서관 준비와 목표 농축은 요크 대학에서 이루어졌습니다. HiSeq2000(ILLUMINA,CA,USA)을 사용한 단일 엔드 100-bp 시퀀싱은 코펜하겐 시퀀싱 시설에서 수행되었습니다. 현대 및 고대 DNA 의 표적 시퀀싱은 genomic technical platform PlaGe(Genopole,Toulouse,France)와 University Of Leicester 의 Protein Nucleic Acid Chemistry Laboratory 에서도 수행되었습니다. 아래에서 우리는 사용 된 방법의 응축 된 버전을 제공합니다., 각 단계에 대한 전체 정보는 보충 방법에서 찾을 수 있습니다. 이 프로젝트를 위해 수행 된 광범위한 계보 연구를 둘러싼 세부 사항은 보충 노트 2 에서 찾을 수 있습니다.
샘플 수집
DNA 를 추출한에서 침 샘플의 현대의 친척 Richard III 고 모든 참가자 모집되었으로 동의 다음 프로젝트 검토 레스터 대학의 연구 윤리위원회 소속이 되었습니다.
스켈레톤 1 을 발굴하고 깨끗한 조건 하에서 샘플을 채취했다.37., 에 관련된 모든 사람을 발굴에 회사 사이트의 깨끗한 실험실에서 레스터와 이들에 관련된 연구소와늘 되는 그들의 미토콘드리아하고,남성에 대한,Y 염색체를 입력한다. DNA 는 타액 샘플에서 추출되었으며 모든 참가자는 정보에 입각 한 동의하에 모집되었습니다.
고대 샘플의 DNA 추출
DNA 는 치아 및 뼈(대퇴골)샘플에서 추출되었다. 모든 절차를 수행에 전념 고대 DNA 실험실에 뉴욕 대학 및 대학교 Paul Sabatier,툴루즈와 함께 적절한 오염의 장소입니다., 2 개의 추출 블랭크를 포함하고 전체 공정 전반에 걸쳐 추출물인 것처럼 정확하게 처리하였다. PCRs 및 라이브러리 실험에는 추가 빈 컨트롤도 포함되었습니다.
섹스-입력 분석을 수행에 해골 1
새로운 디자인 섹스-입력 분석을 포함하의 프라이머를 PCR 을 위한 공동 증폭의 SRY 조각 UTX 및 UTY 동종 영역을 사용했습니다. 이 분석법은 SRY,UTX 및 UTY 의 비교적 작은 크기의 단편을 분해 된 DNA10 을 함유 할 가능성이있는 샘플로부터 공동 증폭 할 수 있도록 설계되었습니다.,
미토콘드리아어 지역의 분석을 뼈대 1
의 분석을 가변 세그먼트(HV1,HV2 및 HV3)의 미토콘드리아 dna 통제 지역에 의해 수행되었 증폭하고 직접 시퀀싱 여러 겹치는 조각에 이르기까지 153 250bp 크기(http://forensic.yonsei.ac.kr/protocol/mtDNA-midi-mini.pdf)22. Amplicons 의 선택은 툴루즈의 실험실에서 PCR 제품을 복제하는 데 사용되었습니다. 시퀀싱은 빅 염료 터미네이터 V3 를 사용하여 수행되었습니다.,1 사이클 시퀀싱 키트(Applied Biosystems)및 모세관 전기 이동법에 ABI Prism3730 유전 분석기(Applied Biosystems)에서 단백질 핵산 화학 실험실의 대학에서 레스터나 게놈 기술 플랫폼 PlaGe(Genopole).
미토콘드리아 게놈/Y-SNP/HIrisplex 입력하면 해골의 1
라이브러리가 건설되었 다음과 같은 메 Kircher16 다는 점을 제외하고,첫 번째 여과 단계 사이에 둔 엔드리고 어댑터 결찰 대체되었 열에 의해 비활성화의 enzymes38,39., 두 개의 마이크로 어레이가 설계되었는데,하나는 mtDNA 농축을위한 것이고 다른 하나는 핵 SNP 농축을위한 것이다. DNA 농축은 애질런트 244k DNA SureSelect microarray(애질런트,Böblingen,Germany)를 사용하여 하이브리드 화 포획에 의해 수행되었다. 핵 포획을 위해 Y 염색체 프로브는 주요 유럽 계통과 관련된 Snp 를 덮도록 설계되었습니다 14. 추가 프로브는 HIrisplex31 마커와 관련된 Snp 를 덮도록 설계되었습니다. 이 두 세트의 프로브(미토콘드리아 및 Snp)는 1×244K 형식의 두 가지 다른 마이크로 어레이 디자인을 채우기 위해 별도로 사용되었습니다., 각각의 마이크로 어레이에 대해,캡처 프로토콜은 Hodges 등 다음에 수행되었다.15 장 등이 제안한 수정과 함께.40 및 포르테스와 Paijmans38. 라이브러리들에 풀 수량으로 보다 큰 합 및 시퀀스에서 두 개의 차선의 Illumina HiSeq2000 플랫폼에서 100SE 모드에서는 시퀀싱 시설의 대학 코펜하겐,덴마크입니다.
각 라이브러리로부터의 원시 읽기는 라이브러리 준비 동안 사용 된 6-뉴클레오티드 지수에 기초하여 정렬되었다. 추가 분석을 위해 인덱스와 100%일치하는 읽기 만 선택되었습니다., 25 개 이상의 뉴클레오타이드보다 짧은 판독은 추가 분석에서 폐기되었다. 손질 된 읽기는 인간 참조 게놈 빌드 37(GRCh37)에서 상 염색체 및 성 염색체에 매핑되고 bwa0.7.5a-r405(ref. 41). 각 정렬에서 출력 bam 파일은 SAMtools0.1.19(ref. 41)및 PCR 중복은 이후에 제거되었다. 매핑을 읽었 필터링 기반으로 매핑하 품질>29 및 그들의 정렬하는 고유한 위치를 따라 참조 시퀀스입니다.,
다형성 위치는 SAMtools(SAMtools0.1.19)및 bcftools 를 사용하여 확인되었다. 마지막으로,vcfutils.pl 었을 필터링하는 데 사용되는 목록의 변형에 따라 Phred-조정형후 확률 품질>20 고 읽을 깊이 보다 더 높은 10. 고대 DNA 분자의 탈 아미노 패턴 때문에 오산하는 것을 피하기 위해 vcf 출력 파일에서보고 된 모든 다형성 위치를 눈으로 검사했습니다., 의 경우 미토콘드리아,게놈 어셈블리를 참조를 시각에서 Tablet42 동안의 정렬을 읽을 포함하는 Snp 을 참조 염색체었를 사용하여 시각 IGV43.
SNP 입력해 PCR
캡쳐 접근 방식이 나왔고 불충분한 보험에 대한 모든 HIrisPlex Y-염색체 Snp 따라 프라이머들을 생성하도록 설계 amplicons 의을 포함하는 이러한 Snp 뿐만 아니라 두 Snp,는 추가로 정의하는 Y 염색체를 사람 G:M285(G1)및 P287(G2)(ref. 14). 이들은 Römpler et al.에 따른 다중 반응의 일부로서 증폭되었다.,44 또는 singleplex 반응을 사용하여(40 주기 없 보조 증폭)시퀀스에서 이온 토런 다음과 같은 라이브러리 준비를 사용하여 이온 PGM200 익스프레스 템플릿 키트 및 PGM200 시퀀싱 키트입니다. 커버리지를 증가시키기 위해,하나의 마커(rs28777)의 singleplex PCR 및 시퀀싱이 Binladen et al.에 따라 수행되었다.45
haplogroup G 정의 Snp(M201,M285 및 P287)의 타이핑은 singleplex PCRs 를 사용하여 툴루즈에서 반복되었다. 이들 PCR 생성물의 시퀀싱은 빅 염료 터미네이터 V3 를 사용하여 수행되었다.,1 사이클 시퀀싱 키트(Applied Biosystems)분석해서 모세관 전기 이동법에 ABI Prism3730 유전 분석기(Applied Biosystems)에 게놈 기술 플랫폼 PlaGe(Genopole).
Y-염색체 haplotype 분석
고대와 현대의 샘플’Y-염색체 haplotypes 었을 사용하여 얻은 PowerPlex Y23 시스템(Promega)에 의해 분석 및 모세관 전기 이동법에 ABI Prism3730 유전 분석기(Applied Biosystems)에 게놈 기술 플랫폼 PlaGe(Genopole)및 ABI Prism3130xl 유전 분석기(Applied Biosystems)대학에서 레스터., 격 1,이에서 진행되었습니다 세 가지 별도의 추출물(RM2,LM1 및 LM3)에서 두 개의 서로 다른 고대 DNA laboratories(욕 툴루즈). 현대의 친척들에게 이것은 두 개의 다른 현대 실험실(레스터와 툴루즈)에서 두 개의 다른 추출물로 수행되었습니다.
Y-염색체 SNP 분석의 현대적인 샘플
다음의 결정을 Y-haplotype 에 대한 현대적인 남성 온라인 샘플을,예측된 사람이었을 사용하여 결정을 엉 Athey 의 사람 예측(http://www.hprg.com/hapest5/hapest5a/hapest5.htm?order=num)., 바이너리 마커의 이러한 취재 및 관련 계통었 입력에서 두 개의 멀티플렉스에 의해 스냅샷 minisequencing 절차(Applied Biosystems)및 ABI3130xl 유전 분석기(Applied Biosystems)다음 확인을 사용하여 생어 시퀀싱. 서머셋 3 은 Hg I(M170+M223−,M253−)14 파생 된 것으로 결정되었으며,툴루즈의 실험실에 의해 추가로 확인되었다. Somersets1,2,4 및 5 는 R1b-U152 에 대해 도출 된 것으로 결정되었다. Somersets1,2,4 및 5 는 두 실험실에서 Sanger 시퀀싱을 사용하여이 clade13(Z56,M126,Z36,Z192,M160 및 L2)을 세분화하는 Snp 에 대해 테스트되었습니다.,
현대 mtDNA 분석
두 샘플을 두 번 복제 하였다.
샘플을 채취했을 사용하여 Oragene DNA 컬렉션을 키트(DNA Genotek)고 DNA 를 추출을 사용하여 두 가지 다른 방법:Qiacube Blood and Body Fluid protocol(200µl200µl 차입)및 Oragene 프로토콜입니다. 을 분석하 제어 영역,샘플 시퀀스에서 두 번 양방향 및 역방향으로 사용하여 두 겹치는 프라이머 설정(15973-296 및 16524-614)사용하여 큰 염료 V 터미네이터 3.1(Applied Biosystems). 복제 간 또는 샘플 간에는 차이가 발견되지 않았습니다.,
샘플은 Meyer et al.에 이어 두 추출 모두에서 완전한 미토콘드리아 게놈에 대해 증폭되었다.26PCR amplicons 는 Ion314 칩상의 Ion Torrent PGM 시퀀서 상에 시퀀싱되었다. 라이브러리를 준비를 사용하여 이온 익스프레스 플러스도록 설계되었 조각 라이브러리 준비를 장비하는 동안,템플릿을 준비와 시퀀싱이었을 사용하여 수행된 이온 PGM200 익스프레스 템플릿 키트와 이온 PGM200 시퀀싱 장비,각각합니다. Raw 읽기 매핑 되었을 rCRS(NC_012920.1)를 사용하여 TMAP 소프트웨어에 포함되어 있는 이온 플러그인 맞춤 3.2.1(토런트 스위트 소프트웨어 3.2.,1)이온 토런트 서버에서. 중복 읽기 제거 및 변형 호출은 SAMtools0.1.19(ref. 41)및 지역 재편성은 게놈 분석 도구 Kit46 으로 수행되었다. 변형 부위는 33 개의 다형성 부위가 유지 된 다음 기본 품질 20,매핑 품질 50 및 커버리지 깊이 30 에 대해 필터링되었다. 이 모든 사이트는 양방향으로 생거 시퀀싱에 의해 수동으로 확인 및 확인되었으며 두 번 복제되었습니다.,
오염을 제어 및 정량화
현대 DNA 오염의 고대 유적 통제를 위해 다음과 같은 방법으로.
- 1
발굴되었에서 수행 깨끗한 조건(보충 방법)
- 2
샘플 저장에 깨끗한 실험실과 고대의 DNA 를 수행한 작업에만 전념 고대의 DNA 를 제공합니다.
- 3
별도의 고대 샘플을 별도의 실험실에서 처리하여 결과를 복제했습니다.,
- 4
모든 실험실 구성원 및 발굴을 참가자는 그들의 미토콘드리아 dna 화된 Y 염색체를 입력하에서 진행되었습니다 모든 사람 참여합니다. 일치하는 mtDNA 또는 Y 염색체 유형이 없었습니다.
중요한 오염에 대한 증거로서,골격 1 의 DNA 분석은 ml1 과의 완벽한 mtDNA 일치 및 ML2 와의 단일 염기 차이를 보여줍니다. 또한 두 개의 개별 실험실에서 생성되고 테스트 된 다수의 추출물을 사용하여 복제 된 명확한 Y-STR haplotype 을 보여줍니다., 마지막으로,우리의 읽기에서 대체 패턴의 검사(보충 방법 참조)도이를 뒷받침합니다.
통계분석
보수적인 접근 방식 각 단계에서,우리가 계산 가능성에 대한 각각의 항목이 관찰되는 증거의 각각의 아래에는 두 개의 반대 가설:가설 1(H1):해골 1Richard III,그리고 가설 2(H2):해골 1Richard III.,
으로 합리적인다고 추정하는 모든 다른 라인의 증거를 그대는 독립적이었으며,관절의 가능성을 모든 증거를 얻었으로 곱셈 개인의 우도에서 각각의 가설입니다. 우도 비율(lr)이라고 불리는 H1 에 대한 증거의 가중치는 H1 아래의 우도와 H2 아래의 우도의 비율에 의해 주어졌습니다. 우리는 가정이 LR 을 줄이면’보수적’이라고 말합니다.
LR 은 사전 확률이 주어지면 H1 이 참인 확률로 변환 될 수 있습니다., 우리는 출발점으로 하는 순간 뼈대 1 처음으로 관찰되었으로 인정 인간 골격지만,평가하기 전에는 나이,성별,건강상태와 죽음의 원인이 되었다. 그 시점에서,있었고 상당한 증거는 해골에서 발견은 무엇이었던 것으로 생각의 위치가 레스터 Grey Friars 합창단이 될 수 있는 Richard III. 의 모든 정보를 시간에 사용할 수 있는 해골 1 발굴되었다 포함하여,그것의 정확한 위치와 자연의 무덤으로 간주되었다 이를 위해 배경으로 분석할 수 있는 정보 통보 이전에는 확률이다., 그 정보에 근거하여,우리는 회의적인 관찰자가 합리적으로 40 명 중 1 명 미만의 사전 확률을 할당 할 수 없다고 생각합니다. 이 값은 제안에 이전 분석에(http://rationalgareth.com/),무엇을 기반으로 우리가 회의적인 평가에 대비할 수 있습니다. 선행 증거에 의해 정당화 될 수있는 가장 높은 확률은 2 에서 1 일 수 있습니다.가능한 경우 관련성이 높고 사용 가능한 데이터를 사용했습니다. 예를 들어 관련 참조 집단과보고 된 사실의 오류 확률에 대해 필연적으로 주관적인 판단이 필요합니다., 멀리 가능성이 있는 것처럼 보였고,합리적인 노력을 우리에 보수적에서 우리의 접근 방식은,예를 들어,사용 pseudocount 방법을 바이어스 LR 으로 중립적인 값 1,따라서 경향을 피하는 가짜 큰 값에서 낮은 주파수를 관찰. 정보의 데이터와 사용되는 방법에서의 통계적 분석,방사성탄소 연대측정 데이터,나이와 성의 골격,존재의 척추의 존재 perimortem 상처,Y 염색체와 미토콘드리아 dna 데이터 주파수에서 찾을 수 있습 보조 방법이 있습니다. 결과를 요약하기 위해:방사성 탄소 데이터는 1 의 우도 비율을 산출했다.,84H1 에 대한 제한된 지원을 나타냅니다. 연령 및 성별 데이터는 5.25 의 우도 배급을 산출했으며,다시 H1 에 대한 제한된 지원을 나타냅니다. 의 존재를 하나의 어깨를 더 높은 다른 것보다,중 보고 리처드의 수명에 기인할 수 있는 척추측만증(골 1 심한 특발성 청소년 발병 척추)또는 두 개의 다른 잘 알려진 조건에 질문의 중풍병을 받고의 기형을,모두의는 아주 드뭅니다. H1 에서 위의 비율은 0 의 예상 확률을 제공합니다.,90 관 척추어 Richard III 의 육체적 모습(=척추 비율 구분의 합계에 의해 세 개의 요금)우리는 곱 0.95 을 허용하기 위해 가능성을 기록한 설명이 잘못 되었습니다. 이것은 212 의 LR 로 이어져 h1 에 대한 적당히 강력한 지원을 제공합니다. Perimortem 부상의 존재는 42 의 LR 을 주었고,그래서 h1 에 대한 온건 한 지원. 골격 1 의 Y 염색체는 Richard III 의 계보 학적으로 결정된 patrilineal 친척의 것과 일치하지 않았다., 이에 의해 설명 될 수 있는 거짓-친자 확인 이벤트에서는 하나 이상의 상 19 아버지들 간에 링크 Richard III 헨리 서머셋,다섯 번째 공작의 Beaufort. Y 염색체,결과도 중 하나를 나타냅니다 추가 false-친자 확인 이벤트 헨리 서비스와 그의 다섯 현대적인 것으로 추정된 patrilinear 후손. 보수적,우리가 선택한 게시된 거짓 친자 확인을 평가는(1)보다 낮은 다른 게시율이 우리는 considered17,47(2)기반으로 족보 data18., 이는 거짓이 육아에서 이벤트 상 19 아버지들 간에 링크 헨리 서비스와 다섯 현대적인 남성 Somersets. 이 제공의 확률이 적어도 하나의 거짓 친자 확인 이벤트에 상 19 아버지들 간에 링크 Richard III 서머셋 및 헨리의 0.16. 허위 친자 관계 사건이 H1 하에서 발생 했음에 틀림 없다는 것을 감안할 때,골격 1 의 Y-haplotype 의 모집단 빈도는 H1 과 H2 에서 동일하며 LR 계산에서 취소됩니다. 따라서 LR 은 0.16 이며 H1 에 대한 제한된 증거를 나타냅니다.,
해골 1 의 mtDNA 서열과 Richard III,Michael Ibsen 의 추정 된 19-감수 분열 모계 상대는 완전히 일치했다. 21-감수 분열 상대는 또한 하나의 염기(8994)를 제외하고 일치했다. 후자의 관찰은 마이클 입센(Michael Ibsen)의 관찰 된 서열이 주어지면 h1 과 H2 에서 똑같이 가능성이 높으므로 LR 에서 취소된다. 따라서 우리는 Michael Ibsen 과 Skeleton1 이 공유하는 서열의 관찰을위한 유사성 만 필요합니다.
H1 하에서 가능성을 얻기 위해,우리는 mtDNA 돌연변이 율을 필요로하며,이 경우 높은 추정치는 보수적이다. 파슨스 외.,28 은 계보 데이터를 사용하여 327 세대에서 10 개의 대조군 영역 돌연변이를보고합니다. 기 때문에 이것보다 더 높은 비율이 다른 출판 추정,그리고 이에 기반한 계 데이터,우리는 그것을 사용하여 파생되는 확률 0.52 한 없음에서 돌연변이 19meioses.
H2 하에서 가능성에 대해,우리는 골격 1haplotype 의 모집단 분율을 필요로한다. 비록 우리가 얻어진 완전한 미토콘드리아 dna 게놈 시퀀스에서 뼈대 1 개,우리가 확인은 출판 전체 게놈 비교 데이터를 영국에서., 따라서,통계적 분석,우리가 사용만 미토콘드리아 dna 어 지역 사이에 위치 16,093 및 16,320 및 사 00073 및 00188 을 위해,우리가 얻은 적합한 영어교에서 데이터의 업데이트 Röhl et al.30,실제에 대한 뿌리에 의해 공급 된 mtDNA 서열로 보충(Genetic Productor Ltd.,클레어,서퍽,영국). 만을 사용하여 이러한 짧은 섹션 컨트롤의 지역에서 H2 는 보수적이,이후 인구의 일부분이 관찰 제어 영역 순할 수 없는 것보다 전체 미토콘드리아 dna 게놈., 관련 참조 인구는 약 500 년,과거에 하지만 인해 큰 인기 기간 동안,고려 우리가 기대하는 인구는 주파수 변화가 작은 마지막입니다. 우리는 스켈레톤 1haplotype 의 빈도가 데이터베이스에서 1823 중 0 인 것으로 나타났습니다.이 인스턴스에 Michael Ibsen 에서 관찰 된 하나의 인스턴스를 추가합니다. 이 접근 방식은,다시 보수적으로 마이클 샘플링으로 인해 알려진 자신의 계보 관계를 리드 III. 이로 인해 LR 의 478 나타내는 적당히 강력한 증거에 대한 H1.,
우리는 또한 언급이 없었다는 경기에서 데이터베이스의 26,127 유럽 미토콘드리아어 지역 haplotypes(www.empop.org)29. 우리는 우리에 의존하지 않는 이 데이터베이기 때문에 그것은 유럽 전체 보다는 오히려 특정 국고 있기 때문에 뒤이은 문제이지만,그것은 그 해골 1haplotype 수 많은 희귀할 수 있는 것보다 유추에서 우리의 작은 영어 데이터베이스입니다. 우리는 또한 주는 여성 사이에 유럽의 귀족이 되었을 가능성이보다 훨씬 더 높은 일반 인구에 대한,때문에 결혼의 관행에 관한 정치적 동맹 형성 있습니다., 이러한 관행이 제공하는 일부에 대한 정당성을 사용하여 유럽 미토콘드리아 dna 데이터베이스,그래서 고려 haplotype 에서 찾을 뼈대 1 개 및 마이클센 매우 드물다. 에서는 테이블 보충 10,우리는 몇 가지 예시를 사용하여 결과를 유럽의 데이터베이스를 보여 주는 의미를 설정하는 해골 1haplotype 으로 희귀에 의해 제안하는 데이터베이스입니다.
증거의 상이한 조합에 대한 LRs 및 2 개의 후방 확률은 보충 표 10 에 나와있다., 를 사용하여 모든 증거,이에 대한 지원 H1 은 매우 강 LR6.7 백만,그는 우리의 무신론 것 기반하는 결론 확률는 해골 1Richard III is less than1 100,000 동안 복용하는 사람들을 위해 1 에서 2 위치를 시작하는 확률보다 훨씬 적은 1 만입니다. 계정으로 보수적인 기본 가정을 우리가 계산한 바로 위에서 설명한 우리는 이것이 진실을 구축하는 H1 넘어 의심할만한 합리적인 사유가 발생할.피>