세균 종자 및 플라스미드

다음과 같은 대장균 균주들이 연구에 사용:DH5a,균주 bl21(DE3)(발현량),CLM24 및 Origami2(DE3)gmd::칸 ΔwaaL. DH5a 는 플라스미드 클로닝 및 정제에 사용되었다., BL21(DE3)은 모든 시험 관내 글리코 실화 반응에 사용 된 scFv13-R4DQNAT 수용체 단백질의 발현 및 정제에 사용되었다. CLM24 은 glyco 최적화된 유도체의 W3110 는 전달에서 삭제를 코딩하는 유전자 발 리가,따라서 용의 축적 preassembled glycans 에 Und-PP36. CLM24 위해 사용되었 정화 CjOST 효소,유기용매 기반의 추출의 모든 LLO sbearing 세균 glycans,소스 변형에 대한 준비하고 추출물 및 없이 선택적으로 풍부한 glycosylation 구성 요소입니다., Origami2(DE3)gmd::칸 ΔwaaL 생성을 위해 사용되었 Man3GlcNAc2-품 LLOs 및 의해 생성된 순차적인 돌연변이와 함께 P1vir 살균소 변환을 사용하여 각각의 균주에서 게이오 collection62 기증자로 얻어지는 것에서 대장균 유전자 재고센터(CGSC). 에 짧은 기증자용해물에서 생성된 변형 JW3597-1(ΔrfaL734::kan)결과 파지하는 데 사용되었 감염 Origami2(DE3)니다., 후에는 도금하는 형질전환에 LB 격판덮개를 포함 카나마이신(Kan),성공적인 transductants 선정되었다고 그들의 칸 저항 카세트에서 제거한 변형 온도에 민감한 플라스미드 pCP2063. 생성 된 균주 인 Origami2(DE3)ΔwaaL 은 동일한 전략에 따라 gmd 유전자의 후속 삭제에 사용되었지만 공여체 균주 JW2038-1(Δgmd751::kan)을 사용했다.

연구에 사용 된 모든 플라스미드는 보충 표 2 에 나와있다. 이 연구에서 구축 된 플라스미드는 표준 클로닝 프로토콜을 사용하여 만들어졌으며 DNA 시퀀싱에 의해 확인되었습니다., 여기에는 다음이 포함되었습니다. 플라스미드 pJL1-scFv13-R4DQNAT 에 의해 생성 된 첫 번째 PCR 증폭딩하는 유전자 scFv13-R4DQNAT 에서 pET28a-scFv13-R4(N34L,N77L)DQNAT 는 N34L 및 N77L 돌연변이 도입되었을 제거하는 상 내부 glycosylation 사이트에서 scFv13-R452. 이어서,생성 된 PCR 생성물을 CFPS49 에 사용 된 pET 기반 벡터 인 플라스미드 pJL1 에서 NcoI 및 SalI 제한 부위 사이에 결찰시켰다. 플라스미드 pJL1-sfGFP217-DQNAT(Integrated DNA Technologies)를 pjl1 에 코딩하는 상업적으로 합성 된 DNA 단편을 결찰함으로써 생성되었다., 이 버전의 sfGFP 포함 추가 GT 삽입 후 K214,확장이 가동 가능한 루프 전에 최종 베타 sheet64. 이 유연한 루프,후 즉시 T216,우리는 이식 21-아미노산 시퀀스를 포함하는 C.jejuni AcrA N123glycosylation site34 지만,최적의 DQNAT sequon 장소에서의 기본 AcrA sequon. 비슷한 절차를 생성하는 데 사용되는 플라스미드 pJL1-sfGFP217-AQNAT,pJL1-hEPO22-DQNAT-26 일 pJL1-hEPO36-DQNAT-40,pJL1-hEPO81-DQNAT-85., 의 경우에 pJL1-hEPO22-DQNAT-26 일 유전자를 위한 성숙한 인간의 EPO 도록 설계되었는 기본 sequon 에 N24 변경되었서 22-AENIT-26 최적 세균 sequon,DQNAT. 네이티브 hEPO sequons36-NENIT-40 및 81-LVNSS-85 대신에 최적의 DQNAT 모티프를 별도로 도입하기 위해 동일한 복제 전략이 수행되었습니다. 재조합의 식 E.coli O9 뇌관 어댑터 glycan(Man3GlcNAc)에 Und-PP 달성되었으로 복제 유전자가 인코딩 WbdB 및 WbdC mannosyltransferase 효소에서 파생된 E., 대장균 ATCC31616 에 대한 조립 glycan 및 RfbK 및 RfbM,도에서 파생 된 대장균 ATCC31616 위한 증가 수영장을 사용 가능한 GDP mannose,E.coli MG1655. 플라스미드 pConYCGmCB 에 의해 건설되었 등온 깁슨 어셈블리고 인코딩하는 인공적인 오페론으로 구성:(i)효모 glycosyltransferases Alg13,Alg14,Alg1 및 Alg2 에 대한 Man3GlcNAc2glycan biosynthesis12 및(ii)대장균 효소 phosphomannomutase(ManB)및 mannose-1-phosphate guanylyltransferase(ManC),는 함께 가용성을 높이의 GDP mannose 기판 위해 Alg1 및 Alg2 고 건강한데 주목했습니다.,

단백질 발현 및 정제

cjpglb 의 정제는 이전에 기술 된 protocol34 에 따라 수행되었다. 간단하게,하나의 식민지의 대장균 CLM24 운반 플라스미드 pSN1865 성에서 하룻밤 37°C50mL 루리아-방법(LB;10g L−1tryptone,5g L−1 효모추출물,5g L−1NaCl,pH7.2)으로 보충된 암피실린(A)and0.2%(w/v%)d-글루코스이다. 하룻밤 셀 subcultured 으로 1L 신선한 훌륭한 국물(TB;12g L−1tryptone,24g L−1 효모추출물,0.4%(v/v%)글리세롤,10%(v/v%)0.17M KH2PO4/0.,72m K2HPO4 인산염 완충액),Amp 를 보충하고 600nm(Abs600)에서의 흡광도가~0.7 의 값에 도달 할 때까지 성장시켰다. 배양 온도는 16°C 로 조정되었고,그 후 l-아라비 노스의 첨가에 의해 단백질 발현이 0.02%(w/v%)의 최종 농도로 유도되었다. 단백질 발현을 진행을 위해 20h 에서 16°C 세포를 수확하고 원심분리한 다음 중단을 사용하여 균질화기(Avestin C5EmulsiFlex). 용해물을 원심 분리하여 세포 파편을 제거하고 상청액을 4℃에서 2h 동안 ultracentrifuged(100,000×g)하였다., 결과 펠릿을 포함하는막 분수전 resuspended 에으로 포터-Elvehjem 조직 균질화기에 포함된 버퍼 50mM HEPES,250mM NaCl,10%(v/v%)글리세롤,1%(w/v%)n-dodecyl-β-d-maltoside(DDM)pH7.5. 서스펜션 was incubated 상온에서 1 시간을 촉진하는 세제의 가용 화 CjPglB 에서 대장균,지질을 제거한 후속 ultracentrifugation(100,000×g)1h 에서 4°C, DDM-가용화 된 CjPglB 를 함유하는 상청액은 모든 완충액이 1%(w/v%)DDM 으로 보충 된 것을 제외하고는 제조사의 사양에 따라 Ni-NTA 수지(Thermo)를 사용하여 정제되었다. 도비 분수에서 Ni NTA 정화는 다음을 실시하는 크기 배제 크로마토그래피(SEC)을 이용하여 AKTA Explorer FPLC 시스템(GE Healthcare)와 Superdex200 10/300GL 열입니다. 정제 단백질 저장에서 최종 농도의 1-2mg mL−1OST 저장 버퍼(50mM HEPES,100mM NaCl,5%(v/v%)글리세롤,0.01%(w/v%)DDM,pH7.5)4°C, 글리세롤의 농도에서 샘플을 조절하였 20%(v/v%)에 대한 장기적인 저장소에서 -80°C

정화 수용체 단백질 scFv13-R4DQNAT 수행되었으로 설명 previously52. 간략하게,플라스미드 pET28a-scFv13-R4 를 운반하는 대장균 균주 BL21(DE3)(N34L,N77L)dqnat 을 카나마이신과 함께 공급 된 TB1L 에서 성장시켰다. 문화 was incubated at37°C 까지 Abs600 에 도달했~0.7,어느 시점에서 단백질 발현을 유도하여 또는 이소프로필 β-d-1-thiogalactopyranoside(IPTG)최종 농도의 0.1mM. 단백질 발현을 진행을 위해 20h 에서 25°C, 세포는 위에서 설명한 것과 동일하게 수확되고 중단되었다. ScFv13-R4DQNAT 단백질을 Ni-NTA 수지를 사용하여 정제한 다음 제조사의 프로토콜에 따라 SEC 를 하였다. 단백질 저장에서 최종 농도의 1-2mg mL−1 에 저장 버퍼(50mM HEPES,250mM NaCl,1mM EDTA,pH7.5)4°C.

의 추출 LLOs

프로토콜에 대한 유기용매추출 의 LLOs 에서 대장균 막으로서 앞에서 설명 protocol34,66., 대부분의 경우,표적 글리 칸 생합성(보충 표 2)을위한 플라스미드를 운반하는 균주 CLM24 의 단일 콜로니가 LB 배지에서 밤새 성장되었다. 주목할 만한 예외들 LLOs 베어링 W.succinogenes N-글리칸(WsLLOs),는 생산되었을 사용하여 DH5a 세포를 들고 pEpiFOS-5pgl5fosmid(친절하게 제공하여 박사는 마르쿠스 Aebi),그리고 LLO sbearing Man3GlcNAc2 는 생산되었을 사용하여 Origami2(DE3)gmd::칸 ΔwaaL 세포반 플라스미드 pConYCGmCB. 하룻밤 세포를 적절한 항생제로 보충 된 1L 의 TB 로 서브 배양하고 Abs600 이~0.7 에 도달 할 때까지 성장시켰다., 잠복기 온도를 조절하였 30°C 에 대한 생합성의 모든 glycans 제외한 Man3GlcNAc2 는 조정 16°C 을 위한 플라스미드 pMW07-pglΔB,단백질 발현을 유도로 l-arabinose 에서 최종의 농도가 0.2%(w/v%)는 동안에 대한 fosmid pEpiFOS-5pgl5 유도는 이소프로필 β-d-1-thiogalactopyranoside(IPTG)에서 최종 농도의 1mM. 다른 모든 플라스미드 관련 제정 발기인과 따라서 필요로하지 않았 화학 inducers. 16 에서,세포 수확 원심분리하여 세포 및 펠렛었 냉동 건조를 완료 건조에 -70°C, 의 추출 CjLLOs,기본 설계 ClLLOs,E.coli O9 뇌관 어댑터 LLOs 및 WsLLOs,the lyophilisates 중단되었 10:20:3 부피의 비율 CHCl3:CH3OH:H2O 솔루션 및 배양한 실온에서 15 분을 촉진하의 추출 LLOs. 의 추출 LLO sbearing Man3GlcNAc2glycan,lyophilisate 었 연속적으로 중단에서 10:20(v/v%)CHCl3:CH3OH 솔루션,물,그리고 10:20:3CHCl3:CH3OH:H2O 솔루션으로 15 분의 배양에 실내 온도 사이의 각 단계입니다., 각각의 경우에는 최종 현가장치 원심 분리(4000×g)15 분 후,유기층(아래층)수집 및 건조과 진공을 집중 동결 건조 다음에. Lyophilisates 포함하는 활동 LLOs 었 resuspended 에서 셀룰라이-무료 glycosylation 버퍼(10mM HEPES,pH7.5,10mM MnCl2,0.1%(w/v%)DDM)저장에서 4°C 로

준비의 원 S30 추출물

CLM24 소스 균주에 성장했 2×YTPG(10g L−1 효모추출물,16g L−1tryptone,5g L−1NaCl,7g L−1K2HPO4, 3g L−1KH2PO4,18g L1 포도당,pH7.2)까지 Abs600 에 도달~3., 를 생성하는 OST-농축물,CLM24 운반 플라스미드 pSF-CjPglB,pSF-CcPglB,pSF-DdPglB,pSF-DgPglB,또는 pSF-DvPglB52 었으로 사용되는 원본을 변형이다. LLO 농축 추출물을 생성하기 위해,플라스미드 pMW07-pglΔB 를 운반하는 CLM24 를 소스 균주로 사용 하였다. OST 와 LLOs 를 모두 포함하는 원-포트 추출물을 생성하기 위해,pmw07-pglΔB 및 pSF-CjOST 를 운반하는 CLM24 를 소스 균주로 사용 하였다. 필요에 따라,글리코 실화 성분의 발현은 0.02%(w/v%)의 최종 농도에서 l-아라비 노스로 유도되었다., 유도 후,단백질 발현은 30°c 에서 OD600~3 의 밀도로 진행되도록 허용되었고,이 시점에서 세포는 4°C 에서 15 분 동안 원심 분리(5000×g)에 의해 수확되었다. 모든 후속 단계는 달리 명시되지 않는 한 4°C 에서 수행되었다. 산탄세포를 씻에서 세 번 S30 버퍼(10mm tris 아세테이트,14mm 마그네슘 아세테이트,60mM 칼륨 아세테이트,pH8.2). 마지막 세척 후,세포를 7000×g 에서 10 분 동안 펠렛 화하고 액체 질소에서 플래시 동결시켰다. 용해물을 만들기 위해,세포를 해동시키고 습윤 세포 질량 1g 당 1ml 의 S30 완충액에서 균질성으로 재연시켰다., 세포를 단일 통로로 20,000–25,000psi 에서 Avestin Emulsionlex-B15 고압 균질 기를 사용하여 교란시켰다. 이어서,용해물을 30 분 동안 30,000×g 에서 2 회 원심분리하여 세포 파편을 제거하였다. 상등액을 전송하여 새로운 선박 및 incubated250rpm 흔들어 37°C60min 저하로 생 mRNA 성적 증명서 및을 방해 기존 polysome 지에 lysate. 4°C 에서 15 분 동안 원심분리(15,000×g)를 한 후,상청액을 채취하여,액체 질소에서 aliquoted,flash-fried,-80°C 에서 저장하였다., S30 추출물은 약 3 번의 동결-해동 사이클 동안 활성이었고 Bradford assay 에 의해 측정 된~40g L−1 총 단백질을 함유 하였다.

셀 무료 당단백질 합성

에 대한 체외 glycosylation 의 수락자를 가진 정제,단백질을 반응에서 수행되었다 50µL volume 포함하는 3μg 의 scFv13-R4DQNAT,2µg 정제 CjPglB,5µg 추출 LLOs(의 경우에 Man3GlcNAc2LLOs,20µg 사용되었)에 체외 glycosylation 버퍼(10mM HEPES,pH7.5,10mM MnCl2,0.1%(w/v%)DDM). 반응 혼합물을 30℃에서 16h 동안 배양 하였다., 당 단백질의 조 추출물 기반 발현을 위해 2 상 체계가 구현되었다. 첫 번째 단계에서,단백질 합성은 변형 된 PANOx-SP system67 로 수행되었다. 특히,1.5mL microcentrifuge 관 요금이 부과되었으로 15-µL 반응을 포함 200ng 플라스미드 DNA,30%(v/v%)S30 추출하고 다음과 같다:12mM 글루타민산 마그네슘,10mM 염 글루탐산,130mM 칼륨 글루탐산,1.2mM 를 투여한 triphosphate(ATP),0.85mM 구아노신 삼인산(GTP),0.85mM 딘 삼인산(UTP),0.85mM cytidine 삼인산(CTP),0.034mg mL−1 엽산,0.,171mg mL−1 대장균 tRNA(Roche),2mM 각 20 개의 아미노산,30mM phosphoenolpyruvate(PEP,Roche),0.4mM 니코틴아미드 아데닌 디뉴클레오티드(NAD),0.27mM 코엔자 A(CoA),4mM 옥살산,1mM 퓨,1.5mM spermidine,57mM HEPES. 에 대한 scFv13-R4DQNAT,hEPO22-DQNAT-26 일 hEPO36-DQNAT-40,hEPO81-DQNAT85,이 단계에서 수행되는 30°C4h 에서 산화 조건에있는 동안에 대한 sfGFP217-DQNAT 및 sfGFP217-AQNAT 이 단계에서 수행되는 30°C for5min 조건을 감소에서., 에 대한 산화 조건에 추출물 pre-컨 750μm iodoacetamide 어둠 속에서 실온에서 30 분 및 반응이 혼합되어 200mM 글루타티온에서는 3:1 비율 사이에 산화 및 감소된 형태입니다. Active sfGFP 수익률은 세포에서 무 반응은 정량을 측정하여 형광-lysate 변환로 농도를 사용하여 표준곡선으로 이전에 described39. 두 번째 단계에서,10mM 및 0 의 최종 농도에서 mncl2 및 DDM 의 첨가에 의해 단백질 글리코 실화가 개시되었다.,1%(w/v%),각각 진행될 수 있습 30°C 에서 16h. 필요한 반응을 보완되었으로 2µg 정제 CjPglB 이(즉,CFGpS 와 LLO 풍부한 추출물)또는 5µg 용매 추출 CjLLOs 이(즉,CFGpS OST-풍부한 추출물). 모든 반응은 5%ßME 를 함유하는 Laemmli 샘플 완충액을 첨가함으로써 중단되었고,그 후 샘플을 100℃에서 15 분 동안 비등시키고 SDS-PAGE 및 western blotting 에 의해 분석 하였다.

웨스턴 블롯 분석

0.5μg 의 수용체 단백질을 함유하는 샘플을 SDS-PAGE 겔에 로딩하였다., 다음과 같은 전기영동 분리,단백질 전달에서 젤로 Immobilon-P 폴리비닐 difluoride(PVDF)막(0.45μm)에 따르면 제조업체의 프로토콜입니다. 막 세척했으로 두 번 TBS 버퍼(80g L−1NaCl,20g L−1KCl,30g L−1Tris-base)다음으로 배양을 위한 1 시간에 차단하는 솔루션(50g L−1 비지방 우유에서 TBST(TBS 공급 0.05%(v/v%)Tween-20)). 차단 후,멤브레인을 각 세척 사이에 10 분 배양하여 TBST 로 4 회 세척 하였다., 첫 번째 멤브레인 조사와 6xHis-polyclonal 항체(Abcam,ab137839,1:7500)는 특히 인식하 hexahistidine epitope 태그는 동안에는 두 번째 복제 멤브레인 조사 중 하나와 함께 다음과 같다:hR6(1:10,000)혈청에서 토끼를 인식하는 기본 C.jejuni 및 C.lari glycan 뿐만 아니라 설계 C.lari 글리칸 또는 ConA-HRP(Sigma,L6397,1:2500)을 인식하는 Man3GlcNac 및 Man3GlcNAc2. 검색 막의 수행에 대한 적어도 1 시간으로 흔들어온에서는 후막었으로 세척 TBST 와 동일한 방식으로 설명한다., 발달을 위해,멤브레인을 서양 ECL 기질(BioRad)으로 실온에서 간단히 배양하고 ChemiDocTM XRS+시스템을 사용하여 이미지화 하였다. OST 효소들이 풍부에서 추출물을 검출하여 동일한 SDS-PAGE 절차 뒤에 서양의 얼룩으로 분석한 polyclonal 항체 특정 플래그 epitope 태그(Abcam,ab49763,1:7500). 추출물에 농축 된 LLOs 의 글리 칸 성분은 10μl 의 추출물을 니트로 셀룰로스 막에 직접 얼룩지게하여 hR6 혈청으로 검출 하였다. 절단되지 않은 면역 블롯 이미지는 보충 도 1 에 도시되어있다. 8.,

MS 분석

약 2µg 의 scFv13-R4DQNAT 단백질 솔루션 변성된 6M 요소,감소된 10mM DTT,서 배양 34°C1 에서,그 알킬화 58mM iodoacetamide45 분에서 어둠 속에서 실온으로 냉각하여 최종 36mM DTT. 이 솔루션은 다음 희석한 50mM 중탄산 암모늄(pH8.0)최종 버퍼의 농도가 1M 요소하기 전에 트립신 소화입니다. 샘플을 37℃에서 18h 동안 0.2μg 의 트립신으로 소화시켰다.tfa 를 최종 pH2.2–2.5 에 첨가하여 소화를 중단시켰다., 그런 다음 샘플을 SOLA HRP SPE 카트리지(ThermoFisher Scientific)로 탈염시켰다. 카트리지를 1×0.5mL90%메탄올,0.1%트리 플루오로 아세트산(tfa)으로 조절하고 2×0.5mL0.1%(v/v%)TFA 와 평형시켰다. 샘플을 0.2%(v/v%)TFA 로 1:1 로 희석하고 카트리지를 통해 천천히 실행하였다. 세척 후 2×0.5mL 의 평형 솔루션,펩타이드 용출 1×0.5mL of50%(v/v%)아세토니트릴(ACN),0.1%(v/v%)TFA 에서 건조 속도로 진공됩니다.,

nanoLC–MS/MS 분석을 사용하여 수행 UltiMate3000RSLCnano(Dionex)결합하는 Orbitrap 융합(ThermoFisher 과학)질량분석기 장비 nanospray 코드 이온 소스입니다. 각 샘플을 재구성에 22µL 의 0.5%(w/v%)FA10µL 로드에는 찬사를 PepMap100C18 트랩 칼럼(5µm,100μm×20mm,100Å,ThermoFisher 과학)에 nanoViper 이음쇠에서 20µL min−1 의 0.5%FA 해 라인 담., 후 2 분,밸브 전환을 허용한 펩티드를 분리되는 환호 PepMap C18 나노 칼럼(3µm,75µm×25cm,ThermoFisher 과학),90min 그라데이션의 5 23%-35%B 에서 300nL min−1(3 73 93 분 각각음),9-분 늘 90%B,9-min90%B 고 빠른 스위치 5%B 에서 1 분. 칼럼은 다음 실행 전에 20 분 동안 5%B 로 재평형되었다. Orbitrap Fusion 은 1.7kV 에서 설정된 nanospray 전압과 275℃에서 소스 온도로 포지티브 이온 모드에서 작동했다., Ft,IT 및 사중 극자 질량 분석기에 대한 외부 교정이 분석 전에 수행되었습니다. 이 Orbitrap 전 MS 설문조사 검색(m/z400-1800)순이었 최 3 의 데이터-더 높은 의존 충돌이 분리 제품 이온 트리거 ETD(HCD pd-ETD)MS/MS 검사를 위한 전구체 펩타이드와 2-7 요금은 위 임계값 이온 수의 50,000 이와 함께 정규화 충돌의 에너지 32%., MS 설문조사 검색되었으로 취득한 해결하는 전원의 120,000(FWHM m/z200)으로,자동적인 진 Control(AGC)=2e5 및 최대 사출시간(Max 그것이)=50ms,및 HCD MS/MS 검사의 해상도에서 30,000AGC=5e4,Max IT=60ms,Q 격리 창(m/z)에서 3 위한 대량 범위 m/z105-2000. 동적 배제 파라미터는±10ppm 배제 질량 폭으로 60s 배제 기간 내에서 1 로 설정되었다. 제품 이온 트리거 목록 구성되어 봉우리에서 204.0867Da(HexNAc oxonium 이온),138.0545Da(HexNAc 단편),그리고 366.1396Da(HexHexNAc oxonium 이온)., 는 경우 하나의 HCD 제품 이온 목록에서 발견되었,두 개의 책임 의존 ETD MS/MS 검사(EThcD)와 HCD 추가 활성화(SA)에서 동일한 전구체 이온 발생했다고에서 수집한 선형 이온 함정입니다. 을 위한 이중으로 부과 선구자,이 ETD 반응 시간으로 설정은 150ms SA 에너지가 설정에서 30%,는 동안 동일한 매개 변수에 125ms20%,각각했다 사용에 대한 높은 충 유도체. 두 이온 트리거 스캔에 대해 fluoranthene ETD 시약 표적은 2e5,AGC 표적은 1e4,max IT 는 105ms 및 격리 창은 3 으로 설정되었습니다. 모든 데이터는 Xcalibur3 을 사용하여 획득되었습니다.,0 운영 소프트웨어 및 Orbitrap 융합 조정 응용 v.2.1(ThermoFisher 과학).

모두 MS 및 MS/MS raw 스펙트럼에서는 각 샘플이 검색되었을 사용하여 Byonics v.2.8.2(단백질 측정항목)을 이용하여 전자장균 단백질의 데이터베이스에 추가 scFv13-R4DQNAT 타겟 단백질 시퀀스입니다. 펩티드 검색 매개 변수가 다음과 같이 두 가지를 놓친 분열한 트립신 소화 고정 carbamidomethyl 시스테인의 수정,변수를 수정 메티오닌의 산화 및 deamidation 에 아스파라긴/글루타민 잔류물., 펩타이드 질량 허용 오차는 10ppm 이었고 hcd 및 EThcD 스펙트럼에 대한 단편 질량 허용 오차 값은 각각 0.05 및 0.6Da 였다. 공통 및 희귀 수정의 최대 수는 모두 2 개로 설정되었습니다. 글리 칸 검색은 Byonic software 에서 309 개의 포유류 N 연결 글리 칸 목록에 대해 수행되었습니다. 확인 된 펩타이드는 최대 2%FDR 에 대해 여과되었다. 이 소프트웨어는 검색 결과를 스프레드 시트로 내 보냈습니다.

GFP 형광 활동

세포의 활동-무료 유래 sfGFP 었을 사용하여 결정에 lysate 형광분석으로 설명 previously39., 간략하게,2μl 의 무 세포 합성 당화 물 sfGFP 반응을 48μl 의 나노 순수로 희석시켰다. 그런 다음 용액을 Costar96-well black assay plate(Corning)에 넣었다. SfGFP 형광에 대한 여기 및 방출 파장은 각각 485 및 528nm 이었다.

효소결합 면역 분석(ELISA)

코스타 96-well ELISA 플레이트(코닝)었 입히는 하룻밤에서 4°C50µl1mg mL−1 대장균 β-gal(Sigma-Aldrich)에 0.05M 탄산나트륨 buffer(pH9.6)., 를 차단 한 후 5%(w/v%)소 혈 청 알부민(BSA)PBS 에서 3h 상온에서,접시 세척했 네 번 PBST 버퍼(PBS,0.05%(v/v%)Tween-20,0.3%(w/v%)BSA)인큐베이션으로 순차적으로 희석 정화 scFv13-R4 샘플이나 수용성수의 CFGpS lysates1h 상온에서. 샘플을 브래드 포드 분석법에 의해 정량화하고 동등한 양의 총 단백질을 플레이트에 적용 하였다. 동일한 완충액으로 4 회 세척 한 후,3%PBST 의 항-6×-His-HRP 접합 토끼 폴리 클로 날 항체(Abcam)를 1 시간 동안 각 웰에 첨가 하였다., 플레이트는 표준 프로토콜을 사용하여 세척되고 개발되었습니다.

in vitro 세포 증식 분석

성장 및 생존을 위해 과립구-대 식세포 콜로니 자극 인자(GM–CSF),인터루킨 3(IL-3)또는 hEPO 를 필요로하는 인간 적혈구 혈증 TF-1 세포(Sigma)가 사용되었다. 세포에서 유지된 경우-1640 미디어 보완 10%FBS,50U mL−1 페니실린,50mg mL−1 수트렙토마이신,2mM 글루타민,그리고 2ng mL−1GM-CSF37°C 에서 가습 분위기를 포함하는 5%의 CO2 를 줄입니다., Gm-CSF 가없는 RPMI-1640 배지에서 16h 배양 후,세포를 계수하고,수확하고,신선한 배지에서 resuspended 하였다. 웰 당 5×103TF-1 세포를 96-웰 분석 플레이트에서 시드하고,EPO 표준 또는 샘플을 각각의 웰에 최종 원하는 농도로 첨가 하였다. 세포를 alamarBlue®를 첨가하기 전에 습한 배양기에서 6 시간 동안 배양 하였다. 12h 후,560nm/590nm 여기/방출 파장에서 형광 신호를 측정 하였다.,

데이터 가용성

모든 데이터 생성된 동안 연구에서는 이 문서에 포함되어 있습니다며 추가 정보를 파일에서 사용할 수 있 저자에 따라 합리적인 요청입니다.피>