ceppi Batterici e plasmidi

I seguenti ceppi di E. coli sono stati utilizzati in questo studio: DH5a, BL21(DE3) (Novagen), CLM24, e Origami2(DE3) gmd::kan ΔwaaL. DH5a è stato utilizzato per la clonazione e la purificazione del plasmide., BL21 (DE3) è stato utilizzato per l’espressione e la purificazione della proteina accettore scFv13-R4DQNAT che è stata utilizzata in tutte le reazioni di glicosilazione in vitro. CLM24 è un derivato glico-ottimizzato di W3110 che porta una delezione nel gene che codifica la ligasi WaaL, facilitando così l’accumulo di glicani preassemblati su Und-PP36. CLM24 è stato utilizzato per la purificazione dell’enzima CjOST, l’estrazione a base di solvente organico di tutti i glicani batterici LLO sbearing e il ceppo di origine per la preparazione di estratti con e senza componenti di glicosilazione arricchiti selettivamente., Origami2 (DE3) gmd::kan ΔwaaL è stato utilizzato per la produzione di LLO portatori di Man3GlcNAc2 ed è stato generato da mutazione sequenziale con trasduzione del fago P1vir utilizzando i rispettivi ceppi della collezione Keio62 come donatori, che sono stati ottenuti dal Coli Genetic Stock Center (CGSC). In breve, il lisato donatore è stato generato dal ceppo JW3597-1(ΔrfaL734::kan) e il fago risultante è stato utilizzato per infettare le cellule bersaglio Origami2 (DE3)., Dopo aver placcato i trasformanti su piastre LB contenenti kanamicina (Kan), sono stati selezionati trasduttori di successo e le loro cassette di resistenza Kan sono state rimosse trasformando con plasmide sensibile alla temperatura pCP2063. Il ceppo risultante, Origami2 (DE3) ΔwaaL, è stato quindi utilizzato per la successiva delezione del gene gmd secondo una strategia identica ma utilizzando il ceppo donatore JW2038-1 (Δgmd751::kan).

Tutti i plasmidi utilizzati nello studio sono elencati nella Tabella supplementare 2. I plasmidi costruiti in questo studio sono stati realizzati utilizzando protocolli di clonazione standard e confermati dal sequenziamento del DNA., Questi includevano quanto segue. Plasmid pJL1-scFv13-R4DQNAT è stato generato dalla prima PCR amplificando il gene che codifica scFv13-R4DQNAT da pET28a-scFv13-R4(N34L, N77L)DQNAT, dove le mutazioni N34L e N77L sono state introdotte per eliminare i siti di glicosilazione interna putativi in scFv13-R452. Il prodotto PCR risultante è stato quindi legato tra i siti di restrizione NcoI e SalI nel plasmide pJL1, un vettore basato su pET utilizzato per CFPS49. Il plasmide pJL1-sfGFP217-DQNAT è stato generato legando un frammento di DNA sintetizzato commercialmente che codifica sfGFP217-DQNAT (Integrated DNA Technologies) in pJL1., Questa versione di sfGFP contiene un ulteriore inserimento GT dopo K214, che estende questo ciclo flessibile prima della beta finale sheet64. In questo anello flessibile, subito dopo T216, abbiamo innestato una sequenza di 21 aminoacidi contenente il sito di glicosilazione C. jejuni AcrA N12334, ma con un sequone DQNAT ottimale al posto del sequone AcrA nativo. Procedure simili sono state utilizzate per generare plasmidi pJL1-sfGFP217-AQNAT, pJL1-hEPO22-DQNAT-26, pJL1-hEPO36-DQNAT-40 e pJL1-hEPO81-DQNAT-85., Nel caso di pJL1-hEPO22-DQNAT-26, il gene per l’EPO umano maturo è stato progettato in modo tale che il sequone nativo a N24 è stato cambiato da 22-AENIT-26 a un sequone batterico ottimale, DQNAT. Sono state eseguite strategie di clonazione identiche per introdurre separatamente motivi DQNAT ottimali al posto dei sequoni hEPO nativi 36-NENIT-40 e 81-LVNSS-85. L’espressione ricombinante dell’E. coli O9 primer-adaptor glycan (Man3GlcNAc) su Und-PP è stata ottenuta clonando i geni che codificano gli enzimi WBDB e WbdC mannosiltransferasi derivati da E., coli ATCC31616 per assemblare il glicano e RfbK e RfbM, derivati anche da E. coli ATCC31616 per aumentare il pool di PIL-mannosio disponibile, in E. coli MG1655. Plasmide pConYCGmCB è stato costruito da isotermica Gibson montaggio e codifica per un artificiale operone costituito da: (i) il lievito glycosyltransferases Alg13, Alg14, Alg1, e Alg2 per Man3GlcNAc2 glycan biosynthesis12 e (ii) l’E. coli enzimi phosphomannomutase (ManB) e mannosio-1-fosfato guanylyltransferase (aeroporto int), che concorrono ad aumentare la disponibilità del PIL-mannosio substrati per la Alg1 e Alg2 enzimi.,

Espressione e purificazione delle proteine

La purificazione di CjPglB è stata eseguita secondo un protocollo precedentemente descritto34. In breve, una singola colonia di E. coli CLM24 che trasportava il plasmide pSN1865 è stata coltivata durante la notte a 37 °C in 50 mL di Luria-Bertani (LB; 10 g L−1 triptone, 5 g L−1 estratto di lievito, 5 g L−1 NaCl, pH 7,2) integrato con ampicillina (Amp) e 0,2% (p/v%) d-glucosio. Durante la notte le cellule sono state sottoculturate in 1 L di brodo fresco formidabile (TB; 12 g L−1 triptone, 24 g L−1 estratto di lievito, 0,4% (v/v%) glicerolo, 10% (v/v%) 0,17 M KH2PO4/0.,72 M K2HPO4 tampone fosfato), integrato con Amp e cresciuto fino a quando l’assorbanza a 600 nm (Abs600) ha raggiunto un valore di ~0,7. La temperatura di incubazione è stata regolata a 16 °C, dopo di che l’espressione proteica è stata indotta dall’aggiunta di l-arabinosio ad una concentrazione finale dello 0,02% (p/v%). L’espressione proteica è stata autorizzata a procedere per 20 h a 16 °C. Le cellule sono state raccolte per centrifugazione e poi interrotte utilizzando un omogeneizzatore (Avestin C5 emulsionflex). Il lisato è stato centrifugato per rimuovere i detriti cellulari e il surnatante è stato ultracentrifugato (100.000×g) per 2 ore a 4 °C., Il pellet risultante contenente la frazione di membrana è stato completamente risospeso con un omogeneizzatore tissutale Potter-Elvehjem in tampone contenente 50 mm HEPES, 250 mM NaCl, 10% (v/v%) glicerolo e 1% (p/v%) n-dodecil-β-d-maltoside (DDM) a pH 7,5. La sospensione è stata incubata a temperatura ambiente per 1 ora per facilitare la solubilizzazione detergente di CjPglB da lipidi nativi di E. coli, che sono stati rimossi mediante successiva ultracentrifugazione (100.000×g) per 1 ora a 4 °C., Il surnatante contenente CjPglB solubilizzato con DDM è stato purificato utilizzando resina Ni – NTA (Thermo) secondo le specifiche del produttore, ad eccezione del fatto che tutti i buffer sono stati integrati con DDM all ‘ 1% (p/v%). La frazione di eluizione dalla purificazione Ni-NTA è stata quindi sottoposta a cromatografia di esclusione dimensionale (SEC) utilizzando un sistema ÄKTA Explorer FPLC (GE Healthcare) con colonna Superdex 200 10/300 GL. La proteina purificata è stata immagazzinata ad una concentrazione finale di 1-2 mg mL−1 nel tampone di stoccaggio OST (50 mm HEPES, 100 mM NaCl, 5% (v/v%) glicerolo, 0,01% (w/v%) DDM, pH 7,5) a 4 °C., La concentrazione di glicerolo nel campione è stata regolata al 20% (v/v%) per la conservazione a lungo termine a -80 °C.

La purificazione della proteina accettore scFv13-R4DQNAT è stata effettuata come descritto in precedenza52. In breve, E. coli ceppo BL21(DE3) portando plasmide pET28a-scFv13-R4 (N34L, N77L)DQNAT è stato coltivato in 1 L di TB fornito con kanamicina. La coltura è stata incubata a 37 °C fino a quando Abs600 ha raggiunto ~0,7, a quel punto l’espressione proteica è stata indotta dall’aggiunta di isopropile β-d-1-tiogalattopiranoside (IPTG) ad una concentrazione finale di 0,1 mm. L’espressione proteica è stata autorizzata a procedere per 20 ore a 25 °C., Le cellule sono state raccolte e interrotte in modo identico come descritto sopra. La proteina scFv13-R4DQNAT è stata purificata utilizzando resina Ni-NTA seguita da SEC secondo i protocolli del produttore. La proteina è stata immagazzinata ad una concentrazione finale di 1-2 mg mL-1 in tampone di stoccaggio (50 mm HEPES, 250 mm NaCl, 1 mM EDTA, pH 7,5) a 4 °C.

Estrazione di LLO

Il protocollo per l’estrazione con solvente organico di LLO dalle membrane di E. coli è stato adattato da un protocollo precedentemente descritto34,66., Nella maggior parte dei casi, una singola colonia di ceppo CLM24 che trasportava un plasmide per la biosintesi del glicano bersaglio (Tabella supplementare 2) è stata coltivata durante la notte in mezzi LB. Le eccezioni erano LLOs cuscinetto W. succinogenes N-glycan (WsLLOs), che sono state prodotte utilizzando DH5a cellule che trasportano il pEpiFOS-5pgl5 fosmid (gentilmente fornito dal Dr. Markus Aebi), e LLO sbearing Man3GlcNAc2, che sono state prodotte utilizzando Origami2(DE3) gmd::kan ΔwaaL cellule che trasportano plasmide pConYCGmCB. Durante la notte le cellule sono state sottoculturate in 1 L di TB integrate con un antibiotico appropriato e coltivate fino a quando l’Abs600 ha raggiunto ~0.7., La temperatura di incubazione è stato regolato a 30 °C per la biosintesi di tutti i glicani, tranne per Man3GlcNAc2, che è stato regolato a 16 °C. Per plasmide pMW07-pglΔB, l’espressione della proteina è stata indotta con l-arabinosio alla concentrazione finale di 0,2% (w/v%), mentre per fosmid pEpiFOS-5pgl5 induzione è stato con isopropilico β-d-1-thiogalactopyranoside (IPTG) alla concentrazione finale di 1 mM. Tutti gli altri plasmidi coinvolti promotori costitutivi e, quindi, non richiedono induttori chimici. Dopo 16 h, le cellule sono state raccolte per centrifugazione e i pellet di cellule sono stati liofilizzati per completare la secchezza a -70 °C., Per l’estrazione di CjLLOs, ClLLOs nativi e ingegnerizzati, E. coli O9 primer-adaptor LLOs e WsLLOs, i liofilizzati sono stati sospesi in rapporto volumetrico 10:20:3 di CHCl3:CH3OH:soluzione H2O e incubati a temperatura ambiente per 15 min per facilitare l’estrazione di LLOs. Per l’estrazione di LLO sbearing Man3GlcNAc2 glycan, il liofilizzato è stato successivamente sospeso in 10: 20 (v/v%) CHCl3: soluzione di CH3OH, acqua e 10: 20: 3 CHCl3: CH3OH: soluzione di H2O con 15 min di incubazione a temperatura ambiente tra ogni passo., In ogni caso, la sospensione finale è stata centrifugata (4000×g) per 15 min, dopo di che lo strato organico (strato inferiore) è stato raccolto e asciugato con un concentratore a vuoto seguito da liofilizzazione. Lyophilisates contenenti attiva LLOs sono state risospese in cell-free glicosilazione buffer (10 mM HEPES, pH 7.5, 10 mM MnCl2, e lo 0,1% (w/v%) DDM) e conservato a 4 °C.

Preparazione del greggio S30 estratti

CLM24 fonte ceppi sono stati coltivati in 2×YTPG (10 g L−1 di estratto di lievito, 16 g L−1 tryptone, 5 g L−1 di NaCl, 7 g L−1 K2HPO4, 3 g L−1 KH2PO4, 18 g L−1 di glucosio, pH 7,2) fino a quando il Abs600 raggiunto ~3., Per generare estratto arricchito con OST, CLM24 che trasporta plasmide pSF-CjPglB, pSF-CcPglB, pSF-DdPglB, pSF-DgPglB o pSF-DvPglB52 è stato utilizzato come ceppo sorgente. Per generare l’estratto arricchito LLO, CLM24 che trasporta il plasmide pMW07-pglΔB è stato usato come ceppo di origine. Per generare un estratto di un vaso contenente sia OST che LLOs, è stato utilizzato CLM24 che trasportava pMW07-pglΔB e pSF-CjOST come ceppo sorgente. Se necessario, l’espressione dei componenti della glicosilazione è stata indotta con l-arabinosio alla concentrazione finale dello 0,02% (p/v%)., Dopo l’induzione, l’espressione proteica è stata autorizzata a procedere a 30 °C ad una densità di OD600 ~3, a quel punto le cellule sono state raccolte per centrifugazione (5000×g) a 4 ° C per 15 min. Tutte le fasi successive sono state eseguite a 4 °C se non diversamente indicato. Le cellule pellettate sono state lavate tre volte in tampone S30 (acetato di tris da 10 mm, acetato di magnesio da 14 mm, acetato di potassio da 60 mM, pH 8,2). Dopo l’ultimo lavaggio, le cellule sono state pellettate a 7000×g per 10 min e flash-congelate su azoto liquido. Per produrre lisato, le cellule sono state scongelate e risospese all’omogeneità in 1 mL di tampone S30 per 1 g di massa cellulare umida., Le cellule sono state interrotte utilizzando un omogeneizzatore ad alta pressione Avestin emulsionflex-B15 a 20.000-25.000 psi con un singolo passaggio. Il lisato è stato quindi centrifugato due volte a 30.000×g per 30 minuti per rimuovere i detriti cellulari. Il surnatante è stato trasferito in una nuova nave e incubato con agitazione a 250 giri / min a 37 ° C per 60 min per degradare i trascritti endogeni dell’mRNA e interrompere i complessi polisomi esistenti nel lisato. Dopo centrifugazione (15.000×g) per 15 minuti a 4 °C, il surnatante è stato raccolto, aliquota, congelato in azoto liquido e conservato a -80 °C., L’estratto di S30 è stato attivo per circa tre cicli di congelamento-disgelo e conteneva ~ 40 g di proteina totale L−1 misurata dal test di Bradford.

Sintesi di glicoproteina senza cellule

Per la glicosilazione in vitro della proteina accettore purificata, sono state effettuate reazioni in un volume di 50 µL contenente 3 µg di scFv13-R4DQNAT, 2 µg di CjPglB purificato e 5 µg di LLO estratto (nel caso di Man3GlcNAc2 LLO, sono stati utilizzati 20 µg) in tampone di glicosilazione 10 mm MnCl2 e 0,1% (w / v%) DDM). La miscela di reazione è stata incubata a 30 ° C per 16 ore., Per l’espressione a base di estratto grezzo di glicoproteine, è stato implementato uno schema a due fasi. Nella prima fase, la sintesi proteica è stata effettuata con un sistema PANOx-SP modificato67. In particolare, le provette per microcentrifuga da 1,5 ml sono state caricate con reazioni da 15 µL contenenti DNA plasmidico 200 ng, estratto S30 al 30% (v/v%) e quanto segue: glutammato di magnesio da 12 mm, glutammato di ammonio da 10 mm, glutammato di potassio da 130 mm, adenosina trifosfato (ATP) da 1,2 mM, guanosina trifosfato citidina trifosfato (CTP), 0,034 mg mL-1 acido folinico, 0.,171 mg mL−1 E. coli tRNA (Roche), 2 mm ciascuno di 20 aminoacidi, 30 mM fosfoenolpiruvato (PEP, Roche), 0,4 mM nicotinamide adenina dinucleotide (NAD), 0,27 mM coenzima-A (CoA), 4 mm acido ossalico, 1 mm putrescina, 1,5 mM spermidina e 57 mM HEPES. Per scFv13-R4DQNAT, hEPO22-DQNAT-26, hEPO36-DQNAT-40 e hEPO81-DQNAT85, questa fase è stata eseguita a 30 °C per 4 h in condizioni di ossidazione mentre per sfGFP217-DQNAT e sfGFP217-AQNAT questa fase è stata eseguita a 30 °C per 5 min in condizioni di riduzione., Per le condizioni ossidanti, l’estratto è stato pre-condizionato con 750 µM di iodoacetamide al buio a temperatura ambiente per 30 min e la miscela di reazione è stata fornita con 200 mm di glutatione in un rapporto 3:1 tra forme ossidate e ridotte. I rendimenti attivi sfGFP da reazioni senza cellule sono stati quantificati misurando fluorescenza in-lisato e convertendo in concentrazione utilizzando una curva standard come precedentemente descritto39. Nella seconda fase, la glicosilazione proteica è stata iniziata con l’aggiunta di MnCl2 e DDM ad una concentrazione finale di 10 mM e 0.,1% (p/v%), rispettivamente, e ha permesso di procedere a 30 ° C per 16 h. Se necessario, le reazioni sono state integrate con 2 µg di CjPglB purificato (cioè, per CFGpS con estratti arricchiti con LLO) o 5 µg di CjLLOs estratto con solvente (cioè, per CFGpS con estratti arricchiti con OST). Tutte le reazioni sono state interrotte aggiungendo tampone di campione Laemmli contenente 5% ßME, dopo di che i campioni sono stati bolliti a 100 °C per 15 min e analizzati da SDS-PAGE e western blotting.

Western blot analysis

Campioni contenenti 0,5 µg di proteina accettore sono stati caricati in gel SDS-PAGE., Dopo la separazione elettroforetica, le proteine sono state trasferite dai gel sulle membrane di difluoruro di polivinilidene Immobilon-P (PVDF) (0,45 µm) secondo il protocollo del produttore. Le membrane sono state lavate due volte con tampone TBS (80 g L−1 NaCl, 20 g L−1 KCl e 30 g L−1 Tris-base) seguito da incubazione per 1 h in soluzione di blocco (50 g L−1 latte non grasso in TBST (TBS fornito con 0,05% (v/v%) Tween-20)). Dopo il blocco, le membrane sono state lavate 4 volte con TBST con incubazione di 10 minuti tra ogni lavaggio., Una prima membrana è stato sondato con 6xHis-anticorpo policlonale (Abcam, ab137839, 1:7500) che riconosce specificamente hexahistidine epitopo tag, mentre una seconda replica di membrana è stato sondato con uno dei seguenti: hR6 (1:10.000), l’siero di coniglio che riconosce il nativo di C. jejuni e C. lari glycan così come progettato C. lari glycan o ConA-HRP (Sigma, L6397, 1:2500) che riconosce Man3GlcNac e Man3GlcNAc2. Il sondaggio delle membrane è stato eseguito per almeno 1 h con agitazione a temperatura ambiente, dopo di che le membrane sono state lavate con TBST nello stesso modo descritto sopra., Per lo sviluppo, le membrane sono state incubate brevemente a temperatura ambiente con Western ECL substrate (BioRad) e imaged utilizzando un sistema ChemiDocTM XRS+. Gli enzimi OST arricchiti in estratti sono stati rilevati con una procedura identica di SDS-PAGE seguita dall’analisi Western blot con un anticorpo policlonale specifico per il tag epitopo di BANDIERA (Abcam, ab49763, 1:7500). Il componente glicano di LLO arricchito in estratti è stato rilevato individuando direttamente 10 µL di estratti sulle membrane di nitrocellulosa seguita da rilevazione con siero hR6. Le immagini immunoblot non tagliate sono mostrate in Fig. 8.,

MS analysis

Circa 2 µg di proteina scFv13-R4DQNAT in soluzione sono stati denaturati con urea di 6 M, ridotti con DTT di 10 mm, incubati a 34 °C per 1 h, quindi alchilati con iodoacetamide di 58 mM per 45 min al buio a temperatura ambiente e spenti con DTT finale di 36 mm. La soluzione è stata poi diluita con 50 mm di bicarbonato di ammonio (pH 8,0) ad una concentrazione tampone finale di 1 M di urea prima della digestione della tripsina. Il campione è stato digerito con 0,2 µg di tripsina per 18 ore a 37 °C. La digestione è stata interrotta mediante aggiunta di TFA a un pH finale 2,2–2,5., I campioni sono stati poi dissalati con la cartuccia SOLA HRP SPE (ThermoFisher Scientific). Le cartucce sono state condizionate con 1 × 0,5 ml 90% metanolo, 0,1% acido trifluoroacetico (TFA) ed equilibrate con 2 × 0,5 ml 0,1% (v/v%) TFA. I campioni sono stati diluiti 1: 1 con TFA allo 0,2% (v/v%) ed eseguiti lentamente attraverso le cartucce. Dopo il lavaggio con 2 × 0,5 mL di soluzione di equilibrio, i peptidi sono stati eluiti da 1 × 0,5 ml di 50% (v/v%) acetonitrile (ACN), 0,1% (v/v%) TFA e asciugati in una centrifuga a vuoto veloce.,

L’analisi nanoLC–MS/MS è stata effettuata utilizzando UltiMate3000 RSLCnano (Dionex) accoppiato ad uno spettrometro di massa Orbitrap Fusion (ThermoFisher Scientific) dotato di una sorgente di ioni nanospray Flex. Ogni campione è stato ricostituito in 22 µL di 0,5% (w/v%) FA e 10 µL è stato caricato su una colonna trappola Acclaim PepMap 100 C18 (5 µm, 100 µm × 20 mm, 100 Å, ThermoFisher Scientific) con raccordi nanoViper a 20 µL min−1 di 0,5% FA per la desalinizzazione on-line., Dopo 2 min, la valvola di commutazione di consentire peptidi di essere separati su un Plauso PepMap C18 nano colonna (3 µm 75 µm × 25 cm, ThermoFisher Scientific), in 90 min pendenza di 5 al 23% e il 35% B a 300 nL min−1 (3 a da 73 a 93 min, rispettivamente), seguita da 9 min rampa per il 90% B, 9 min tenere al 90% B e rapido passaggio al 5% di B in 1 min. La colonna è stata riequilibrata con il 5% B per 20 minuti prima della corsa successiva. La fusione Orbitrap funzionava in modalità di ioni positivi con tensione nanospray impostata a 1,7 kV e temperatura della sorgente a 275 °C., La calibrazione esterna per gli analizzatori di massa FT, IT e quadrupolo è stata eseguita prima dell’analisi. L’Orbitrap full MS survey scan (m / z 400-1800) è stata seguita da Top 3 s data-dependent Higher Collision dissociation product ion triggered ETD (HCD-pd-ETD) MS/MS scansioni per peptidi precursori con 2-7 cariche al di sopra di un conteggio ionico soglia di 50.000 con energia di collisione normalizzata del 32%., Le scansioni MS survey sono state acquisite con un potere risolutivo di 120.000 (FWHM a m / z 200), con controllo automatico del Gin (AGC) = 2e5 e tempo massimo di iniezione (Max IT) = 50 ms, e scansioni HCD MS/MS a una risoluzione di 30.000 con AGC = 5e4, Max IT = 60 ms e con finestra di isolamento Q (m/z) a 3 per l’intervallo di massa m/z 105-2000. I parametri di esclusione dinamica sono stati fissati a 1 entro 60 s di durata di esclusione con ±10 ppm di larghezza della massa di esclusione. La lista di innesco dello trigger del prodotto ha consistito dei picchi a 204,0867 Da (Hex dell’ossonio di HexNAc), 138,0545 Da (frammento di HexNAc) e 366,1396 Da (ioni dell’ossonio di HexHexNAc)., Se è stato rilevato uno degli ioni prodotti HCD nell’elenco, due scansioni ETD MS/MS (ETHCD) dipendenti dalla carica con attivazione supplementare HCD (SA) sullo stesso precursor precursore sono state attivate e raccolte in una trappola ionica lineare. Per i precursori a doppia carica, il tempo di reazione ETD fissato a 150 ms e l’energia SA sono stati fissati al 30%, mentre gli stessi parametri a 125 ms e 20%, rispettivamente, sono stati utilizzati per i precursori a carica più elevata. Per entrambe le scansioni attivate da ioni, l’obiettivo del reagente fluorantene ETD è stato fissato a 2e5, l’obiettivo AGC a 1e4, il massimo a 105 ms e la finestra di isolamento a 3. Tutti i dati sono stati acquisiti utilizzando Xcalibur 3.,0 software operativo e applicazione Orbitrap Fusion Tune v. 2.1 (ThermoFisher Scientific).

Tutti gli spettri grezzi MS e MS/MS di ciascun campione sono stati ricercati utilizzando Byonics v. 2.8.2 (metriche proteiche) utilizzando il database proteico E coli con sequenza target di proteine SCFV13-R4DQNAT aggiunta. I parametri di ricerca del peptide erano come segue: due scissione mancata per la digestione completa della tripsina con modificazione fissa del carbamidometil della cisteina, modificazioni variabili dell’ossidazione della metionina e deamidazione sui residui di asparagina/glutammina., La tolleranza di massa del peptide era 10 ppm ed i valori di tolleranza di massa del frammento per gli spettri di ETHCD e di HCD erano 0,05 e 0,6 Da, rispettivamente. Sia il numero massimo di modifiche comuni che rare sono stati fissati a due. La ricerca di glycan è stata eseguita su un elenco di 309 glicani N-linked di mammiferi nel software Byonic. I peptidi identificati sono stati filtrati per un massimo di 2% FDR. Il software ha esportato i risultati della ricerca in un foglio di calcolo.

Attività di fluorescenza GFP

L’attività della sfGFP derivata senza cellule è stata determinata utilizzando un’analisi di fluorescenza in lisato come descritto in precedenza39., In breve, 2 µL di reazione sfGFP glicosilata sintetizzata senza cellule sono stati diluiti in 48 µL di acqua nanopura. La soluzione è stata quindi posta in una piastra di analisi nera Costar 96-well (Corning). Le lunghezze d’onda di eccitazione ed emissione per la fluorescenza sfGFP erano rispettivamente di 485 e 528 nm.

Analisi immunoassorbente legata all’enzima (ELISA)

Le piastre ELISA Costar 96-well (Corning) sono state rivestite durante la notte a 4 °C con 50 µl di 1 mg mL-1 E. coli β−gal (Sigma-Aldrich) in tampone di carbonato di sodio da 0,05 M (pH 9,6)., Dopo il blocco con il 5% (p/v%) di albumina sierica bovina (BSA) in PBS per 3 ore a temperatura ambiente, le piastre sono state lavate quattro volte con tampone PBST (PBS, 0,05% (v/v%) Tween-20, 0,3% (p/v%) BSA) e incubate con campioni scFv13-R4 purificati diluiti in serie o frazioni solubili di lisati CFGpS per 1 ora a temperatura ambiente. I campioni sono stati quantificati dal test di Bradford e una quantità equivalente di proteine totali è stata applicata alla piastra. Dopo aver lavato quattro volte con lo stesso tampone, l’anticorpo policlonale di coniglio coniugato anti-6×-His-HRP (Abcam) in 3% PBST è stato aggiunto a ciascun pozzetto per 1 h., Le piastre sono state lavate e sviluppate utilizzando protocolli standard.

Test di proliferazione cellulare in vitro

Eritroleucemia umana Sono state utilizzate cellule TF-1 (Sigma) che richiedono fattore stimolante le colonie di granulociti–macrofagi (GM-CSF), interleuchina 3 (IL-3) o hEPO per la crescita e la sopravvivenza. Le cellule sono state mantenute in supporti RPMI−1640 integrati con 10% FBS, 50 U mL−1 penicillina, 50 mg mL−1 streptomicina, 2 mm glutammina e 2 ng mL-1 GM-CSF a 37 °C in un’atmosfera umidificata contenente 5% CO2., Dopo l’incubazione di 16 ore in mezzi RPMI-1640 senza GM-CSF, le cellule sono state contate, raccolte e risospese in mezzi freschi. Le cellule 5 × 103 TF-1 per pozzetto sono state seminate in una piastra di analisi a 96 pozzetti e sono stati aggiunti standard o campioni di EPO alle concentrazioni finali desiderate per ciascun pozzetto. Le cellule sono state incubate con per 6 h in incubatore umido prima di aggiungere alamarBlue®. Dopo 12 ore, il segnale di fluorescenza è stato misurato a 560 nm/590 nm di eccitazione / lunghezza d’onda di emissione.,

Disponibilità dei dati

Tutti i dati generati durante lo studio sono inclusi in questo articolo e nei suoi file di informazioni supplementari e sono disponibili presso gli autori su ragionevole richiesta.