Sedi di laboratorio

Tutto il lavoro sul DNA che ha coinvolto i parenti moderni è stato effettuato presso l’Università di Leicester. I parenti di linea maschile sono stati digitati utilizzando Promega PowerPlex Y23 e per SNP che definiscono i principali aplogruppi Y europei a Leicester con un sottoinsieme della digitazione confermata all’Université Paul Sabatier. I parenti di linea femminile sono stati sequenziati per l’intero genoma mitocondriale presso l’Università di Leicester., Il DNA è stato estratto da antichi denti e ossa presso l’Università di York e l’Université Paul Sabatier, Tolosa. La preparazione della biblioteca e l’arricchimento dell’obiettivo sono stati fatti all’Università di York. Il sequenziamento single-end 100-bp utilizzando un HiSeq 2000 (Illumina, CA, USA) è stato eseguito presso la struttura di sequenziamento di Copenhagen. Il sequenziamento mirato del DNA sia moderno che antico è stato effettuato anche presso la piattaforma tecnica genomica PlaGe (Genopole, Tolosa, Francia) e presso il laboratorio di chimica degli acidi nucleici delle proteine presso l’Università di Leicester. Di seguito forniamo una versione condensata dei metodi utilizzati., Per ogni fase, informazioni complete possono essere trovate nei metodi supplementari. I dettagli relativi alla vasta ricerca genealogica svolta per questo progetto sono disponibili nella Nota complementare 2.

Raccolta di campioni

Il DNA è stato estratto da campioni di saliva dei moderni parenti di Riccardo III e tutti i partecipanti sono stati reclutati con il consenso informato dopo la revisione del progetto da parte del Comitato etico di ricerca dell’Università di Leicester.

Lo scheletro 1 è stato scavato e i campioni prelevati in condizioni pulite37., Tutti i soggetti coinvolti nello scavo presso il sito Grey Friars, il clean laboratory di Leicester e quelli coinvolti nei laboratori e nei lavori di laboratorio avevano i loro cromosomi mitocondriali e, per i maschi, Y tipizzati. Il DNA è stato estratto da campioni di saliva e tutti i partecipanti sono stati reclutati con il consenso informato.

Estrazione del DNA di campioni antichi

Il DNA è stato estratto da campioni di denti e ossa (femore). Tutte le procedure sono state eseguite in laboratori dedicati di DNA antico presso l’Università di York e l’Université Paul Sabatier, Tolosa con opportune precauzioni di contaminazione in atto., Due pezzi di estrazione sono stati inclusi e trattati esattamente come se fossero estratti durante l’intero processo. Le PCR e gli esperimenti di libreria includevano anche ulteriori controlli vuoti.

Sex-typing assay eseguito su Skeleton 1

È stato utilizzato un test di sex-typing di nuova concezione composto da primer PCR per la co-amplificazione del frammento SRY con regioni UTX e hom omologhe. Questo test è stato progettato per consentire frammenti di dimensioni relativamente piccole di SRY, UTX e UTY di essere co-amplificati da campioni che potrebbero contenere DNA10 degradato.,

Regione di controllo mitocondriale Analisi dello scheletro 1

L’analisi dei segmenti ipervariabili (HV1, HV2 e HV3) della regione di controllo mtDNA è stata effettuata amplificando e sequenziando direttamente più frammenti sovrapposti di dimensioni comprese tra 153 e 250 bp (http://forensic.yonsei.ac.kr/protocol/mtDNA-midi-mini.pdf)22. Una selezione di ampliconi è stata utilizzata per clonare i prodotti PCR nel laboratorio di Tolosa. Il sequenziamento è stato effettuato utilizzando il Big-Dye Terminator V3.,1 kit di sequenziamento a ciclo (Applied Biosystems) e mediante elettroforesi capillare su analizzatore genetico ABI Prism 3730 (Applied Biosystems) presso il Laboratorio di Chimica degli acidi nucleici proteici dell’Università di Leicester o presso la piattaforma tecnica genomica PlaGe (Genopole).

Mitochondrial genome/Y-SNP/HIrisplex typing of Skeleton 1

Le librerie sono state costruite dopo Meyer e Kircher16, con l’eccezione che la prima fase di filtrazione tra la riparazione dell’estremità smussata e la legatura dell’adattatore è stata sostituita dall’inattivazione del calore degli enzimi38,39., Sono stati progettati due microarray, uno per l’arricchimento mtDNA e un altro per l’arricchimento nucleare SNP. L’arricchimento del DNA è stato eseguito mediante cattura di ibridazione utilizzando il microarray Agilent 244k DNA SureSelect (Agilent, Böblingen, Germania). Per la cattura nucleare, le sonde del cromosoma Y sono state progettate per coprire gli SNP rilevanti per le principali linee europee14. Ulteriori sonde sono state progettate per coprire gli SNP rilevanti per i marcatori HIrisplex31. Questi due set di sonde (mitocondriali e SNPs) sono stati utilizzati separatamente per riempire i due diversi disegni microarray di un formato 1 × 244K., Per ogni microarray, il protocollo di cattura è stato eseguito seguendo Hodges et al.15 con le modifiche proposte da Zhang et al.40 e Fortes e Paijmans38. Le biblioteche sono state raggruppate in quantità equimolari e sequenziate su due corsie della piattaforma Illumina HiSeq 2000 in modalità 100 SE presso la struttura di sequenziamento dell’Università di Copenaghen, in Danimarca.

Le letture grezze di ogni libreria sono state ordinate in base all’indice a sei nucleotidi utilizzato durante la preparazione della libreria. Solo le letture con una corrispondenza del 100% all’indice sono state selezionate per ulteriori analisi., Letture inferiori a 25 nucleotidi sono stati scartati da ulteriori analisi. Le letture tagliate sono state mappate agli autosomi e ai cromosomi sessuali dal genoma umano di riferimento build 37 (GRCh37) e agli RCR (NC_012920.1) utilizzando bwa 0.7.5 a-r405 (ref. 41). In ogni allineamento, i file bam di output sono stati uniti usando SAMtools 0.1.19 (ref. 41) e duplicati PCR sono stati rimossi successivamente. Le letture mappate sono state filtrate in base a una qualità di mappatura > 29 e al loro allineamento a posizioni univoche lungo la sequenza di riferimento.,

Le posizioni polimorfiche sono state identificate usando SAMtools (SAMtools 0.1.19) e bcftools. Infine, vcfutils.pl è stato utilizzato per filtrare l’elenco delle varianti in base a una qualità di probabilità posteriore del genotipo in scala Phred >20 e una profondità di lettura superiore a 10. Per evitare errori di chiamata a causa del modello di deaminazione di antiche molecole di DNA, tutte le posizioni polimorfiche riportate nel file di output vcf sono state controllate ad occhio., Nel caso del genoma mitocondriale, l’assemblaggio al riferimento è stato visualizzato in Tablet42, mentre l’allineamento delle letture contenenti gli SNPs ai cromosomi di riferimento è stato visualizzato utilizzando IGV43.

Tipizzazione SNP mediante PCR

L’approccio di cattura ha prodotto una copertura insufficiente per tutti gli SNP HIrisPlex e del cromosoma Y e quindi i primer sono stati progettati per generare ampliconi contenenti questi SNP e due SNP, che definiscono ulteriormente l’aplogruppo G del cromosoma Y: M285 (G1) e P287 (G2) (ref. 14). Questi sono stati amplificati come parte delle reazioni multiplex seguenti Römpler et al.,44 o singleplex reazioni (utilizzando 40 cicli e senza amplificazione secondaria) e sequenziati sul Torrente Ion dopo preparazione libreria utilizzando Ion PGM 200 Xpress Template Kit e PGM 200 Sequencing Kit. Per aumentare la copertura, la PCR singleplex e il sequenziamento di un marcatore (rs28777) sono stati effettuati secondo Binladen et al.45

La digitazione dell’aplogruppo G che definisce SNPs (M201, M285 e P287) è stata ripetuta a Tolosa utilizzando PCR singleplex. Il sequenziamento di questi prodotti PCR è stato effettuato utilizzando Terminator V3 Big-Dye.,1 kit di sequenziamento del ciclo (Applied Biosystems) analizzato mediante elettroforesi capillare su un analizzatore genetico ABI Prism 3730 (Applied Biosystems) presso la piattaforma tecnica genomica PlaGe (Genopole).

Y-cromosomico aplotipo analisi

Antichi e moderni campioni’ Y-cromosomico aplotipi sono stati ottenuti utilizzando il PowerPlex Y23 System (Promega) e analizzati mediante elettroforesi capillare su un ABI Prism 3730 Genetica Analizzatore (Applied Biosystems) a livello genomico piattaforma tecnica PlaGe (Genopole) e su un ABI Prism 3130xl Genetica Analizzatore (Applied Biosystems) presso l’Università di Leicester., Per Skeleton 1, questo è stato effettuato su tre estratti separati (RM2, LM1 e LM3) in due diversi laboratori di DNA antico (York e Tolosa). Per i parenti moderni, questo è stato effettuato su due diversi estratti in due diversi laboratori moderni (Leicester e Tolosa).

Analisi SNP cromosomica Y di campioni moderni

In seguito alla determinazione dell’aplotipo Y per i moderni campioni di linea maschile, l’aplogruppo previsto è stato determinato utilizzando il predittore dell’aplogruppo di Whit Athey (http://www.hprg.com/hapest5/hapest5a/hapest5.htm?order=num)., I marcatori binari che coprono questi e relativi lignaggi sono stati digitati in due multiplex mediante la procedura di minisequencing SNaPshot (Applied Biosystems) e un analizzatore genetico ABI3130xl (Applied Biosystems) seguito da conferma utilizzando il sequenziamento Sanger. Somerset 3 è stato determinato per essere Hg I (M170+ M223−, M253−)14 derivato, ulteriormente confermato dal laboratorio di Tolosa. Somersets 1,2,4 e 5 sono stati determinati per essere derivati per R1b-U152. Somersets 1,2,4 e 5 sono stati testati per SNPS suddividendo questo clade13 (Z56, M126, Z36, Z192, M160 e L2) utilizzando il sequenziamento Sanger in entrambi i laboratori.,

Analisi mtDNA moderna

Entrambi i campioni sono stati replicati due volte.

I campioni sono stati prelevati utilizzando kit di raccolta del DNA di Oragene (DNA Genotek) e il DNA estratto utilizzando due diversi metodi: il protocollo Qiacube Sangue e fluido corporeo (200 µl con eluizione 200 µl) e il protocollo Oragene. Per analizzare la regione di controllo, i campioni sono stati sequenziati due volte sia in avanti che in retromarcia utilizzando due set di primer sovrapposti (15973-296 e 16524-614) utilizzando Big-Dye Terminator V 3.1 (Applied Biosystems). Non sono state riscontrate differenze tra le repliche o tra i campioni.,

I campioni sono stati amplificati per il genoma mitocondriale completo da entrambe le estrazioni dopo Meyer et al.26 ampliconi PCR sono stati sequenziati su un sequencer Ion Torrent PGM su un chip Ion314. Le librerie sono state preparate utilizzando il Ion Xpress Plus gDNA Fragment Library Preparation kit, mentre la preparazione del modello e il sequenziamento sono stati eseguiti utilizzando rispettivamente il Ion PGM 200 Xpress Template Kit e il Ion PGM 200 Sequencing Kit. Le letture raw sono state mappate nuovamente su rCRS (NC_012920.1) utilizzando il software TMAP incluso nel plugin di allineamento Ion 3.2.1 (Torrent Suite Software 3.2.,1) sul server Ion Torrent. Duplicate reads rimozione e variante chiamata sono state eseguite utilizzando SAMtools 0.1.19 (ref. 41) e il riallineamento locale è stato effettuato con il kit di strumenti per l’analisi del Genome46. I siti varianti sono stati filtrati per la Qualità di base 20, la qualità di mappatura 50 e la profondità di copertura 30 in seguito alla quale sono stati mantenuti i siti polimorfici 33. Tutti questi siti sono stati controllati manualmente e confermati dal sequenziamento Sanger in entrambe le direzioni e replicati due volte.,

Controllo e quantificazione della contaminazione

La contaminazione moderna del DNA dei resti antichi è stata controllata con i seguenti metodi:

  1. 1

    Lo scavo è stato effettuato in condizioni pulite (vedi Metodi supplementari)

  2. 2

    I campioni sono stati conservati in laboratori puliti e il lavoro sul DNA antico è stato

  3. 3

    Campioni antichi separati sono stati elaborati in laboratori separati per replicare i risultati.,

  4. 4

    Tutti i membri del laboratorio e i partecipanti allo scavo hanno digitato il loro mtDNA e la tipizzazione del cromosoma Y è stata effettuata su tutti gli uomini coinvolti. Nessuno aveva un tipo di mtDNA o cromosoma Y corrispondente.

Come prova contro una contaminazione significativa, l’analisi del DNA dello scheletro 1 mostra una perfetta corrispondenza mtDNA con ML1 e una differenza a base singola con ML2. Mostra anche un chiaro aplotipo Y-STR, che è stato replicato utilizzando una serie di estratti generati e testati in due laboratori separati., Infine, un esame (vedi Metodi supplementari) del modello di sostituzione nelle nostre letture supporta anche questo.

Analisi statistica

Adottando un approccio conservativo ad ogni passo, abbiamo calcolato una probabilità per ogni elemento di evidenza osservata sotto ciascuna delle due ipotesi opposte: Ipotesi 1 (H1): lo scheletro 1 è Riccardo III e Ipotesi 2 (H2): lo scheletro 1 non è Riccardo III.,

Poiché era ragionevole supporre che tutte le diverse linee di prova fossero indipendenti, la probabilità congiunta di tutte le prove è stata ottenuta moltiplicando le singole probabilità sotto ogni ipotesi. Il peso delle prove per H1, chiamato rapporto di verosimiglianza (LR), è stato quindi dato dal rapporto tra la probabilità sotto H1 e quella sotto H2. Diciamo che un’ipotesi è “conservativa” se riduce l’LR.

LR può essere convertito in una probabilità che H1 sia vero, data una probabilità precedente., Abbiamo preso come punto di partenza il momento in cui Skeleton 1 è stato osservato per la prima volta e riconosciuto come uno scheletro umano, ma prima di qualsiasi valutazione di età, sesso, stato di salute e causa di morte sono state fatte. A quel punto, si registra una sostanziale evidenza che uno scheletro trovato in ciò che si crede sia stata la posizione di Leicester Grigio Frati coro potrebbe essere quello di riccardo III. Tutte le informazioni disponibili al momento in cui Scheletro 1 è stato portato alla luce, tra cui la sua precisa ubicazione e la natura della tomba, è stato considerato per l’analisi, come informazioni di base che possono informare la probabilità precedente., Sulla base di tali informazioni, riteniamo che un osservatore scettico non avrebbe potuto ragionevolmente assegnare una probabilità precedente inferiore a 1 su 40. Questo valore è stato proposto in un’analisi precedente (http://rationalgareth.com/), sulla base di quelle che giudichiamo essere valutazioni scettiche. La più alta probabilità che potrebbe essere giustificata dalle prove precedenti potrebbe essere 1 su 2.

Abbiamo utilizzato i dati pertinenti e disponibili ove possibile. Inevitabilmente sono necessari giudizi soggettivi, ad esempio le popolazioni di riferimento rilevanti e le probabilità di errore nei fatti segnalati., Per quanto sembrava possibile e ragionevole, ci siamo sforzati di essere prudenti nel nostro approccio, ad esempio, usando un metodo pseudocount per polarizzare l’LR verso un valore neutro di 1, tendendo così ad evitare valori spuri di grandi dimensioni da basse frequenze osservate. Dettagli dei dati e dei metodi utilizzati nell’analisi statistica dei dati radiocarbonici, età e sesso dello scheletro, presenza di scoliosi, presenza di ferite perimortem, cromosoma Y e dati di frequenza mtDNA possono essere trovati nei metodi supplementari. Per riassumere i risultati: i dati al radiocarbonio hanno prodotto un rapporto di verosimiglianza di 1.,84 che rappresenta il supporto limitato per H1. I dati di età e sesso hanno prodotto una razione di probabilità di 5.25, che rappresenta ancora una volta un supporto limitato per H1. La presenza di una spalla più alta dell’altra, riportata durante la vita di Richard, potrebbe essere attribuita alla scoliosi (lo scheletro 1 aveva una grave scoliosi idiopatica ad esordio adolescenziale) o altre due condizioni note, la paralisi di Erb e la deformità di Sprengel, entrambe molto rare. Sotto H1, i tassi di cui sopra danno una probabilità stimata di 0.,90 di osservare la scoliosi data la descrizione dell’aspetto fisico di Riccardo III (=il tasso di scoliosi diviso per la somma dei tre tassi), che abbiamo moltiplicato per 0,95 per consentire la possibilità che la descrizione registrata fosse errata. Ciò ha portato a un LR di 212, fornendo un supporto moderatamente forte per H1. La presenza di lesioni perimortem ha dato un LR di 42, e quindi un supporto moderato per H1. Il cromosoma Y dello Scheletro 1 non corrispondeva a quello dei parenti patrilineari genealogicamente determinati di Riccardo III., Questo potrebbe essere spiegato da un evento di falsa paternità in uno o più dei 19 putativi legami padre–figlio tra Riccardo III e Henry Somerset, quinto duca di Beaufort. I risultati del cromosoma Y indicano anche un ulteriore evento di falsa paternità tra Henry Somerset e i suoi cinque discendenti patrilineari contemporanei. Per essere prudenti, abbiamo selezionato un tasso di falsa paternità pubblicato che era (1) inferiore a qualsiasi altro tasso pubblicato che abbiamo considerato17,47 e (2) in base ai dati genealogici18., A questo aggiungiamo l’evento di falsa paternità nei 19 putativi legami padre-figlio tra Henry Somerset e cinque capriole maschili contemporanee. Questo dà una probabilità di almeno un falso evento di paternità nei 19 putativi legami padre-figlio tra Riccardo III e Henry Somerset di 0.16. Dato che un evento di falsa paternità deve essersi verificato sotto H1, la frequenza di popolazione dell’aplotipo Y dello scheletro 1 è la stessa sotto H1 e H2 e si annulla nel calcolo LR. Pertanto, l’LR è 0.16, che rappresenta prove limitate contro H1.,

Le sequenze mtDNA dello Scheletro 1 e il presunto parente matrilineare 19-meiosi di Riccardo III, Michael Ibsen, corrispondevano completamente. Anche un parente di 21-meiosi corrispondeva ad eccezione di una base (8994). Quest’ultima osservazione è ugualmente probabile sotto H1 e H2 data la sequenza osservata di Michael Ibsen, e quindi si annulla nell’LR. Quindi, abbiamo solo bisogno di verosimiglianze per l’osservazione della sequenza condivisa da Michael Ibsen e Skeleton 1.

Per ottenere la probabilità sotto H1, abbiamo bisogno del tasso di mutazione mtDNA, e in questo caso le stime elevate sono conservative. Parsons et al.,28 rapporto 10 mutazioni regione di controllo in 327 generazioni utilizzando dati genealogici. Poiché questo suggerisce un tasso più elevato rispetto ad altre stime pubblicate, e si basa su dati genealogici, lo abbiamo usato per ricavare una probabilità di 0,52 per nessuna mutazione in 19 meioses.

Per la probabilità sotto H2, richiediamo la frazione di popolazione dello scheletro 1 aplotipo. Anche se abbiamo ottenuto la sequenza completa del genoma mtDNA da Skeleton 1, abbiamo identificato pochi dati di confronto del genoma intero pubblicati dall’Inghilterra., Pertanto, per l’analisi statistica, abbiamo utilizzato solo le regioni di controllo mtDNA tra le posizioni 16,093 e 16,320 e tra 00073 e 00188, per le quali abbiamo ottenuto dati di confronto in inglese adeguati da un aggiornamento di Röhl et al.30, integrato con sequenze mtDNA fornite da Roots for Real (Genetic Ancestor Ltd., Clare, Suffolk, Regno Unito). L’utilizzo solo di queste brevi sezioni della regione di controllo sotto H2 è conservativo, poiché la frazione di popolazione delle sequenze di regione di controllo osservate non può essere inferiore a quella del genoma completo del mtDNA., La popolazione di riferimento rilevante è di oltre 500 anni nel passato, ma a causa delle grandi dimensioni della popolazione nel periodo considerato, ci aspettiamo che le frequenze della popolazione siano cambiate poco negli ultimi cinque secoli. Abbiamo trovato la frequenza dell’aplotipo Skeleton 1 0 tra 1823 nel database, a cui aggiungiamo l’unica istanza osservata in Michael Ibsen. Questo approccio è, ancora una volta, conservatore come Michael è stato campionato a causa della sua nota relazione genealogica a Riccardo III. Questo porta ad un LR di 478 che rappresenta moderatamente forte evidenza per H1.,

Abbiamo anche notato che non c’erano corrispondenze in un database di 26.127 aplotipi della regione di controllo mitocondriale europea (www.empop.org) 29. Non facciamo affidamento su questo database perché è a livello europeo piuttosto che specifico per l’Inghilterra ea causa di problemi di accertamento, ma suggerisce che l’aplotipo Skeleton 1 può essere molto più raro di quanto si possa dedurre dal nostro database inglese più piccolo. Notiamo anche che la mobilità femminile tra la nobiltà europea è probabilmente stata molto più elevata rispetto alla popolazione generale, a causa delle pratiche matrimoniali relative alla formazione di alleanze politiche., Tali pratiche fornirebbero una giustificazione per l’utilizzo del database mtDNA europeo, e quindi per considerare l’aplotipo trovato in Skeleton 1 e Michael Ibsen estremamente raro. Nella tabella supplementare 10, mostriamo alcuni risultati illustrativi utilizzando la banca dati europea per dimostrare le implicazioni di stabilire che l’aplotipo Skeleton 1 è raro come suggerito da tale banca dati.

Le LRs per diverse combinazioni di prove e due probabilità posteriori sono mostrate nella Tabella supplementare 10., Usando tutte le prove, il supporto per H1 è estremamente forte con un LR di 6,7 milioni, così che il nostro scettico sarebbe portato alla conclusione che la probabilità che Skeleton 1 non sia Riccardo III è inferiore a 1 su 100.000, mentre per coloro che assumono una posizione di partenza 1 su 2 quella probabilità è molto inferiore a 1 su un milione. Tenendo conto delle ipotesi conservative alla base del nostro calcolo sopra descritto, consideriamo questo come stabilire la verità di H1 oltre ogni ragionevole dubbio.