Emplacements des laboratoires

tous les travaux D’ADN impliquant les parents modernes ont été effectués à l’Université de Leicester. Les parents mâles ont été typés en utilisant Promega PowerPlex Y23 et pour les SNP définissant les principaux haplogroupes Y Européens à Leicester, un sous-ensemble du typage étant confirmé à L’Université Paul Sabatier. Les parents de lignée féminine ont été séquencés pour l’ensemble du génome mitochondrial à l’Université de Leicester., L’ADN a été extrait de dents et d’OS anciens à L’Université D’York et à L’Université Paul Sabatier de Toulouse. La préparation de la bibliothèque et l’enrichissement des cibles ont été effectués à L’Université de York. Le séquençage à une extrémité de 100 bp à l’aide d’un HiSeq 2000 (Illumina, CA, USA) a été effectué à L’installation de séquençage de Copenhague. Le séquençage ciblé de L’ADN moderne et ancien a également été réalisé au genomic technical platform PlaGe (Genopole, Toulouse, France) et au Protein Nucleic Acid Chemistry Laboratory de L’Université de Leicester. Ci-dessous nous fournir une version condensée des méthodes utilisées., Pour chaque étape, des informations complètes peuvent être trouvées dans les Méthodes Complémentaires. Les détails entourant les recherches généalogiques approfondies effectuées dans le cadre de ce projet se trouvent dans la Note supplémentaire 2.

prélèvement D’échantillons

L’ADN a été extrait des échantillons de salive des parents modernes de Richard III et tous les participants ont été recrutés avec un consentement éclairé à la suite de l’examen du projet par le Comité D’éthique de la recherche de L’Université de Leicester.

Le Squelette 1 a été excavé et des échantillons prélevés dans des conditions nettoyées37., Toutes les personnes impliquées dans les fouilles sur le site de Grey Friars, le laboratoire clean à Leicester et celles impliquées dans les laboratoires et les travaux de laboratoire avaient leurs mitochondries et, pour les mâles, les chromosomes Y tapés. L’ADN a été extrait des échantillons de salive et tous les participants ont été recrutés avec un consentement éclairé.

extraction D’ADN d’échantillons anciens

L’ADN a été extrait d’échantillons de dents et d’OS (fémur). Toutes les procédures ont été effectuées dans des laboratoires d’ADN anciens dédiés à L’Université de York et à L’Université Paul Sabatier, Toulouse, avec des précautions de contamination appropriées en place., Deux ébauches d’extraction ont été incluses et traitées exactement comme s’il s’agissait d’extraits tout au long du processus. Les PCR et les expériences de bibliothèque comprenaient également d’autres contrôles Vierges.

analyse de typage sexuel réalisée sur le squelette 1

un nouveau test de typage sexuel comprenant des amorces de PCR pour la co-amplification du fragment SRY avec les régions homologues UTX et UTY a été utilisé. Ce test a été conçu pour permettre la co-amplification de fragments de taille relativement petite de SRY, UTX et UTY à partir d’échantillons susceptibles de contenir du DNA10 dégradé.,

région témoin mitochondriale analyse du squelette 1

L’analyse des segments hypervariables (HV1, HV2 et HV3) de la région témoin de l’ADNmt a été réalisée par amplification et séquençage direct de multiples fragments se chevauchant de 153 à 250 PB (http://forensic.yonsei.ac.kr/protocol/mtDNA-midi-mini.pdf)22. Une sélection d’amplicons a été utilisée pour cloner les produits de PCR dans le laboratoire de Toulouse. Le séquençage a été effectué à l’aide du Big-Dye Terminator V3.,1 kit de séquençage de cycle (Applied Biosystems) et par électrophorèse capillaire sur un analyseur génétique ABI Prism 3730 (Applied Biosystems) au Laboratoire de chimie des acides nucléiques des protéines de L’Université de Leicester ou à la plateforme technique génomique PlaGe (Genopole).

génome Mitochondrial/typage y-SNP/HIrisplex du squelette 1

des bibliothèques ont été construites à la suite de Meyer et Kircher16, à l’exception que la première étape de filtration entre la réparation de l’extrémité émoussée et la ligature de l’adaptateur a été substituée par l’inactivation thermique des enzymes38,39., Deux microréseaux ont été conçus, l’un pour l’enrichissement de l’ADNmt et l’autre pour l’enrichissement du SNP nucléaire. L’enrichissement de l’ADN a été réalisé par capture d’hybridation à L’aide de la puce ADN Sureselect Agilent 244k (Agilent, Böblingen, Allemagne). Pour la capture nucléaire, des sondes du chromosome Y ont été conçues pour couvrir les SNP pertinents pour les principales lignées Européennes14. D’autres sondes ont été conçues pour couvrir les SNP pertinents pour les marqueurs HIrisplex31. Ces deux ensembles de sondes (mitochondriales et SNPs) ont été utilisés séparément pour remplir les deux modèles de microréseaux différents d’un format 1 × 244k., Pour chaque microréseau, le protocole de capture a été effectué à la suite de Hodges et al.15 avec les modifications proposées par Zhang et coll.40 et Fortes et Paijmans38. Les bibliothèques ont été regroupées en quantités équimolaires et séquencées sur deux voies de la plate-forme Illumina HiSeq 2000 en mode 100 SE à l’installation de séquençage de l’Université de Copenhague, au Danemark.

Les lectures brutes de chaque bibliothèque ont été triées en fonction de l’indice de six nucléotides utilisé lors de la préparation de la bibliothèque. Seules les lectures correspondant à 100% à l’indice ont été sélectionnées pour des analyses plus poussées., Les lectures inférieures à 25 nucléotides ont été rejetées de l’analyse ultérieure. Les lectures coupées ont été mappées aux autosomes et aux chromosomes sexuels du génome humain de référence build 37 (GRCh37) et aux rCRS (NC_012920.1) en utilisant bwa 0.7.5 a-r405 (ref. 41). Dans chaque alignement, les fichiers bam de sortie ont été fusionnés à L’aide de SAMtools 0.1.19 (réf. 41) et les doublons de PCR ont été supprimés par la suite. Les lectures mappées ont été filtrées en fonction d’une qualité de mappage >29 et de leur alignement sur des positions uniques le long de la séquence de référence.,

les positions polymorphes ont été identifiées à L’aide de SAMtools (SAMtools 0.1.19) et bcftools. Enfin, vcfutils.pl a été utilisé pour filtrer la liste des variants selon une qualité de probabilité postérieure du génotype à L’échelle Phred > 20 et une profondeur de lecture supérieure à 10. Pour éviter une erreur de calcul en raison du modèle de désamination des molécules D’ADN anciennes, toutes les positions polymorphes rapportées dans le fichier de sortie vcf ont été vérifiées à l’œil nu., Dans le cas du génome mitochondrial, l’assemblage à la référence a été visualisé dans la Tablette42, tandis que l’alignement des lectures contenant les SNP aux chromosomes de référence a été visualisé à L’aide D’IGV43.

typage des SNP par PCR

L’approche de capture a donné une couverture insuffisante pour tous les SNP de L’HIrisPlex et du chromosome Y et, par conséquent, des amorces ont été conçues pour générer des amplicons contenant ces SNP ainsi que deux SNP, qui définissent davantage l’haplogroupe g du chromosome Y: M285 (G1) et p287 (G2) (réf. 14). Ceux-ci ont été amplifiés dans le cadre de réactions multiplexes à la suite de Römpler et al.,44 ou singleplex réactions (en utilisant 40 cycles et sans amplification secondaire) et séquencées sur le Torrent D’ions après la préparation de la bibliothèque en utilisant Ion PGM 200 Xpress Template Kit et PGM 200 Sequencing Kit. Pour augmenter la couverture, la PCR singleplex et le séquençage d’un marqueur (rs28777) ont été effectués selon Binladen et al.45

le typage de L’haplogroupe g définissant les SNP (M201, M285 et P287) a été répété à Toulouse à L’aide de PCR singleplex. Le séquençage de ces produits PCR a été effectué à L’aide de Big-Dye Terminator V3.,1 kit de séquençage de cycle (Applied Biosystems) analysé par électrophorèse capillaire sur un analyseur génétique ABI Prism 3730 (Applied Biosystems) à la plateforme technique génomique PlaGe (Genopole).

analyse de l’haplotype chromosomique y

les haplotypes chromosomiques y des échantillons anciens et modernes ont été obtenus à l’aide du système PowerPlex Y23 (Promega) et analysés par électrophorèse capillaire sur un analyseur génétique ABI Prism 3730 (Applied Biosystems) à la plateforme technique génomique PlaGe (Genopole) et sur un analyseur génétique ABI Prism 3130xl (Applied Biosystems) à L’Université de Leicester., Pour Skeleton 1, cela a été réalisé sur trois extraits distincts (RM2, LM1 et LM3) dans deux laboratoires d’ADN ancien différents (York et Toulouse). Pour les parents modernes, cela a été réalisé sur deux extraits différents dans deux laboratoires modernes différents (Leicester et Toulouse).

analyse du SNP chromosomique Y des échantillons modernes

Après la détermination de l’haplotype Y pour les échantillons de lignées mâles modernes, l’haplogroupe prédit a été déterminé à l’aide du prédicteur d’haplogroupe de Whit Athey (http://www.hprg.com/hapest5/hapest5a/hapest5.htm?order=num)., Les marqueurs binaires couvrant ces lignées et les lignées apparentées ont été typés dans deux multiplexes par la procédure de miniséquençage instantané (Applied Biosystems) et un analyseur génétique ABI3130xl (Applied Biosystems) suivi d’une confirmation à l’aide du séquençage Sanger. Somerset 3 a été déterminé comme étant HG I (M170+ M223−, M253−)14 dérivé, confirmé par le laboratoire de Toulouse. On a déterminé que les Somersets 1,2,4 et 5 étaient dérivés pour R1b-U152. Les Somersets 1,2,4 et 5 ont été testés pour les SNP subdivisant ce clade13 (Z56, M126, Z36, Z192, M160 et L2) en utilisant le séquençage Sanger dans les deux laboratoires.,

analyse moderne de l’ADNmt

Les deux échantillons ont été reproduits deux fois.

Les échantillons ont été prélevés à L’aide de kits de collecte D’ADN Oragene (DNA Genotek) et l’ADN extrait à l’aide de deux méthodes différentes: le protocole Qiacube Blood and Body Fluid protocol (200 µl avec élution de 200 µl) et le protocole Oragene. Pour analyser la région témoin, les échantillons ont été séquencés deux fois dans le sens avant et arrière à l’aide de deux jeux d’amorces superposés (15973-296 et 16524-614) à L’aide de Big-Dye Terminator V 3.1 (Applied Biosystems). Aucune différence n’a été trouvée entre les répliques ou entre les échantillons.,

des échantillons ont été amplifiés pour le génome mitochondrial complet des deux extractions à la suite de Meyer et al.26 amplicons PCR ont été séquencés sur un séquenceur Ion Torrent PGM sur une puce Ion314. Les bibliothèques ont été préparées à l’aide du kit de préparation de la bibliothèque de fragments Ion Xpress plus gDNA, tandis que la préparation du modèle et le séquençage ont été effectués à l’aide du kit de modèle Ion PGM 200 Xpress et du kit de séquençage Ion PGM 200, respectivement. Les lectures brutes ont été mappées vers les RCR (NC_012920.1) à l’aide du logiciel TMAP inclus dans le plugin D’alignement D’ions 3.2.1 (logiciel Torrent Suite 3.2.,1) sur le serveur torrent Ion. La suppression des lectures en double et l’appel variant ont été effectués à L’aide de SAMtools 0.1.19 (réf. 41) et le réalignement local a été réalisé avec la trousse D’outils D’analyse du Génome46. Les sites variantes ont été filtrés pour la qualité de Base 20, la qualité cartographique 50 et la profondeur de couverture 30, après quoi 33 sites polymorphes ont été retenus. Tous ces sites ont été vérifiés manuellement et confirmés par séquençage Sanger dans les deux sens et répliqués deux fois.,

contrôle et quantification de la Contamination

la contamination moderne par L’ADN des vestiges anciens a été contrôlée par les méthodes suivantes:

  1. 1

    L’Excavation a été effectuée dans des conditions propres (voir méthodes supplémentaires)

  2. 2

    Les échantillons ont été stockés dans des laboratoires propres et le travail sur L’ADN ancien a été effectué uniquement dans des installations dédiées à L’ADN ancien.

  3. 3

    des échantillons anciens distincts ont été traités dans des laboratoires distincts pour reproduire les résultats.,

  4. 4

    Tous les membres du laboratoire et les participants à l’excavation ont eu leur ADNmt tapé et le typage du chromosome Y a été effectué sur tous les hommes impliqués. Aucun n’avait d’ADNmt ou de chromosome Y correspondant.

comme preuve de contamination significative, l’analyse de L’ADN du squelette 1 montre une correspondance parfaite de l’ADNmt avec ML1 et une différence de base unique avec ML2. Il montre également un haplotype Y-STR clair, qui a été reproduit à l’aide d’un certain nombre d’extraits générés et testés dans deux laboratoires distincts., Enfin, un examen (voir méthodes supplémentaires) du modèle de substitution dans nos lectures confirme également cela.

analyse statistique

En adoptant une approche prudente à chaque étape, nous avons calculé une probabilité pour chaque élément de preuve observé sous chacune des deux hypothèses opposées: hypothèse 1 (H1): le squelette 1 est Richard III, et hypothèse 2 (H2): Le Squelette 1 n’est pas Richard III.,

comme il était raisonnable de supposer que toutes les différentes sources de preuve étaient indépendantes, la probabilité conjointe de toutes les preuves a été obtenue en multipliant les probabilités individuelles selon chaque hypothèse. Le poids de la preuve pour H1, appelé rapport de vraisemblance (LR), a ensuite été donné par le rapport de la probabilité sous H1 à celle sous H2. Nous disons qu’une hypothèse est « conservatrice » si elle réduit la LR.

la LR peut être convertie en une probabilité que H1 soit vrai, étant donné une probabilité antérieure., Nous avons pris comme point de départ le moment où le squelette 1 a été observé et reconnu comme un squelette humain, mais avant toute évaluation de l’âge, du sexe, de l’état de santé et de la cause du décès. À ce moment, il y avait des preuves substantielles qu « un squelette trouvé dans ce qui est censé avoir été l » emplacement de Leicester grey Friars choir pourrait être celui de Richard III. toutes les informations disponibles au moment où le squelette 1 a été mis au jour, y compris son emplacement précis et la nature de la tombe, a été considéré pour cette analyse, Sur la base de ces informations, nous pensons qu’un observateur sceptique n’aurait pas pu raisonnablement attribuer une probabilité antérieure inférieure à 1 sur 40. Cette valeur a été proposée dans une analyse précédente (http://rationalgareth.com/), basée sur ce que nous jugeons être des évaluations sceptiques. La probabilité la plus élevée qui pourrait être justifiée par les preuves antérieures pourrait être de 1 sur 2.

Nous avons utilisé les données pertinentes disponibles dans la mesure du possible. Il faut inévitablement porter des jugements subjectifs, par exemple sur les populations de référence pertinentes et sur les probabilités d’erreur dans les faits rapportés., Dans la mesure où cela semblait possible et raisonnable, nous nous sommes efforcés d’être prudents dans notre approche, par exemple, en utilisant une méthode de pseudocount pour biaiser la LR vers une valeur neutre de 1, tendant ainsi à éviter les fausses grandes valeurs des basses fréquences observées. Des détails sur les données et les méthodes utilisées dans l’analyse statistique des données radiocarbones, l’âge et le sexe du squelette, la présence de scoliose, la présence de plaies périmortémiques, les données sur le chromosome Y et la fréquence de l’ADNmt peuvent être trouvés dans les méthodes supplémentaires. Pour résumer les résultats: les données au radiocarbone ont donné un rapport de vraisemblance de 1.,84 représentant un soutien limité pour H1. Les données sur l’âge et le sexe ont donné une ration de probabilité de 5,25, ce qui représente encore une fois un soutien limité pour H1. La présence d’une épaule plus élevée que l’autre, rapportée au cours de la vie de Richard, pourrait être attribuée à une scoliose (le squelette 1 présentait une scoliose idiopathique sévère à l’adolescence) ou à deux autres affections connues, la paralysie D’Erb et la déformation de Sprengel, qui sont toutes deux très rares. Sous H1, les taux ci-dessus donnent une probabilité estimée de 0.,90 de l’observation de la scoliose étant donné la description de L’apparence physique de Richard III (=le taux de scoliose divisé par la somme des trois taux), que nous avons multiplié par 0,95 pour permettre la possibilité que la description enregistrée était incorrecte. Cela conduit à un LR de 212, fournissant un soutien modérément fort pour H1. La présence de blessures périmortem a donné un LR de 42, et donc un soutien modéré pour H1. Le chromosome Y du squelette 1 ne correspondait pas à celui des parents patrilinéaires déterminés généalogiquement de Richard III., Cela pourrait s’expliquer par un événement de fausse paternité dans un ou plusieurs des 19 liens Père-Fils putatifs entre Richard III et Henry Somerset, cinquième duc de Beaufort. Les résultats du chromosome Y indiquent également un autre événement de fausse paternité entre Henry Somerset et ses cinq descendants patrilinéaires présumés contemporains. Pour être prudents, nous avons choisi un taux de fausse paternité publié qui était (1) inférieur à tout autre taux publié que nous avons considéré17,47 et (2) Basé sur des données généalogiques18., À cela, nous ajoutons l’événement de fausse paternité dans le 19 liens Père-Fils putatifs entre Henry Somerset et cinq Somersets masculins contemporains. Cela donne une probabilité d’au moins un événement de fausse paternité dans les 19 liens Père–Fils putatifs entre Richard III et Henry Somerset de 0,16. Étant donné qu’un événement de fausse paternité doit s’être produit sous H1, la fréquence de population de L’haplotype Y du squelette 1 est la même sous H1 et H2 et s’annule dans le calcul LR. Ainsi, la LR est de 0,16, ce qui représente une preuve limitée contre H1.,

Les séquences d’ADNmt du squelette 1 et le parent matrilinéaire présumé de la méiose 19 de Richard III, Michael Ibsen, correspondaient complètement. Un parent de la méiose 21 correspondait également, sauf à une base (8994). Cette dernière observation est également probable sous H1 et H2 étant donné la séquence observée de Michael Ibsen, et s’annule donc dans la LR. Ainsi, nous n’avons besoin que de probabilités pour l’observation de la séquence partagée par Michael Ibsen et le squelette 1.

pour obtenir la probabilité sous H1, nous avons besoin du taux de mutation de l’ADNmt, et dans ce cas, les estimations élevées sont prudentes. Parsons et al.,28 signaler 10 mutations de région témoin dans 327 générations à l’aide de données généalogiques. Parce que cela suggère un taux plus élevé que les autres estimations publiées, et est basé sur des données généalogiques, nous l’avons utilisé pour dériver une probabilité de 0,52 pour aucune mutation dans 19 méioses.

pour la probabilité sous H2, nous avons besoin de la fraction de population de L’haplotype squelette 1. Bien que nous ayons obtenu la séquence complète du génome de L’ADNmt à partir du squelette 1, nous avons identifié peu de données de comparaison du génome entier publiées en Angleterre., Ainsi, pour l’analyse statistique, nous n’avons utilisé que les régions témoins de l’ADNmt entre les positions 16,093 et 16,320 et entre 00073 et 00188, pour lesquelles nous avons obtenu des données de comparaison en anglais appropriées à partir d’une mise à jour de Röhl et al.30, complétée par des séquences d’ADNmt fournies par Roots for Real (Genetic Ancestor Ltd., Clare, Suffolk, Royaume-Uni). L’utilisation de seulement ces courtes sections de la région témoin sous H2 est prudente, car la fraction de population des séquences observées de la région témoin ne peut être inférieure à celle du génome complet de l’ADNmt., La population de référence pertinente a plus de 500 ans dans le passé, mais en raison de la Grande Taille de la population au cours de la période considérée, nous nous attendons à ce que la fréquence des populations ait peu changé au cours des cinq derniers siècles. Nous avons trouvé que la fréquence de L’haplotype squelette 1 était 0 chez 1823 dans la base de données, à laquelle nous ajoutons celle observée chez Michael Ibsen. Cette approche est, encore une fois, conservatrice car Michael a été échantillonné en raison de sa relation généalogique connue avec Richard III. cela conduit à un LR de 478 représentant des preuves modérément fortes pour H1.,

nous avons également noté qu’il n’y avait aucune correspondance dans une base de données de 26 127 haplotypes de la région mitochondriale européenne de contrôle (www.empop.org) 29. nous ne nous appuyons pas sur cette base de données parce qu’elle est à l’échelle européenne plutôt que spécifique à L’Angleterre et en raison de problèmes de vérification, mais elle suggère que L’haplotype Skeleton 1 peut être beaucoup plus rare que ce qui peut être déduit de notre base de données anglaise plus petite. Nous notons également que la mobilité des femmes au sein de la noblesse européenne a probablement été beaucoup plus élevée que pour la population en général, en raison des pratiques matrimoniales liées à la formation d’alliances politiques., De telles pratiques justifieraient l’utilisation de la base de données européenne d’ADNmt, et donc de considérer l’haplotype trouvé chez Skeleton 1 et Michael Ibsen comme extrêmement rare. Dans le tableau supplémentaire 10, nous montrons quelques résultats illustratifs à l’aide de la base de données européenne pour démontrer les implications de l’établissement que L’haplotype Skeleton 1 est aussi rare que suggéré par cette base de données.

le tableau supplémentaire 10 présente les RL pour différentes combinaisons de preuves et deux probabilités postérieures., En utilisant toutes les preuves, le support pour H1 est extrêmement fort avec un LR de 6,7 millions, de sorte que notre sceptique serait amené à la conclusion que la probabilité que le squelette 1 ne soit pas Richard III est inférieure à 1 Sur 100 000, tandis que pour ceux qui prennent une position de départ 1 sur 2, cette probabilité est Compte tenu des hypothèses prudentes sous-jacentes à notre calcul décrit ci-dessus, nous considérons que cela établit la vérité de H1 hors de tout doute raisonnable.