souches bactériennes et plasmides

Les souches D’E. coli suivantes ont été utilisées dans cette étude: DH5a, BL21(de3) (Novagen), CLM24 et Origami2(DE3) gmd::kan δwaal. DH5a a été utilisé pour le clonage et la purification des plasmides., BL21 (de3) a été utilisé pour l’expression et la purification de la protéine acceptrice scFv13-R4DQNAT qui a été utilisée dans toutes les réactions de glycosylation in vitro. CLM24 est un dérivé glyco-optimisé de W3110 qui porte une délétion dans le gène codant pour la ligase WaaL, facilitant ainsi l’accumulation de glycanes préassemblés sur Und-PP36. CLM24 a été utilisé pour la purification de l’enzyme CjOST, l’extraction à base de solvant organique de tous les glycanes bactériens porteurs de LLO et la souche source pour la préparation d’extraits avec et sans composants de glycosylation enrichis sélectivement., Origami2 (DE3) gmd::kan ΔwaaL a été utilisé pour produire des Llo portant Man3GlcNAc2 et a été généré par mutation séquentielle avec transduction de phage P1vir en utilisant les souches respectives de la collection Keio 62 comme donneurs, qui ont été obtenues du Centre de Stock génétique Coli (CGSC). En bref, le lysat de donneur a été généré à partir de la souche JW3597-1 (ΔrfaL734::kan) et le phage résultant a été utilisé pour infecter les cellules cibles Origami2(de3)., Après avoir plaqué des transformants sur des plaques LB contenant de la kanamycine (Kan), des transducteurs réussis ont été sélectionnés et leurs cassettes de résistance Kan ont été éliminées par transformation avec le plasmide sensible à la température pCP2063. La souche résultante, Origami2(de3) ΔwaaL, a ensuite été utilisée pour la délétion ultérieure du gène gmd selon une stratégie identique mais en utilisant la souche donneuse JW2038-1 (Δgmd751::kan).

Tous les plasmides utilisés dans l’étude sont énumérés dans le tableau supplémentaire 2. Les plasmides construits dans cette étude ont été fabriqués à l’aide de protocoles de Clonage standard et confirmés par séquençage de l’ADN., Ces éléments sont les suivants. Le plasmide pJL1-scFv13-R4DQNAT a été généré par la première PCR amplifiant le gène codant scFv13-R4DQNAT à partir de pET28a-scFv13-R4(N34L, N77L)dqnat, où les mutations N34L et N77L ont été introduites pour éliminer les sites putatifs de glycosylation interne dans scFv13-R452. Le produit PCR résultant a ensuite été ligaturé entre les sites de restriction NcoI et SalI dans le plasmide pJL1, un vecteur à base de pET utilisé pour le CFPS49. Le plasmide pJL1-sfGFP217-DQNAT a été généré en ligaturant un fragment d’ADN synthétisé commercialement codant sfGFP217-dqnat (Integrated DNA Technologies) en pJL1., Cette version de sfGFP contient une insertion GT supplémentaire après K214, qui étend cette boucle flexible avant la version bêta finale sheet64. Dans cette boucle flexible, immédiatement après T216, nous avons greffé une séquence de 21 acides aminés contenant le site de glycosylation C. jejuni AcrA N12334, mais avec un séquon dqnat optimal à la place du séquon Acra natif. Des procédures similaires ont été utilisées pour générer les plasmides pJL1-sfGFP217-AQNAT, pjl1-hEPO22-DQNAT-26, pJL1-hEPO36-dqnat-40 et pJL1-hEPO81-dqnat-85., Dans le cas de pJL1-hEPO22-DQNAT-26, le gène de l’EPO humain mature a été conçu de telle sorte que le séquon natif à N24 a été changé de 22-AENIT-26 à un séquon bactérien optimal, DQNAT. Des stratégies de Clonage identiques ont été réalisées pour introduire séparément des motifs dqnat optimaux à la place des séquons hEPO natifs 36-NENIT-40 et 81-LVNSS-85. L’expression recombinante de l’amorce-adaptateur glycane D’E. coli O9 (Man3GlcNAc) sur Und-PP a été obtenue en clonant les gènes codant pour les enzymes mannosyltransférases wbdb et WbdC dérivées de E., coli ATCC31616 pour assembler le glycane, et RfbK et RfbM, également dérivés D’E. coli ATCC31616 pour augmenter le pool de GDP-mannose disponible, dans E. coli MG1655. Le plasmide pConYCGmCB a été construit par assemblage isotherme de Gibson et Code un opéron artificiel composé de: (i) les glycosyltransférases de levure Alg13, Alg14, Alg1 et Alg2 pour la biosynthèse du glycane Man3glcnac212 et (ii) Les enzymes d’E. coli phosphomannomutase (ManB) et mannose-1-phosphate guanylyltransférase (ManC), qui ensemble augmentent la disponibilité de substrats GDP-mannose pour les enzymes Alg1 et Alg2.,

expression et purification des protéines

La Purification du CjPglB a été réalisée selon un protocole décrit antérieurement34. En bref, une seule colonie d’E. coli clm24 portant le plasmide pSN1865 a été cultivée pendant la nuit à 37 °C dans 50 mL de Luria-Bertani (LB; 10 g L−1 tryptone, 5 g L−1 extrait de levure, 5 G L−1 NaCl, pH 7,2) additionnés d’ampicilline (Amp) et de 0,2% (p/v%) de D-glucose. Les cellules pendant la nuit ont été sous-cultivées dans 1 L de bouillon fresh terrific (TB; 12 G L−1 tryptone, 24 G L-1 extrait de levure, 0,4% (v/V%) glycérol, 10% (v/V%) 0,17 m KH2PO4/0.,72 m tampon phosphate K2HPO4), additionné D’Amp et cultivé jusqu’à ce que l’absorbance à 600 nm (Abs600) atteigne une valeur de ~0,7. La température d’incubation a été ajustée à 16 °C, après quoi l’expression des protéines a été induite par l’addition de l-arabinose à une concentration finale de 0,02% (p/v%). L’expression des protéines a pu se poursuivre pendant 20 h à 16 °C. Les cellules ont été récoltées par centrifugation puis perturbées à l’aide d’un homogénéisateur (Avestin C5 EmulsiFlex). Le lysat a été centrifugé pour éliminer les débris cellulaires et le surnageant a été ultracentrifugé (100 000×g) pendant 2 h à 4 °C., La pastille résultante contenant la fraction membranaire a été complètement remise en suspension avec un homogénéisateur tissulaire Potter-Elvehjem dans un tampon contenant 50 mm D’HEPES, 250 mM de NaCl, 10% (v/V%) de glycérol et 1% (P/v%) de n-dodécyl-β-D-maltoside (DDM) à pH 7,5. La suspension a été incubée à température ambiante pendant 1 h pour faciliter la solubilisation détergente du CjPglB à partir de lipides natifs D’E. coli, qui ont été éliminés par ultracentrifugation subséquente (100 000×g) pendant 1 h à 4 °c., Le surnageant contenant du CjPglB solubilisé au DDM a été purifié à l’aide de résine Ni-NTA (Thermo) selon les spécifications du fabricant, à l’exception que tous les tampons ont été complétés par 1% (p/v%) de DDM. La fraction d’élution issue de la purification Ni-NTA a ensuite été soumise à une chromatographie d’exclusion de taille (SEC) à l’aide d’un système ÄKTA Explorer FPLC (GE Healthcare) avec colonne Superdex 200 10/300 GL. La protéine purifiée a été stockée à une concentration finale de 1-2 mg mL-1 dans un tampon de stockage OST (50 mM HEPES, 100 mM NaCl, 5% (v/v%) glycérol, 0,01% (p/v%) DDM, pH 7,5) à 4 °C., La concentration de glycérol dans l’échantillon a été ajustée à 20% (V/V%) pour un stockage à long terme à -80 °C.

la Purification de la protéine acceptrice scFv13-R4DQNAT a été effectuée comme décrit antérieurement52. En bref, la souche BL21(de3) d’E. coli portant le plasmide pET28a-scFv13-R4(N34L, N77L)DQNAT a été cultivée dans 1 L de TB fourni avec de la kanamycine. La culture a été incubée à 37 °C jusqu’à ce que L’Abs600 atteigne ~0,7, moment auquel l’expression des protéines a été induite par addition d’isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) à une concentration finale de 0,1 mM. l’expression des protéines a été autorisée pendant 20 h à 25 °C., Les cellules ont été récoltées et perturbées à l’identique comme décrit ci-dessus. La protéine scFv13-R4DQNAT a été purifiée à l’aide de résine Ni-NTA suivie de SEC selon les protocoles du fabricant. La protéine a été stockée à une concentration finale de 1-2 mg mL-1 dans un tampon de stockage (HEPES de 50 mM, NaCl de 250 mM, EDTA de 1 mM, pH 7,5) à 4 °c.

Extraction de Llo

le protocole d’extraction de Llo par solvant organique des membranes D’E. coli a été adapté d’un protocole décrit antérieurement34,66., Dans la plupart des cas, une seule colonie de souche CLM24 portant un plasmide pour la biosynthèse du glycane cible (tableau supplémentaire 2) a été cultivée pendant la nuit dans des milieux LB. Les exceptions notables étaient les Llo portant le N-glycan de W. succinogenes( WsLLOs), qui ont été produites à l’aide de cellules DH5a portant le fosmide pEpiFOS-5pgl5 (gracieusement fournies par le Dr Markus Aebi), et les Llo sbearing Man3GlcNAc2, qui ont été produites à l’aide de cellules origami2(DE3) gmd::kan ΔwaaL portant le plasmide pConYCGmCB. Pendant la nuit, les cellules ont été sous-cultivées dans 1 L de tuberculose complétée par un antibiotique approprié et cultivées jusqu’à ce que L’Abs600 atteigne ~0,7., La température d’incubation a été ajustée à 30 °C pour la biosynthèse de tous les glycanes à l’exception de Man3GlcNAc2, qui a été ajustée à 16 °C. Pour le plasmide pMW07-pglΔB, l’expression des protéines a été induite avec le l-arabinose à une concentration finale de 0,2% (p/v%) tandis que pour le fosmide pEpiFOS-5pgl5, l’induction a été avec l’isopropyle β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) à une concentration finale de 1 mM. les plasmides impliquent des promoteurs constitutifs et ne nécessitent donc pas d’inducteurs chimiques. Après 16 h, les cellules ont été récoltées par centrifugation et les pastilles de cellules ont été lyophilisées jusqu’à une sécheresse complète à -70 °C., Pour l’extraction des CjLLOs, des ClLLOs natifs et modifiés, des Llo d’amorçage-adaptateur D’E. coli O9 et des WsLLOs, les lyophilisats ont été suspendus dans un rapport volumétrique de 10:20:3 de solution CHCl3:CH3OH:H2O et incubés à température ambiante pendant 15 min pour faciliter l’extraction des Llo. Pour l’extraction du glycane Llo sbearing Man3GlcNAc2, le lyophilisat a été successivement suspendu dans une solution de CHCl3:CH3OH à 10:20 (V/V%), de l’eau et une solution de CHCl3:CH3OH:H2O à 10:20:3 avec 15 min d’incubation à température ambiante entre chaque étape., Dans chaque cas, la suspension finale a été centrifugée (4000×g) pendant 15 min, après quoi la couche organique (couche inférieure) a été recueillie et séchée avec un concentrateur sous vide suivi d’une lyophilisation. Les lyophilisats contenant des Llo actifs ont été remis en suspension dans un tampon de glycosylation sans cellules (HEPES de 10 mM, pH 7,5, MnCl2 de 10 mM et DDM à 0,1% (p/v%)) et stockés à 4 °c.

préparation d’extraits bruts de S30

Les souches sources de CLM24 ont été cultivées en 2×YTPG (10 g D’extrait de levure L-1, 16 g de tryptone L−1, 5 g de tryptone L−1 NaCl, 7 g L−1 K2HPO4, 3 G L−1 KH2PO4, 18 g L−1 glucose, pH 7,2) jusqu’à ce que L’Abs600 atteigne ~3., Pour générer un extrait enrichi en OST, on a utilisé le plasmide porteur de CLM24 pSF-cjpglb, pSF-CcPglB, pSF-DdPglB, pSF-DgPglB ou pSF-DvPglB52 comme souche source. Pour générer un extrait enrichi en LLO, on a utilisé le plasmide pMW07-pglΔB porteur de CLM24 comme souche source. Pour générer un extrait en pot contenant à la fois OST et LLOs, CLM24 portant pMW07-pglΔB et pSF-CjOST a été utilisé comme souche source. Au besoin, l’expression des composants de glycosylation a été induite avec le l-arabinose à une concentration finale de 0,02% (%p/v)., Après induction, on a laissé l’expression des protéines se poursuivre à 30 °C jusqu’à une densité de OD600 ~3, point auquel les cellules ont été récoltées par centrifugation (5000×g) à 4 °C pendant 15 min. Toutes les étapes suivantes ont été effectuées à 4 °C, sauf indication contraire. Les cellules granulées ont été lavées trois fois dans un tampon S30 (acétate de tris de 10 mM, acétate de magnésium de 14 mM, acétate de potassium de 60 mM, pH 8,2). Après le dernier lavage, les cellules ont été granulées à 7000×g pendant 10 min et congelées à l’azote liquide. Pour fabriquer le lysat, les cellules ont été décongelées et remises en suspension jusqu’à homogénéité dans 1 mL de tampon S30 pour 1 g de masse cellulaire humide., Les cellules ont été perturbées à l’aide D’un homogénéisateur haute pression Avestin EmulsiFlex-B15 à 20 000-25 000 psi avec un seul passage. Le lysat a ensuite été centrifugé deux fois à 30 000×g pendant 30 min pour éliminer les débris cellulaires. Le surnageant a été transféré dans un nouveau vaisseau et incubé à 250 tr / min à 37 °C pendant 60 min pour dégrader les transcriptions endogènes de l’ARNm et perturber les complexes polysomiques existants dans le lysat. Après centrifugation (15 000×g) pendant 15 min à 4 °C, le surnageant a été recueilli, aliquoté, congelé à l’éclair dans de L’azote liquide et stocké à -80 °C., L’extrait de S30 a été actif pendant environ trois cycles de gel-dégel et contenait ~40 g de protéines totales L – 1 mesurées par Bradford assay.

synthèse de glycoprotéines sans cellules

pour la glycosylation in vitro de protéines acceptrices purifiées, des réactions ont été réalisées dans un volume de 50 µL contenant 3 µg de scFv13-R4DQNAT, 2 µg de cjpglb purifié et 5 µg de LLOs extraits (dans le cas de Man3GlcNAc2 LLOs, 20 µg 10 mm MnCl2, et 0,1% (p / v%) DDM). Le mélange réactionnel a été incubé à 30 ° C pendant 16 heures., Pour l’expression brute de glycoprotéines à base d’extrait, un schéma en deux phases a été mis en œuvre. Dans la première phase, la synthèse des protéines a été réalisée avec un système panox-SP modifié67. Plus précisément, des tubes de microcentrifugeuse de 1,5 mL ont été chargés de réactions de 15 µL contenant 200 ng d’ADN plasmidique, 30% (v/v%) d’extrait de S30 et les éléments suivants: 12 mm de glutamate de magnésium, 10 mM de glutamate d’ammonium, 130 mM de glutamate de potassium, 1,2 mM d’adénosine triphosphate (ATP), 0,85 mm cytidine triphosphate (CTP), 0,034 mg ml-1 acide folinique, 0.,171 mg mL−1 ARNt E. coli (Roche), 2 mM chacun de 20 acides aminés, 30 mm de phosphoénolpyruvate (PEP, Roche), 0,4 mM de nicotinamide adénine dinucléotide (NAD), 0,27 mM de coenzyme-A (CoA), 4 mm d’acide oxalique, 1 mM de putrescine, 1,5 mM de spermidine et 57 mM d’HEPES. Pour scFv13-R4DQNAT, hEPO22-dqnat-26, hEPO36-dqnat-40 et hEPO81-dqnat85, cette phase a été réalisée à 30 °C pendant 4 h dans des conditions oxydantes tandis que pour sfGFP217-dqnat et sfGFP217-AQNAT, cette phase a été réalisée à 30 °C pendant 5 min dans des conditions réductrices., Pour les conditions d’oxydation, l’extrait a été pré-conditionné avec de l’iodoacétamide de 750 µM dans l’obscurité à température ambiante pendant 30 min et le mélange réactionnel a été alimenté avec du glutathion de 200 mM à un rapport de 3:1 entre les formes oxydées et réduites. Les rendements actifs de sfGFP à partir de réactions sans cellules ont été quantifiés en mesurant la fluorescence dans le lysat et en la convertissant en concentration à l’aide d’une courbe standard décrite antérieurement39. Dans la deuxième phase, la glycosylation des protéines a été initiée par l’addition de MnCl2 et de DDM à une concentration finale de 10 mM et 0.,Au besoin, les réactions ont été complétées par 2 µg de CjPglB purifié (c.-à-d. pour les CFGpS avec des extraits enrichis en LLO) ou 5 µg de cjllos extraits au solvant (c.-à-d. pour les CFGpS avec des extraits enrichis en OST). Toutes les réactions ont été arrêtées en ajoutant un tampon D’échantillon de Laemmli contenant 5% de ßME, après quoi les échantillons ont été bouillis à 100 °C pendant 15 min et analysés par SDS-PAGE et Western blot.

analyse Western blot

des échantillons contenant 0,5 µg de protéine acceptrice ont été chargés dans des gels SDS-PAGE., Après séparation électrophorétique, des protéines ont été transférées des gels sur des membranes de polyfluorure de vinylidène (PVDF) D’Immobon-P (0,45 µm) selon le protocole du fabricant. Les Membranes ont été lavées deux fois avec un tampon TBS (80 g L−1 NaCl, 20 g L−1 KCl et 30 g L−1 Tris-base), puis incubées pendant 1 h dans une solution de blocage (50 g L−1 lait non gras dans du TBST (TBS fourni avec 0,05% (V/V%) Tween-20)). Après le blocage, les membranes ont été lavées 4 fois avec TBST avec 10 min d’incubation entre chaque lavage., Une première membrane a été sondée avec un anticorps polyclonal 6xHis (Abcam, ab137839, 1:7500) qui reconnaît spécifiquement les étiquettes d’épitope hexahistidine tandis qu’une seconde membrane répliquée a été sondée avec l’un des éléments suivants: hR6 (1:10 000) sérum de lapin qui reconnaît le C. jejuni natif et le C. Lari glycan ainsi que le C. Lari glycan reconnaît man3glcnac et man3glcnac2. Le sondage des membranes a été effectué pendant au moins 1 h avec agitation à température ambiante, après quoi les membranes ont été lavées avec du TBST de la même manière que décrite ci-dessus., Pour le développement, les membranes ont été brièvement incubées à température ambiante avec un substrat ECl occidental (BioRad) et imagées à l’aide d’un système ChemiDocTM XRS+. Les enzymes OST enrichies en extraits ont été détectées par une procédure SDS-PAGE identique suivie d’une analyse Western blot avec un anticorps polyclonal spécifique à la balise flag epitope (Abcam, ab49763, 1:7500). Le composant glycane de Llo enrichi en extraits a été détecté en repérant directement 10 µL d’extraits sur les membranes de nitrocellulose, suivi d’une détection avec du sérum hR6. Les images d’immunoblot non coupées sont montrées dans la Fig. 8.,

analyse MS

environ 2 µg de protéine scFv13-R4DQNAT en solution ont été dénaturés avec 6 m d’urée, réduits avec 10 mM de TNT, incubés à 34 °C pendant 1 h, puis alkylés avec 58 mM d’iodoacétamide pendant 45 min dans l’obscurité à température ambiante et étanchés par 36 mm de TNT finale. La solution a ensuite été diluée avec 50 mM de bicarbonate d’ammonium (pH 8,0) jusqu’à une concentration tampon finale de 1 M d’urée avant la digestion de la trypsine. L’échantillon a été digéré avec 0,2 µg de trypsine pendant 18 h à 37 °C. La digestion a été arrêtée par addition de TFA à un pH final de 2,2–2,5., Les échantillons ont ensuite été dessalés avec une cartouche sola HRP SPE (ThermoFisher Scientific). Les cartouches ont été conditionnées avec 1 × 0,5 mL de méthanol à 90%, 0,1% d’acide trifluoroacétique (TFA) et équilibrées avec 2 × 0,5 mL de TFA à 0,1% (V/V%). Les échantillons ont été dilués 1:1 avec 0,2% (V/V%) de TFA et courent lentement à travers les cartouches. Après lavage avec 2 × 0,5 mL de solution d’équilibrage, les peptides ont été élués par 1 × 0,5 mL d’acétonitrile (ACN) à 50% (V/V%), 0,1% (V/V%) de TFA et séchés dans une centrifugeuse à vide rapide.,

l’analyse nanoLC–MS/MS a été réalisée à l’aide D’UltiMate3000 Rslcnano (Dionex) couplé à un spectromètre de masse Orbitrap Fusion (ThermoFisher Scientific) équipé d’une source d’ions Nanospray Flex. Chaque échantillon a été reconstitué dans 22 µL de 0,5% (p/v%) FA et 10 µL ont été chargés sur une colonne de piège Acclaim PepMap 100 C18 (5 µm, 100 µm × 20 mm, 100 Å, ThermoFisher Scientific) avec des raccords nanoViper à 20 µL min−1 de 0,5% FA pour le dessalement en ligne., Après 2 min, la valve est commutée pour permettre la séparation des peptides sur une colonne acclama PepMap C18 nano (3 µm, 75 µm × 25 cm, ThermoFisher Scientific), dans un gradient de 90 min de 5 à 23% à 35% B à 300 Nl min−1 (3 à 73 à 93 min, respectivement), suivi d’une rampe de 9 min à 90% B, d’une prise de 9 min à 90% B et d’un passage rapide à 5% B en 1 min. La colonne a été rééquilibrée avec 5% B pendant 20 min avant la prochaine exécution. La fusion Orbitrap fonctionnait en mode ion positif avec une tension nanospray réglée à 1,7 kV et une température de source à 275 °C., Un étalonnage externe pour les analyseurs de masse FT, IT et quadripôle a été effectué avant l’analyse. Le balayage complet de L’étude Orbitrap MS (m / z 400-1800) a été suivi par les 3 premiers scans MS/MS de produit de dissociation de collision plus élevé dépendant des données etd (HCD-pd-ETD) pour les peptides précurseurs avec 2-7 charges au-dessus d’un nombre d’ions seuil de 50 000 avec une énergie de collision normalisée de 32%., Les scans de relevé MS ont été acquis à un pouvoir de résolution de 120 000 (FWHM à m/z 200), avec contrôle automatique du Gin (AGC) = 2E5 et temps d’injection maximum (Max IT) = 50 ms, et les scans HCD MS/MS à une résolution de 30 000 avec AGC = 5E4, Max IT = 60 ms et avec fenêtre D’isolement Q (m/z) à 3 pour la plage de masse m/z 105-2000. Les paramètres d’exclusion dynamique ont été fixés à 1 dans une durée d’exclusion de 60 s avec une largeur de masse d’exclusion de ±10 ppm. La liste des déclencheurs d’ions de produits comprenait des pics à 204,0867 Da (ion oxonium HexNAc), 138,0545 Da (fragment HexNAc) et 366,1396 Da (ions oxonium HexHexNAc)., Si l’un des ions produits HCD de la liste était détecté, deux scans etd MS/MS (EThcD) dépendant de la charge avec activation supplémentaire HCD (SA) sur le même ion précurseur étaient déclenchés et collectés dans un Piège à ions linéaire. Pour les précurseurs doublement chargés, le temps de réaction ETD a été fixé à 150 ms et l’énergie SA a été fixée à 30%, tandis que les mêmes paramètres à 125 ms et 20%, respectivement, ont été utilisés pour les précurseurs plus chargés. Pour les deux scans déclenchés par des ions, la cible du réactif fluoranthène ETD a été fixée à 2e5, la cible AGC à 1E4, Max IT à 105 ms et la fenêtre d’isolement à 3. Toutes les données ont été acquises à L’aide de Xcalibur 3.,0 logiciel d’exploitation et application Orbitrap Fusion Tune v. 2.1 (ThermoFisher Scientific).

Tous les spectres bruts MS et MS/MS de chaque échantillon ont été recherchés à L’aide de Byonics v. 2.8.2 (mesures des protéines) à l’aide de la base de données sur les protéines D’E coli avec une séquence cible de protéines scFv13-R4DQNAT ajoutée. Les paramètres de recherche peptidique étaient les suivants: deux clivages manqués pour la digestion complète de la trypsine avec modification carbamidométhyl fixe de la cystéine, modifications variables de l’oxydation de la méthionine et désamidation sur les résidus asparagine/glutamine., La tolérance massique des peptides était de 10 ppm et les valeurs de tolérance massique des fragments pour les spectres HCD et EThcD étaient de 0,05 et 0,6 Da, respectivement. Le nombre maximal de modifications communes et rares a été fixé à deux. La recherche de glycanes a été effectuée sur une liste de 309 glycanes n-liés de mammifères dans le logiciel Byonic. Les peptides identifiés ont été filtrés pour un FDR maximum de 2%. Le logiciel exporté les résultats de la recherche vers une feuille de calcul.

activité de fluorescence de la GFP

l’activité de la sfGFP dérivée sans cellule a été déterminée à l’aide d’une analyse de fluorescence dans le lysat comme décrit antérieurement39., Brièvement, 2 µL de réaction de sfGFP glycosylée synthétisée sans cellules ont été dilués dans 48 µL d’eau nanopure. La solution a ensuite été placée dans une plaque D’analyse Noire Costar 96 puits (Corning). Les longueurs d’onde d’Excitation et d’émission pour la fluorescence sfGFP étaient respectivement de 485 et 528 nm.

analyse immuno-enzymatique (ELISA)

Les plaques Elisa Costar 96 puits (Corning) ont été recouvertes pendant une nuit à 4 °C de 50 µl de 1 mg mL-1 E. coli β−gal (Sigma-Aldrich) dans un tampon de carbonate de sodium de 0,05 M (pH 9,6)., Après avoir bloqué avec 5% (p/v%) d’albumine sérique bovine (BSA) dans du PBS pendant 3 h à température ambiante, les plaques ont été lavées quatre fois avec un tampon PBST (PBS, 0,05% (v/V%) Tween-20, 0,3% (p/v%) BSA) et incubées avec des échantillons de scFv13-R4 purifiés dilués en série ou des fractions solubles de lysats de CFGpS pendant 1 h à température ambiante. Les échantillons ont été quantifiés par le test de Bradford et une quantité équivalente de protéines totales a été appliquée sur la plaque. Après avoir lavé quatre fois avec le même tampon, l’anticorps polyclonal conjugué de lapin anti-6× – His-HRP (Abcam) dans 3% de PBST a été ajouté à chaque puits pendant 1 h., Les plaques ont été lavées et développées en utilisant des protocoles standard.

essai de prolifération cellulaire in vitro

érythroleucémie humaine des cellules TF-1 (Sigma) qui nécessitent un facteur de stimulation des colonies de granulocytes–macrophages (GM-CSF), de l’interleukine 3 (IL-3) ou de l’hEPO pour la croissance et la survie ont été utilisées. Les cellules ont été maintenues dans des milieux RPMI−1640 complétés par 10% de FBS, 50 U mL−1 de pénicilline, 50 mg mL−1 de streptomycine, 2 mM de glutamine et 2 ng mL-1 de GM-CSF à 37 °C dans une atmosphère humidifiée contenant 5% de CO2., Après 16 h d’incubation dans des milieux RPMI-1640 sans GM-CSF, les cellules ont été comptées, récoltées et remises en suspension dans des milieux frais. 5 × 103 cellules TF-1 par puits ont été ensemencées dans une plaque d’analyse de 96 puits, et des étalons ou des échantillons D’OEB ont été ajoutés aux concentrations finales souhaitées pour chaque puits. Les cellules ont été incubées pendant 6 h dans un incubateur humide avant d’ajouter alamarBlue®. Après 12 h, le signal de fluorescence a été mesuré à une longueur d’onde d’excitation/émission de 560 nm/590 nm.,

disponibilité des données

toutes les données générées au cours de l’étude sont incluses dans cet article et ses fichiers d’information supplémentaires, et sont disponibles auprès des auteurs sur demande raisonnable.