cepas bacterianas y plásmidos

en este estudio se utilizaron las siguientes cepas de E. coli: DH5a, BL21(de3) (Novagen), CLM24 y Origami2(de3) gmd::kan δwaal. DH5a se utilizó para la clonación y purificación de plásmidos., BL21(de3) se utilizó para la expresión y purificación de la proteína aceptora scFv13-R4DQNAT que se utilizó en todas las reacciones de glicosilación in vitro. CLM24 es un derivado Glico-optimizado de W3110 que lleva una deleción en el gen que codifica la ligasa WaaL, facilitando así la acumulación de glicanos preensamblados En Und-PP36. CLM24 se utilizó para la purificación de la enzima CjOST, extracción orgánica a base de solvente de todos los glicanos bacterianos llo sbearing, y la cepa fuente para preparar extractos con y sin componentes de glicosilación enriquecidos selectivamente., Origami2 (DE3) gmd::kan ΔwaaL se utilizó para producir LLOs portadores de Man3GlcNAc2 y se generó por mutación secuencial con transducción de fagos P1vir utilizando las cepas respectivas de la colección Keio62 como donantes, que se obtuvieron del Coli Genetic Stock Center (CGSC). En resumen, el lisado del donante se generó a partir de la cepa JW3597-1(ΔrfaL734::kan) y el fago resultante se utilizó para infectar las células diana de Origami2 (de3)., Después de recubrir transformantes en placas LB que contenían kanamicina (Kan), se seleccionaron transductores exitosos y se eliminaron sus casetes de resistencia Kan transformándolos con plásmido sensible a la temperatura pCP2063. La cepa resultante, Origami2(de3) ΔwaaL, se utilizó para la posterior deleción del gen gmd de acuerdo con una estrategia idéntica, pero Utilizando la cepa donante JW2038-1 (Δgmd751::kan).

Todos los plásmidos utilizados en el estudio están listados en la tabla suplementaria 2. Los plásmidos construidos en este estudio se hicieron utilizando protocolos de clonación estándar y se confirmaron mediante secuenciación de ADN., Entre ellas figuraban las siguientes. El plásmido pjl1-scFv13-R4DQNAT se generó por primera PCR amplificando el gen que codifica scFv13-r4dqnat de pET28a-scFv13-R4 (N34L, N77L)DQNAT, donde se introdujeron las mutaciones N34L y N77L para eliminar los sitios de glicosilación interna putativos en scFv13-R452. El producto PCR resultante se ligó entre los sitios de restricción NcoI Y SalI en plásmido pJL1, un vector basado en pET utilizado para CFPS49. El plásmido pjl1-sfGFP217-DQNAT se generó ligando un fragmento de ADN sintetizado comercialmente que codifica sfGFP217-dqnat (Integrated DNA Technologies) en pJL1., Esta versión de sfGFP contiene una inserción GT adicional después de K214, que extiende este bucle flexible antes de la hoja beta final 64. En este bucle flexible, inmediatamente después de T216, injertamos una secuencia de 21 aminoácidos que contiene el sitio de glicosilación AcrA n123 de C. jejuni34, pero con un secuon dqnat óptimo en lugar del secuon Acra nativo. Se utilizaron procedimientos similares para generar plásmidos pJL1-sfGFP217-AQNAT, pjl1-hEPO22-DQNAT-26, pjl1-hEPO36-DQNAT-40 y pjl1-hEPO81-DQNAT-85., En el caso de pjl1-hEPO22-DQNAT-26, el gen para EPO humano Maduro fue diseñado de tal manera que el sequon nativo en N24 fue cambiado de 22-aenit-26 a un sequon bacteriano óptimo, DQNAT. Se llevaron a cabo estrategias de clonación idénticas para introducir por separado motivos óptimos de DQNAT en lugar de las secuenciaciones nativas de hEPO 36-NENIT-40 y 81-LVNSS-85. La expresión recombinante del E. coli O9 primer-adaptador glicano (Man3GlcNAc) En Und-PP se logró mediante la clonación de los genes que codifican las enzimas wbdb y wbdc manosiltransferasa derivadas de E., coli ATCC31616 para ensamblar el glicano, y RfbK y RfbM, también derivados de E. coli ATCC31616 para aumentar el pool de GDP-manosa disponible, en E. coli MG1655. El plásmido pConYCGmCB fue construido por el ensamblaje isotérmico de Gibson y codifica un operón artificial compuesto por: (i) las levaduras glicosiltransferasas Alg13, Alg14, Alg1 y Alg2 para la biosíntesis del glicano Man3glcnac212 y (ii) Las enzimas E. coli fosfomanomutasa (ManB) y manosa-1-fosfato guanililtransferasa (ManC), que en conjunto aumentan la disponibilidad de sustratos GDP-manosa para las enzimas Alg1 y Alg2.,

expresión y purificación de proteínas

la purificación de CjPglB se realizó de acuerdo con un protocolo previamente describido34. Brevemente, una sola colonia de E. coli CLM24 que llevaba plásmido pSN1865 se cultivó durante la noche a 37 ° C En 50 mL de Luria−Bertani (LB; 10 g L−1 triptona, 5 g L−1 extracto de levadura, 5 g L-1 NaCl, pH 7.2) suplementado con ampicilina (Amp) y 0.2% (p/v%) d-glucosa. Durante la noche las células se subculturaron en 1 L de caldo fresco excelente (TB; 12 g L−1 triptona, 24 g L−1 extracto de levadura, 0.4% (v/v%) glicerol, 10% (v/v%) 0.17 m KH2PO4/0.,Tampón de fosfato K2HPO4 de 72 M), suplementado con Amp y crecido hasta que la absorbancia a 600 nm (Abs600) alcanzó un valor de ~0.7. La temperatura de incubación se ajustó a 16 °C, tras lo cual se indujo la expresión proteica mediante la adición de l-arabinosa a una concentración final de 0,02% (p/v%). Se permitió que la expresión de proteínas procediera durante 20 h a 16 °C. Las células se recolectaron por centrifugación y luego se interrumpieron utilizando un homogeneizador (Avestin C5 EmulsiFlex). El lisado se centrifugó para eliminar los residuos celulares y el sobrenadante se ultracentrifugó (100.000 × g) durante 2 h a 4 °C., El pellet resultante que contenía la fracción de membrana se resuspendió completamente con un homogeneizador de tejido Potter-Elvehjem en tampón que contenía 50 mM HEPES, 250 mM NaCl, 10% (v/v%) glicerol y 1% (p/v%) n-dodecil-β-D-maltósido (DDM) a pH 7,5. La suspensión se incubó a temperatura ambiente durante 1 h para facilitar la solubilización detergente de CjPglB a partir de lípidos nativos de E. coli, que se eliminaron mediante ultracentrifugación posterior (100.000×g) durante 1 h a 4 °C., El sobrenadante que contenía DDM-cjpglb solubilizado se purificó utilizando resina de Ni-Nta (termo) de acuerdo con las especificaciones del fabricante, con la excepción de que todos los tampones se complementaron con DDM al 1% (p/v%). La fracción de elución de la purificación de Ni-NTA se sometió a cromatografía de exclusión de tamaño (SEC) utilizando un sistema ÄKTA Explorer FPLC (GE Healthcare) con columna Superdex 200 10/300 GL. La proteína purificada se almacenó a una concentración final de 1-2 mg mL-1 en tampón de almacenamiento de OST (50 mM HEPES, 100 mM NaCl, 5% (v/v%) glicerol, 0,01% (p/v%) DDM, pH 7,5) a 4 °C., La concentración de glicerol en la muestra se ajustó al 20% (v / v%) para el almacenamiento a largo plazo a -80 °C.

La purificación de la proteína aceptor scFv13-R4DQNAT se llevó a cabo como se describió previamente52. Brevemente, la cepa BL21(de3) de E. coli portadora de plásmido pET28a-scFv13-R4(N34L, N77L)DQNAT se cultivó en 1 L de TB suministrada con kanamicina. El cultivo se incubó a 37 ° C hasta que el Abs600 alcanzó ~0.7, momento en el que se indujo la expresión proteica mediante la adición de isopropil β-d-1-tiogalactopiranósido (IPTG) a una concentración final de 0.1 mm. se permitió que la expresión proteica procediera durante 20 h a 25 °C., Las células fueron cosechadas e interrumpidas de forma idéntica a la descrita anteriormente. La proteína scFv13-R4DQNAT se purificó utilizando resina Ni-NTA seguida de SEC de acuerdo con los protocolos del fabricante. La proteína se almacenó a una concentración final de 1-2 mg mL-1 en tampón de almacenamiento (50 mM HEPES, 250 mM NaCl, 1 mM EDTA, pH 7.5) a 4 °c.

extracción de LLOs

El protocolo para la extracción con solvente orgánico de LLOs de membranas de E. coli se adaptó de un protocolo previamente describido34,66., En la mayoría de los casos, una sola colonia de la cepa CLM24 que llevaba un plásmido para la biosíntesis de glicanos Diana (tabla suplementaria 2) se cultivó durante la noche en medios LB. Las excepciones notables fueron LLOs con el n-glicano W. succinogenes (WsLLOs), que se produjeron utilizando células DH5a que llevan el pEpiFOS-5pgl5 fosmid (amablemente proporcionado por el Dr. Markus Aebi), y llo sbearing Man3GlcNAc2, que se produjeron utilizando células Origami2(de3) gmd::kan ΔwaaL que llevan plásmido pConYCGmCB. Durante la noche las células se subculturaron en 1 L de TB suplementado con un antibiótico apropiado y se cultivaron hasta que el Abs600 alcanzó ~0.7., La temperatura de incubación se ajustó a 30 °C para la biosíntesis de todos los glicanos excepto para Man3GlcNAc2, que se ajustó a 16 °C. para el plásmido pMW07-pglΔB, la expresión proteica se indujo con l-arabinosa a una concentración final de 0.2% (P/v%) mientras que para el fosmid pEpiFOS-5pgl5 la inducción se indujo con isopropil β-D-1-tiogalactopiranósido (IPTG) a una concentración final de 1 mm. los plásmidos involucraban promotores constitutivos y por lo tanto no requerían inductores químicos. Después de 16 h, las células se recolectaron por centrifugación y los gránulos de las células se liofilizaron para completar la sequedad a -70 °C., Para la extracción de Cjlos, Cllos nativos y de ingeniería, E. coli O9 primer-adaptor LLOs, y WsLLOs, los liofilizados se suspendieron en una relación volumétrica de 10:20:3 de solución CHCl3: CH3OH: H2O y se incubaron a temperatura ambiente durante 15 min para facilitar la extracción de LLOs. Para la extracción de Llo sbearing Man3GlcNAc2 glicano, el liofilizado fue suspendido sucesivamente en 10:20 (v/v%) CHCl3:solución de CH3OH, agua, y 10:20:3 CHCl3:CH3OH: solución de H2O con 15 min de incubación a temperatura ambiente entre cada paso., En cada caso, la suspensión final se centrifugó (4000 × g) durante 15 min, después de lo cual la capa orgánica (capa inferior) se recogió y se secó con un concentrador de vacío seguido de liofilización. Los liofilizados que contenían LLOs activos se resuspendieron en tampón de glicosilación libre de células (10 mM HEPES, pH 7,5, 10 mM MnCl2 y 0,1% (p/v%) DDM) y se almacenaron a 4 °c.

preparación de extractos crudos de S30

las cepas de origen CLM24 se cultivaron en 2×YTPG (10 g de extracto de levadura L-1, 16 g de l−1 triptona, 5 g de l−1 NaCl, 7 g l−1 K2HPO4, 3 g L−1 KH2PO4, 18 g l−1 glucosa, pH 7.2) hasta que el Abs600 alcanzó ~3., Para generar extracto enriquecido con OST, CLM24 portando plásmido pSF-cjpglb, pSF-CcPglB, pSF-DdPglB, pSF-DgPglB, o pSF-DvPglB52 fue utilizado como la cepa fuente. Para generar extracto enriquecido con LLO, CLM24 que lleva plásmido pMW07-pglΔB fue utilizado como la cepa fuente. Para generar un extracto de una sola olla que contiene OST y LLOs, CLM24 que lleva pMW07-pglΔB y pSF-cjost se utilizó como la cepa fuente. La expresión de los componentes de la glicosilación se indujo con l-arabinosa a una concentración final del 0,02% (p/v%)., Después de la inducción, se permitió que la expresión de proteínas procediera a 30 °C a una densidad de OD600 ~3, en cuyo punto las células se recolectaron por centrifugación (5000×g) a 4 °C durante 15 min. Todos los pasos posteriores se llevaron a cabo a 4 °C a menos que se indique lo contrario. Las células peletizadas se lavaron tres veces en tampón S30 (acetato de tris de 10 mM, acetato de magnesio de 14 mM, acetato de potasio de 60 mM, pH 8,2). Después del último lavado, las células se granularon a 7000×g durante 10 min y se congelaron con nitrógeno líquido. Para hacer lisado, las células fueron descongeladas y resuspendidas a homogeneidad en 1 mL de tampón S30 por 1 g de masa celular húmeda., Las células se interrumpieron utilizando un homogeneizador de alta presión Avestin EmulsiFlex-B15 a 20.000-25.000 psi con un solo paso. El lisado se centrifugó dos veces a 30.000 × g durante 30 minutos para eliminar los residuos celulares. El sobrenadante se transfirió a un nuevo recipiente y se incubó con agitación de 250 rpm a 37 °C durante 60 min para degradar las transcripciones endógenas del ARNm e interrumpir los complejos polisómicos existentes en el lisado. Tras la centrifugación (15.000 × g) durante 15 minutos a 4 °C, el sobrenadante se recogió, se aliquotó, se congeló súbitamente en nitrógeno líquido y se almacenó a -80 °C., El extracto S30 fue activo durante aproximadamente tres ciclos de congelación y descongelación y contenía ~40 g de proteína total L-1 medida por el ensayo de Bradford.

síntesis de glicoproteínas libres de células

para la glicosilación in vitro de proteína aceptor purificada, las reacciones se llevaron a cabo en un volumen de 50 µL que contenía 3 µg de scFv13-R4DQNAT, 2 µg de cjpglb purificada y 5 µg de LLOs extraídos (en el caso de Man3GlcNAc2, se utilizaron 20 µg) en tampón de glicosilación in vitro (10 mM HEPES, pH 7,5, 10 mM MnCl2, y 0.1% (P/V%) DDM). La mezcla de reacción se incubó a 30 ° C durante 16 h., Para la expresión de glicoproteínas a base de extracto crudo, se implementó un esquema de dos fases. En la primera fase, se realizó la síntesis proteica con un sistema PANOx-SP modificado67. Específicamente, los tubos de microcentrífuga de 1,5 mL se cargaron con reacciones de 15 µL que contenían 200 ng de ADN plásmido, extracto S30 al 30% (v/v%) y lo siguiente: glutamato de magnesio de 12 mM, glutamato de amonio de 10 mM, glutamato de potasio de 130 mM, trifosfato de adenosina de 1,2 mM (ATP), trifosfato de guanosina de 0,85 mM (GTP), trifosfato de uridina de 0,85 mM (UTP), trifosfato de citidina (CTP), 0,034 mg ml-1 ácido folínico, 0.,171 mg mL−1 de E. coli tRNA (Roche), 2 mM cada uno de 20 aminoácidos, 30 mM de fosfoenolpiruvato (Pep, Roche), 0,4 mM de nicotinamida adenina dinucleótido (NAD), 0,27 mM de coenzima-A (CoA), 4 mM de ácido oxálico, 1 mM de putrescina, 1,5 mM de espermidina y 57 mM de HEPES. Para scFv13-R4DQNAT, hEPO22-dqnat-26, hEPO36-dqnat-40 y hEPO81-DQNAT85, esta fase se llevó a cabo a 30 °C durante 4 h en condiciones oxidantes, mientras que para sfGFP217-DQNAT y sfGFP217-AQNAT esta fase se llevó a cabo a 30 °C durante 5 min en condiciones reductoras., Para condiciones oxidantes, el extracto fue preacondicionado con iodoacetamida de 750 µM en la oscuridad a temperatura ambiente durante 30 min y la mezcla de reacción se suministró con Glutatión de 200 mM en una relación de 3: 1 entre las formas oxidadas y reducidas. Los rendimientos activos de sfGFP a partir de reacciones libres de células se cuantificaron midiendo el Lisado de fluorescencia y convirtiéndolos en concentración utilizando una curva estándar como se describió previamente39. En la segunda fase, se inició la glicosilación proteica mediante la adición de MnCl2 y DDM a una concentración final de 10 mM y 0.,1% (P/V%), respectivamente, y se permitió proceder a 30 °C durante 16 h. según fue necesario, las reacciones se complementaron con 2 µg de cjpglb purificado (es decir, para CFGpS con extractos enriquecidos con LLO) o 5 µg de Cjlos extraídos con disolvente (es decir, para CFGpS con extractos enriquecidos con OST). Todas las reacciones se detuvieron mediante la adición de tampón de muestra Laemmli que contenía 5% ßME, después de lo cual las muestras se hervieron a 100 °C durante 15 min y se analizaron mediante SDS-PAGE y western blotting.

análisis de Western blot

Las muestras que contenían 0,5 µg de proteína aceptor se cargaron en geles SDS-PAGE., Después de la separación electroforética, las proteínas se transfirieron de los geles a las membranas de difluoruro de polivinilideno (PVDF) de Immobilon-P (0,45 µm) de acuerdo con el protocolo del fabricante. Las membranas se lavaron dos veces con tampón TBS (80 g L−1 NaCl, 20 g L−1 KCl y 30 g L−1 Tris-base) seguido de incubación durante 1 h en solución de bloqueo (50 g L−1 leche descremada en TBST (TBS suministrado con 0,05% (v/V%) Tween-20)). Después del bloqueo, las membranas se lavaron 4 veces con TBST con incubación de 10 min entre cada lavado., Se probó una primera membrana con un anticuerpo 6xhis-policlonal (Abcam, ab137839, 1:7500) que reconoce específicamente las etiquetas del epítopo de hexahistidina, mientras que se probó una segunda membrana replicada con uno de los siguientes: suero hR6 (1:10,000) de conejo que reconoce los glicanos nativos C. jejuni y C. lari, así como el glicano C. lari o ConA-HRP (Sigma, L6397, 1:2500) que reconoce man3glcnac y man3glcnac2. El sondeo de las membranas se realizó durante al menos 1 h con agitación a temperatura ambiente, después de lo cual las membranas se lavaron con TBST de la misma manera descrita anteriormente., Para el desarrollo, las membranas se incubaron brevemente a temperatura ambiente con sustrato de ECl Occidental (BioRad) y se tomaron imágenes utilizando un sistema ChemiDocTM XRS+. Las enzimas OST enriquecidas en extractos se detectaron mediante un procedimiento SDS-PAGE idéntico seguido de un análisis de Western blot con un anticuerpo policlonal específico para la etiqueta del epítopo FLAG (Abcam, ab49763, 1:7500). El componente glicano de LLOs enriquecido en extractos se detectó mediante el manchado directo de 10 µL de extractos en membranas de nitrocelulosa, seguido de la detección con suero hR6. Las imágenes inmunoblot no recortadas se muestran en la Fig. 8.,

análisis de MS

aproximadamente 2 µg de proteína scFv13-R4DQNAT en solución se desnaturalizó con urea de 6 M, Se redujo con TDT de 10 mM, se incubó a 34 °C durante 1 h, luego se alquiló con yodoacetamida de 58 mM durante 45 min en la oscuridad a temperatura ambiente y se apagó con TDT final de 36 mm. La solución se diluyó con bicarbonato de amonio de 50 mM (pH 8,0) hasta una concentración tampón final de 1 M de urea antes de la digestión de tripsina. La muestra se digirió con 0,2 µg de tripsina durante 18 h a 37 ° C. La digestión se detuvo mediante la adición de AGT a un pH final de 2,2–2,5., Las muestras fueron desaladas con el cartucho SOLA HRP SPE (ThermoFisher Scientific). Los cartuchos se acondicionaron con 1 × 0,5 mL de metanol al 90%, ácido trifluoroacético al 0,1% (AGT) y se equilibraron con 2 × 0,5 mL de AGT al 0,1% (v/v%). Las muestras se diluyeron 1:1 con 0,2% (v/v%) de AGT y pasaron lentamente por los cartuchos. Después del lavado con 2 × 0,5 mL de solución de equilibrio, los péptidos se elutaron con 1 × 0,5 mL de acetonitrilo (ACN) al 50% (v/v%), TFA al 0,1% (v/v%) y se secaron en una centrífuga de vacío de velocidad.,

el análisis nanoLC-MS / MS se realizó utilizando UltiMate3000 RSLCnano (Dionex) acoplado a un espectrómetro de masas de fusión Orbitrap (ThermoFisher Scientific) equipado con una fuente de iones nanospray Flex. Cada muestra se reconstituyó en 22 µL de 0,5% (p/v%) FA y se cargaron 10 µL en una columna de trampa Acclaim PepMap 100 C18 (5 µm, 100 µm × 20 mm, 100 Å, ThermoFisher Scientific) con accesorios de nanoViper a 20 µL min−1 de 0,5% FA para desalación en línea., Después de 2 min, la válvula cambió para permitir que los péptidos se separaran en una columna Acclaim PepMap C18 nano (3 µm, 75 µm × 25 cm, ThermoFisher Scientific), en un gradiente de 90 min de 5 a 23% a 35% B a 300 nL min−1 (3 a 73 a 93 min, respectivamente), seguido de una rampa de 9 minutos a 90% B, una retención de 9 minutos a 90% B y un cambio rápido a 5% B en 1 min. La columna fue reequilibrada con 5% B durante 20 min antes de la siguiente Corrida. El Orbitrap Fusion funcionaba en modo de iones positivos con voltaje de nanospray ajustado a 1,7 kV y temperatura de la fuente a 275 °C., La calibración externa para los analizadores de masa FT, IT y cuadrupolo se realizó antes del análisis. El Orbitrap full ms survey scan (m/z 400-1800) fue seguido por el Top 3 s dependiente de datos de producto de disociación de colisión superior ETD activado por iones (HCD-pd-ETD) escaneos MS/MS para péptidos precursores con 2-7 cargas por encima de un recuento de iones umbral de 50,000 con energía de colisión normalizada del 32%., Las exploraciones de la encuesta de MS se adquirieron a un poder de resolución de 120,000 (FWHM A m/z 200), con control automático de Gin (AGC) = 2E5 y tiempo máximo de inyección (Max IT) = 50 ms, y exploraciones de HCD MS/MS a una resolución de 30,000 con AGC = 5E4, Max IT = 60 ms y con ventana de aislamiento Q (M/z) a 3 para el rango de masa m/z 105-2000. Los parámetros de exclusión dinámica se establecieron en 1 dentro de la duración de exclusión de 60 s con ±10 ppm de ancho de masa de exclusión. La lista de disparadores de iones del producto consistió en Picos de 204.0867 Da (Ion oxonio HexNAc), 138.0545 Da (fragmento HexNAc) y 366.1396 Da (iones oxonio HexHexNAc)., Si se detectaba uno de los iones de producto de HCD en la lista, se activaban dos escaneos ETD MS/MS (ETCD) dependientes de la carga con activación suplementaria de HCD (SA) en el mismo ion precursor y se recogían en una trampa de iones lineal. Para los precursores doblemente cargados, el tiempo de reacción ETD establecido en 150 ms y la Energía SA se fijó en el 30%, mientras que los mismos parámetros en 125 ms y 20%, respectivamente, se utilizaron para los precursores con mayor carga. Para ambas exploraciones disparadas por iones, el objetivo del reactivo ETD de fluoranteno se estableció en 2e5, el objetivo AGC en 1E4, el máximo en 105 ms y la ventana de aislamiento en 3. Todos los datos fueron adquiridos con Xcalibur 3.,0 software de operación y aplicación Orbitrap Fusion Tune V. 2.1 (ThermoFisher Scientific).

Todos los espectros crudos de MS y MS/MS de cada muestra se buscaron utilizando Byonics v. 2.8.2 (Protein Metrics) utilizando la base de datos de proteínas e coli con secuencia de proteína diana scFv13-R4DQNAT añadida. Los parámetros de búsqueda de péptidos fueron los siguientes: dos escisión faltante para la digestión completa de tripsina con modificación fija de carbamidometil de cisteína, modificaciones variables de oxidación de metionina y desamidación en residuos de asparagina/glutamina., La tolerancia de masa peptídica fue de 10 ppm y los valores de tolerancia de masa de fragmento para los espectros HCD y ETCD fueron de 0,05 y 0,6 Da, respectivamente. Tanto el número máximo de modificaciones comunes como raras se establecieron en dos. La búsqueda de glicanos se realizó contra una lista de 309 glicanos enlazados a n de mamíferos en el software Byonic. Los péptidos identificados fueron filtrados para un máximo de 2% de FDR. El software exportó los resultados de la búsqueda a una hoja de cálculo.

actividad de fluorescencia del GFP

la actividad del sfGFP derivado de células libres se determinó mediante un análisis de fluorescencia en lisado como se describió previamente39., Brevemente, 2 µL de reacción de sfGFP glicosilada sintetizada libre de células se diluyó en 48 µL de agua nanopure. La solución se colocó entonces en una placa de ensayo Negra Costar de 96 pocillos (Corning). Las longitudes de onda de excitación y emisión para la fluorescencia sfGFP fueron de 485 y 528 nm, respectivamente.

Elisa (Enzyme-linked immunosorbent analysis)

Las placas Elisa Costar de 96 pocillos (Corning) se recubrieron durante la noche a 4 °C con 50 µl de 1 mg mL-1 de E. coli β−gal (Sigma-Aldrich) en tampón de carbonato sódico de 0,05 M (pH 9,6)., Después del bloqueo con albúmina sérica bovina (ASC) al 5% (P/V%) en PBS durante 3 h a temperatura ambiente, las placas se lavaron cuatro veces con tampón PBST (PBS, 0,05% (v/v%) Tween-20, 0,3% (p/v%) ASC) y se incubaron con muestras de scFv13-R4 purificadas diluidas en serie o fracciones solubles de lisados CFGpS durante 1 h a temperatura ambiente. Las muestras se cuantificaron mediante el ensayo de Bradford y se aplicó una cantidad equivalente de proteína total a la placa. Después de lavarse cuatro veces con el mismo tampón, se añadió anticuerpo policlonal de conejo conjugado anti-6×-His-HRP (Abcam) en PBST al 3% a cada pocillo durante 1 h., Las placas fueron lavadas y desarrolladas utilizando protocolos estándar.

ensayo de proliferación celular In vitro

Se utilizaron células TF-1 de eritroleucemia humana (Sigma) que requieren factor estimulante de colonias de granulocitos y macrófagos (GM–CSF), interleucina 3 (IL-3) o HPO para el crecimiento y la supervivencia. Las células se mantuvieron en medios RPMI-1640 suplementados con 10% de FBS, 50 U mL−1 penicilina, 50 mg mL−1 estreptomicina, 2 mM glutamina y 2 ng mL−1 GM-CSF a 37 °C En una atmósfera humidificada que contenía 5% de CO2., Después de 16 h de incubación en medios RPMI-1640 sin GM-CSF, las células fueron contadas, cosechadas y resuspendidas en medios frescos. Se sembraron 5 × 103 células TF-1 por pocillo en una placa de ensayo de 96 pocillos, y se agregaron patrones o muestras de EPO a las concentraciones finales deseadas en cada pocillo. Las células se incubaron durante 6 h en incubadora húmeda antes de agregar alamarBlue®. Después de 12 h, se midió la señal de fluorescencia a una longitud de onda de excitación/emisión de 560 nm/590 nm.,

disponibilidad de los datos

todos los datos generados durante el estudio están incluidos en este artículo y sus archivos de Información complementaria, y están disponibles de los autores a petición razonable.