laboratorie platser
allt DNA-arbete som involverar moderna släktingar utfördes vid University of Leicester. Hane-line släktingar var skrivit med Promega PowerPlex Y23 och för Snp-analys att fastställa de viktigaste Europeiska Y-haplogrupper i Leicester med en delmängd av att skriva, för att sedan bekräftas vid Université Paul Sabatier. Kvinnliga släktingar sekvenserades för hela mitokondriella genomet vid University of Leicester., DNA extraherades från gamla tänder och ben vid University of York och Université Paul Sabatier, Toulouse. Biblioteksförberedelser och målanrikning gjordes vid University of York. Single-end-100-bp-sekvensering med hjälp av en HiSeq 2000 (Illumina, CA, USA) var som utförs vid Köpenhamns Sekvensering Anläggning. Riktade sekvensering av både moderna och antika DNA genomfördes även på genomisk teknisk plattform PlaGe (Genopole, Toulouse, Frankrike) och Proteiner Nukleinsyra Kemi Laboratoriet vid University of Leicester. Nedan ger vi en kondenserad version av de metoder som används., För varje steg finns fullständig information i de kompletterande metoderna. Detaljer kring den omfattande genealogiska forskning som genomförts för detta projekt finns i kompletterande Not 2.
provsamling
DNA extraherades från salivprover från de moderna släktingarna till Richard III och alla deltagare rekryterades med informerat samtycke efter projektgranskning av University of Leicester Research Ethics Committee.
skelett 1 grävdes och prover togs under rena förhållanden37., Alla inblandade i utgrävningen på Grey Friars-platsen, clean laboratory i Leicester och de som var involverade i laboratorierna och labwork hade sina mitokondriella och för män skrev Y-kromosomer. DNA extraherades från salivprover och alla deltagare rekryterades med informerat samtycke.
DNA-extraktion av gamla prover
DNA extraherades från tänder och ben (lårben) prover. Alla förfaranden utfördes i dedikerade gamla DNA-laboratorier vid University of York och Université Paul Sabatier, Toulouse med lämpliga kontamineringsåtgärder på plats., Två extraktionsämnen inkluderades och behandlades exakt som om de var extrakt under hela processen. PCR och biblioteksexperiment inkluderade också ytterligare tomma kontroller.
sex-typningstest utförd på skelett 1
en nydesignad sex-typningstest bestående av PCR-primers för samförstärkning av SRY-fragmentet med UTX och UTY homologa regioner användes. Denna analys har utformats för att möjliggöra att relativt små fragment av SRY, UTX och UTY kan förstärkas från prover som kan innehålla försämrade DNA10.,
mitokondriell kontrollregionanalys av skelett 1
analys av de hypervariabla segmenten (HV1, HV2 och HV3) i mtDNA-kontrollregionen utfördes genom att förstärka och direkt sekvensera flera överlappande fragment som sträcker sig från 153 till 250 bp i storlek (http://forensic.yonsei.ac.kr/protocol/mtDNA-midi-mini.pdf)22. Ett urval av amplicons användes för kloning av PCR-produkterna i labbet i Toulouse. Sekvensering utfördes med Stor-Dye Terminator V3.,1 cykel sekvensering kit (Applied Biosystems) och av kapillär elektrofores på en ABI Prism 3730 Genetiska Analyser (Applied Biosystems) på Proteiner Nukleinsyra Kemi Laboratoriet vid University of Leicester eller på genomisk teknisk plattform PlaGe (Genopole).
mitokondriellt genom/Y-SNP/Hiriplex typning av skelett 1
Bibliotek byggdes efter Meyer och Kircher16, med undantag för att det första filtreringssteget mellan den trubbiga ändreparationen och adapterligeringen ersattes av värmeinaktivering av enzymes38, 39., Två mikroarrays utformades, en för mtDNA anrikning och en annan för kärnkraft SNP anrikning. DNA anrikning utfördes genom hybridisering fånga med hjälp av Agilent 244k DNA SureSelect microarray (Agilent, Böblingen, Tyskland). För avskiljning av kärnvapen utformades y-kromosomprober för att täcka de SNPs som är relevanta för de stora europeiska linjen14. Ytterligare sonder utformades för att täcka SNPs som är relevanta för hirisplex31-markörerna. Dessa två uppsättningar sonder (mitokondriella och SNPs) användes separat för att fylla de två olika mikroarraydesignerna i ett 1 × 244K-format., För varje mikroarray utfördes fångstprotokollet efter Hodges et al.15 med de ändringar som föreslagits av Zhang et al.40 och Fortes och Paijmans38. Biblioteken samlades i ekvimolära mängder och sekvenserades på två körfält i Illumina HiSeq 2000-plattformen i 100 SE-läge vid sekvenseringsanläggningen vid Köpenhamns Universitet, Danmark.
råläsningen från varje bibliotek sorterades baserat på det sex-nukleotidindex som användes under bibliotekets förberedelse. Endast läser med en 100% matchning till indexet valdes för ytterligare analyser., Läser kortare än 25 nukleotider kasserades från ytterligare analys. De trimmade läsarna kartlades till autosomer och könskromosomer från det mänskliga referensgenomet build 37 (GRCh37) och till rCRS (NC_012920.1) med hjälp av BWA 0.7.5 a-r405 (ref. 41). I varje justering fusionerades utgångs Bam-filerna med SAMtools 0.1.19 (ref. 41) och PCR-dubbletter avlägsnades därefter. De mappade läsningarna filtrerades baserat på en kartläggningskvalitet > 29 och deras anpassning till unika positioner längs referenssekvensen.,
Polymorfa positioner identifierades med hjälp av SAMtools (SAMtools 0.1.19) och bcftools. Slutligen, vcfutils.pl användes för att filtrera listan över varianter enligt en Phred-skalad genotyp posterior probability quality > 20 och ett läsdjup högre än 10. För att undvika felsökning på grund av deaminationsmönstret av gamla DNA-molekyler, kontrollerades alla polymorfa positioner som rapporterades i VCF-utdatafilen av ögat., När det gäller mitokondriellt genom visualiserades monteringen till referensen i Tablet42, medan inriktningen av läsarna som innehåller SNPs till referenskromosomerna visualiserades med hjälp av IGV43.
SNP typing by PCR
infångningsmetoden gav otillräcklig täckning för alla Hiriplex och Y-kromosom SNPs och därför primers utformades för att generera amplicons som innehåller dessa SNPs samt två SNPs, som ytterligare definierar Y-kromosom haplogroup G: M285 (G1) och p287 (G2) (ref. 14). Dessa förstärktes som en del av multiplex reaktioner efter Römpler et al.,44 eller singleplex reaktioner (med användning av 40 cykler och utan sekundär förstärkning) och sekvenseras på Ion Torrent efter biblioteksberedning med Ion PGM 200 Xpress Template Kit och PGM 200 sekvensering Kit. För att öka täckningen, singleplex PCR och sekvensering av en markör (rs28777) genomfördes enligt Binladen et al.45
att Skriva av haplogrupp G definiera Snp (M201, M285 och P287) upprepades i Toulouse med singleplex pcr-reaktioner. Sekvensering av dessa PCR-produkter utfördes med användning av Big-Dye Terminator V3.,1 cykelsekvenseringssats (tillämpad Biosystems) analyserad genom kapillärelektrofores på en Abi Prism 3730 genetisk analysator (tillämpad Biosystems) vid den genomiska tekniska plattformen PlaGe (Genopole).
Y-kromosomala haplotypen analys
Gamla och moderna prover’ Y-kromosomala haplotypes erhölls med hjälp av den PowerPlex Y23 System (Promega) och analyseras av kapillär elektrofores på en ABI Prism 3730 Genetiska Analyser (Applied Biosystems) på genomisk teknisk plattform PlaGe (Genopole) och på en ABI Prism 3130xl Genetiska Analyser (Applied Biosystems) vid University of Leicester., För skelett 1 utfördes detta på tre separata extrakt (RM2, LM1 och LM3) i två olika gamla DNA-laboratorier (York och Toulouse). För de moderna släktingarna utfördes detta på två olika extrakt i två olika moderna laboratorier (Leicester och Toulouse).
y-kromosomal SNP-analys av moderna prover
efter bestämning av Y-haplotypen för de moderna manliga linjeproverna bestämdes den förutsagda haplogruppen med Whit Atheys haplogroup prediktor (http://www.hprg.com/hapest5/hapest5a/hapest5.htm?order=num)., Binära markörer som täcker dessa och relaterade linjer skrevs i två multiplexer av SNaPshot minisequencing procedure (Applied Biosystems) och en Abi3130xl genetisk analysator (Applied Biosystems) följt av bekräftelse med Sanger-sekvensering. Somerset 3 bestämdes vara Hg i (M170+ M223−, m253−)14 härledd, ytterligare bekräftad av labbet i Toulouse. Somersets 1,2,4 och 5 ansågs vara framställda för R1b-U152. Somersets 1,2,4 och 5 testades för Snp dela detta clade13 (Z56, M126, Z36, Z192, M160 och L2) med sangersekvensering i både labs.,
Modern mtDNA-analys
båda proverna replikerades två gånger.
prover togs med hjälp av Oragene DNA – insamlingssatser (DNA Genotek) och DNA extraheras med hjälp av två olika metoder: Qiacube blod och Kroppsvätskeprotokoll (200 µl med 200 µl eluering) och Orageneprotokollet. För att analysera kontrollområdet sekvenserades prover två gånger i både fram-och bakriktningen med två överlappande primeruppsättningar (15973-296 och 16524-614) med användning av Big-Dye Terminator V 3.1 (Applied Biosystems). Inga skillnader hittades mellan replikat eller mellan prover.,
prover förstärktes för det fullständiga mitokondriella genomet från båda extraktionerna efter Meyer et al.26 PCR-ampliconer sekvenserades på en jon Torrent PGM-sekvenserare på ett Ion314-Chip. Biblioteken förbereddes med hjälp av Ion Xpress Plus Gdna Fragment Library Preparation kit, medan mallberedningen och sekvenseringen utfördes med Ion PGM 200 Xpress Template Kit respektive Ion PGM 200 Sequencing Kit. Raw läser karterades tillbaka till rCRS (NC_012920.1) med hjälp av TMAP programvara som ingår i Jon Anpassning plugin 3.2.1 (Torrent Suite 3.2.,1) på Ion Torrent server. Duplicate läser borttagning och variant calling utfördes med SAMtools 0.1.19 (ref. 41) och lokal anpassning utfördes med Genomanalysverktyget46. Variantställen filtrerades för Baskvalitet 20, Kartläggningskvalitet 50 och Täckningsdjup 30, varefter 33 polymorfa platser behölls. Alla dessa platser har kontrollerats manuellt och bekräftats av Sanger sekvensering i båda riktningarna och replikeras två gånger.,
Kontaminationskontroll och kvantifiering
Modern DNA-förorening av de gamla kvarlevorna kontrollerades med följande metoder:
- 1
utgrävning utfördes under rena förhållanden (se kompletterande metoder)
- 2
prover lagrades i rena laboratorier och gammalt DNA-arbete utfördes endast i dedikerade gamla DNA-anläggningar.
- 3
separata gamla prover bearbetades i separata laboratorier för att replikera resultat.,
- 4
alla labbmedlemmar och utgrävningsdeltagare hade sin mtDNA-typ och Y-kromosomskrivning utfördes på alla inblandade män. Ingen hade en matchande mtDNA eller Y-kromosom typ.
som bevis mot signifikant förorening visar DNA-analys av skelett 1 en perfekt mtDNA-matchning till ML1 och en enda basskillnad med ML2. Det visar också en tydlig Y-STR haplotype, som har replikerats med ett antal extrakt som genereras och testas i två separata laboratorier., Slutligen stöder en undersökning (se kompletterande metoder) av substitutionsmönstret i våra läsningar också detta.
statistisk analys
med ett konservativt tillvägagångssätt vid varje steg beräknar vi sannolikheten för varje objekt av observerade bevis under var och en av två motsatta hypoteser: hypotes 1 (H1): skelett 1 är Richard III och hypotes 2 (H2): skelett 1 är inte Richard III.,
eftersom det var rimligt att anta att alla olika bevislinjer var oberoende, erhölls den gemensamma sannolikheten för alla bevis genom multiplikation av de enskilda likelihoods under varje hypotes. Bevisvikten för H1, som kallas sannolikhetsgraden (LR), gavs sedan av förhållandet mellan sannolikheten för H1 och den för H2. Vi säger att ett antagande är ”konservativt” om det minskar LR.
LR kan omvandlas till en sannolikhet att H1 är sant, med tanke på en tidigare Sannolikhet., Vi tog som utgångspunkt det ögonblick som skelett 1 först observerades och erkändes som ett mänskligt skelett, men innan några bedömningar av ålder, kön, hälsotillstånd och dödsorsak gjordes. Vid denna tidpunkt fanns det betydande bevis för att ett skelett som hittades i vad som tros ha varit platsen för Leicester Grey Friars kören kunde vara Richard III. All information som fanns tillgänglig vid den tidpunkt då skelett 1 var ojordad, inklusive dess exakta plats och arten av graven, betraktades för denna analys som bakgrundsinformation som kan informera den tidigare sannolikheten., På grundval av denna information anser vi att en skeptisk observatör inte rimligen kunde ha tilldelat en tidigare Sannolikhet mindre än 1 av 40. Detta värde föreslogs i en tidigare analys (http://rationalgareth.com/), baserat på vad vi bedömer vara skeptiska bedömningar. Den högsta sannolikheten som kan motiveras av tidigare bevis kan vara 1 i 2.
Vi har använt relevanta, tillgängliga data om möjligt. Oundvikligen krävs subjektiva bedömningar, till exempel relevanta referenspopulationer och om sannolikheterna för fel i rapporterade fakta., Så långt som det verkade möjligt och rimligt strävar vi efter att vara konservativa i vårt tillvägagångssätt, till exempel med hjälp av en pseudocount-metod för att förskjuta LR mot ett neutralt värde på 1, vilket tenderar att undvika falska stora värden från låga observerade frekvenser. Uppgifter om data och metoder som används i den statistiska analysen av radiokarbondata, ålder och kön av skelett, närvaro av skolios, förekomst av perimortem sår, Y-kromosom och mtDNA frekvensdata kan hittas i de kompletterande metoderna. För att sammanfatta resultaten: radiokarbondata gav ett sannolikhetsförhållande på 1.,84 representerar begränsat stöd för H1. Ålders-och könsuppgifterna gav en sannolik ranson på 5,25, vilket återigen representerar begränsat stöd för H1. Närvaron av en axel högre än den andra, rapporterad under Richards livstid, kan hänföras till skolios (skelett 1 hade svår idiopatisk ungdomsuppkomstskoliär) eller två andra kända tillstånd, Erbs pares och Sprengels deformitet, vilka båda är mycket sällsynta. Under H1 ger ovanstående satser en uppskattad sannolikhet på 0.,Med tanke på beskrivningen av Richard III: S fysiska utseende (=skoliosfrekvensen dividerad med summan av de tre räntorna), som vi multiplicerade med 0,95 för att möjliggöra möjligheten att den inspelade beskrivningen var felaktig. Detta leder till en LR av 212, vilket ger måttligt starkt stöd för H1. Förekomsten av perimortem skador gav en LR 42, och så måttligt stöd för H1. Y-kromosomen av skelett 1 matchade inte den av genealogiskt bestämda patrilineala släktingar till Richard III., Detta kan förklaras av en falsk faderskap händelse i en eller flera av de 19 förmodade far-son länkar mellan Richard III och Henry Somerset, femte hertigen av Beaufort. Y-kromosomresultaten indikerar också en ytterligare falsk faderskapshändelse mellan Henry Somerset och hans fem samtida, förmodade patrilinära efterkommande. För att vara konservativ valde vi en publicerad falsk faderskapsfrekvens som var (1) lägre än någon annan publicerad ränta som vi övervägde17,47 och (2) baserat på genealogiska data18., Till detta lägger vi till false-paternity händelsen i 19 putative far-son länkar mellan Henry Somerset och fem samtida manliga kullerbyttor. Detta ger en sannolikhet för minst en falsk faderskapshändelse i de 19 förmodade far-son-länkarna mellan Richard III och Henry Somerset av 0.16. Med tanke på att en falsk faderskapshändelse måste ha inträffat under H1, är populationsfrekvensen för skelett 1: S Y-haploty samma under H1 och H2 och avbryter i LR-beräkningen. Således är LR 0,16, vilket representerar begränsad bevisning mot H1.,
mtDNA-sekvenserna av skelett 1 och den förmodade 19-meios matrilinear släkting till Richard III, Michael Ibsen, matchade helt. En 21-meios släkting matchade också förutom vid en bas (8994). Den senare observationen är lika sannolikt under H1 och H2 med tanke på den observerade sekvensen av Michael Ibsen, och så avbryter i LR. Således behöver vi bara likelihoods för observation av sekvensen som delas av Michael Ibsen och skelett 1.
för att få sannolikheten enligt H1 kräver vi mtDNA-mutationshastigheten, och i detta fall är höga uppskattningar konservativa. Parsons et al.,28 rapportera 10 kontrollregionmutationer i 327 generationer med hjälp av genealogiska data. Eftersom detta tyder på en högre hastighet än andra publicerade uppskattningar, och är baserad på genealogiska data, använde vi den för att härleda en sannolikhet på 0.52 för ingen mutation i 19 meioser.
för sannolikheten enligt H2 kräver vi populationsfraktionen av skelettet 1 haplotypen. Även om vi fick den fullständiga mtDNA genomsekvensen från skelett 1, identifierade vi lite publicerade helgenomjämförelsedata från England., För den statistiska analysen använde vi således endast mtDNA-kontrollregionerna mellan positionerna 16,093 och 16,320 och mellan 00073 och 00188, för vilka vi fick lämpliga engelska jämförelsedata från en uppdatering av Röhl et al.30, kompletterat med mtDNA-sekvenser som tillhandahålls av Rötter för Riktiga (Genetiska Förfader Ltd. Clare, Suffolk, ENGLAND). Att endast använda dessa korta delar av kontrollområdet under H2 är konservativt, eftersom populationsfraktionen av de observerade kontrollregionens sekvenser inte får vara mindre än den fullständiga mtDNA-genomet., Den relevanta referenspopulationen är över 500 år tidigare, men på grund av den stora befolkningsstorleken under skadeundersökningsperioden förväntar vi oss att befolkningsfrekvenserna har förändrats lite under de senaste fem århundradena. Vi hittade frekvensen av skelettet 1 haplotypen till 0 bland 1823 i databasen, till vilken vi lägger till den enda instans som observerats i Michael Ibsen. Detta tillvägagångssätt är återigen konservativt eftersom Michael samplades på grund av hans kända genealogiska förhållande till Richard III. detta leder till en LR av 478 som representerar måttligt starka bevis för H1.,
vi noterade också att det inte fanns några matcher i en databas med 26,127 Europeiska mitokondriella kontrollregion haplotyper (www.empop.org) 29. vi förlitar oss inte på denna databas eftersom den är Europaomfattande snarare än specifik för England och på grund av att fastställa frågor, men det tyder på att skelett 1 haplotypen kan vara mycket ovanligare än vad som kan härledas från vår mindre engelska databas. Vi noterar också att kvinnlig rörlighet bland den europeiska adeln sannolikt kommer att ha varit mycket högre än för den allmänna befolkningen, på grund av äktenskapspraxis i samband med politisk alliansbildning., Sådana metoder skulle ge en viss motivering för att använda den europeiska mtDNA-databasen, och så för att betrakta haplotypen som finns i skelett 1 och Michael Ibsen som extremt sällsynt. I Tilläggstabell 10 visar vi några illustrativa resultat med hjälp av den europeiska databasen för att visa konsekvenserna av att fastställa att skelett 1 haplotypen är så sällsynt som föreslagits av den databasen.
LRs för olika kombinationer av bevis och två bakre sannolikheter visas i Tilläggstabell 10., Med hjälp av alla bevis är stödet för H1 extremt starkt med en LR på 6,7 miljoner, så att vår skeptiker skulle drivas till slutsatsen att sannolikheten att skelett 1 inte är Richard III är mindre än 1 i 100,000, medan för dem som tar en 1 i 2 startposition är sannolikheten mycket mindre än 1 i en miljon. Med hänsyn till de konservativa antaganden som ligger till grund för vår beräkning som beskrivs ovan betraktar vi detta som att fastställa sanningen om H1 bortom rimligt tvivel.