bakteriestammar och plasmider
följande E. coli-stammar användes i denna studie: DH5a, BL21(DE3) (Novagen), CLM24 och Origami2 (DE3) GMD::kan ΔwaaL. DH5a användes för plasmid kloning och rening., BL21 (DE3) användes för uttryck och rening av scfv13-r4dqnat acceptorprotein som användes i alla in vitro glykosyleringsreaktioner. CLM24 är ett glykooptimerat derivat av W3110 som bär en radering i genen som kodar för WaaL-ligaset, vilket underlättar ackumuleringen av förmonterade glykaner på und-PP36. CLM24 användes för rening av cjost-enzymet, organisk lösningsmedelsbaserad extraktion av alla LLO sbearing bakteriella glykaner och källstammen för framställning av extrakt med och utan selektivt berikade glykosyleringskomponenter., Origami2(DE3) hnl::håkan ΔwaaL användes för att producera Man3GlcNAc2 räntebärande LLOs och var som genereras av sekventiell mutation med P1vir fag transduktion med respektive stammar från Keio collection62 som givare, som erhållits från Coli Genetiska Stock Center (CGSC). I korthet, givare lysate genererades från stam JW3597-1 (ΔrfaL734::kan) och den resulterande fag användes för att infektera Origami2(DE3) målceller., Efter pläteringstransformanter på lb-plattor innehållande kanamycin (Kan) valdes framgångsrika givare och deras Kan-resistanskassetter avlägsnades genom att omvandla med temperaturkänslig plasmid pCP2063. Den resulterande stammen, Origami2 (DE3) ΔwaaL, användes sedan för efterföljande radering av GMD-genen enligt en identisk strategi men med hjälp av donatorstam JW2038-1 (Δgmd751::kan).
alla plasmider som används i studien anges i Tilläggstabell 2. Plasmider konstruerade i denna studie gjordes med hjälp av standardkloningsprotokoll och bekräftades genom DNA-sekvensering., Dessa inkluderade följande. Plasmiden pJL1-scFv13-R4DQNAT var som genereras av första PCR-amplifiering av genen kodning scFv13-R4DQNAT från pET28a-scFv13-R4(N34L, N77L)DQNAT, där N34L och N77L mutationer har införts för att eliminera förmodade inre glykosylering platser i scFv13-R452. Den resulterande PCR-produkten ligerades sedan mellan ncoi-och SalI-restriktionsställen i plasmid pJL1, en pET-baserad vektor som användes för CFPS49. Plasmiden pJL1-sfGFP217-DQNAT var som genereras av ligating en kommersiellt syntetiserade DNA-fragment kodning sfGFP217-DQNAT (Integrerad DNA-Teknik) i pJL1., Denna version av sfGFP innehåller en extra GT insättning efter K214, som sträcker sig denna flexibla slinga innan den sista beta sheet64. I denna flexibla loop, omedelbart efter T216, vi ympade en 21-aminosyrasekvens som innehåller C. jejuni AcrA N123 glykosylering site34, men med en optimal DQNAT sequon i stället för den infödda AcrA sequon. Liknande förfaranden som användes för att generera plasmider pJL1-sfGFP217-AQNAT, pJL1-hEPO22-DQNAT-26, pJL1-hEPO36-DQNAT-40, och pJL1-hEPO81-DQNAT-85., I fall av pJL1-hEPO22-DQNAT-26-genen för gammal mänskliga EPO var utformade så att de infödda sequon på N24 har ändrats från och med den 22-AENIT-26 för att en optimal bakteriell sequon, DQNAT. Identiska kloningsstrategier utfördes för att separat införa optimala dqnat-motiv i stället för de infödda hEPO-sekvenserna 36-NENIT-40 och 81-lvnss-85. Rekombinant uttryck av E. coli-O9 primer-adapter glycan (Man3GlcNAc) på Und-PP uppnåddes genom kloning av gener som kodar för den WbdB och WbdC mannosyltransferase enzymer som härrör från E., coli ATCC31616 för montering glycan, och RfbK och RfbM, också härstammar från E. coli ATCC31616 för att öka poolen av tillgängliga BNP-mannos, i E. coli MG1655. Plasmiden pConYCGmCB byggdes av isoterm Gibson montering och kodar en konstgjord operon består av: (i) jäst glycosyltransferases Alg13, Alg14, Alg1, och Alg2 för Man3GlcNAc2 glycan biosynthesis12 och (ii) E. coli-enzymer phosphomannomutase (ManB) och mannos-1-fosfat guanylyltransferase (ManC), som tillsammans öka tillgängligheten av BNP-mannos substrat för Alg1 och Alg2 enzymer.,
proteinuttryck och rening
rening av CjPglB utfördes enligt ett tidigare beskrivet protokoll34. Kortfattat, en enda koloni av E. coli CLM24 redovisade plasmid pSN1865 var vuxen över en natt vid 37 °C i 50 mL Luria-Bertani (LB; 10 g L−1 tryptone, 5 g L−1 jästextrakt, 5 g L−1 NaCl, pH 7,2) kompletteras med ampicillin (Amp) och 0,2% (w/v -%) d-glukos. Övernattningsceller subkulturerades i 1 liter färsk fantastiskt buljong (TB; 12 g L-1 trypton, 24 g L-1 jästextrakt, 0.4% (v/v%) glycerol, 10% (v/v%) 0.17 m KH2PO4/0.,72 m k2hpo4 fosfatbuffert), kompletterad med Amp och odlad tills absorbansen vid 600 nm (Abs600) nådde ett värde av ~0,7. Inkubationstemperaturen justerades till 16 ° C, varefter proteinuttryck inducerades genom tillsats av l-arabinos till en slutlig koncentration av 0,02% (w/v%). Proteinuttryck fick fortsätta i 20 h vid 16 ° C. celler skördades genom centrifugering och stördes sedan med hjälp av en homogenizer (Avestin C5 EmulsiFlex). Lysatet centrifugerades för att avlägsna cellskräp och supernatanten var ultracentrifug (100 000×g) för 2 h vid 4 °C., Den resulterande pelleten innehållande membranfraktionen var helt resuspenderad med en Potter-Elvehjem vävnadshomogenisator i buffert innehållande 50 mm HEPES, 250 mM NaCl, 10% (v/v%) glycerol och 1% (w/v%) n-dodecyl-β-d-maltosid (DDM) vid pH 7.5. Suspensionen inkuberades vid rumstemperatur i 1 h för att underlätta tvättmedelslösning av CjPglB från inhemska E. coli-lipider, som avlägsnades genom efterföljande ultracentrifugation (100 000×g) för 1 h vid 4 °C., Den supernatant som innehåller DDM-solubiliserad CjPglB renades med användning av Ni – nta-harts (Thermo) enligt tillverkarens specifikation med undantag för att alla buffertar kompletterades med 1% (w/v%) DDM. Eluering fraktionen från Ni-NTA rening utsattes sedan för storlek utanförskap kromatografi (SEK) med hjälp av en ÄKTA Explorer FPLC system (GE Healthcare) med Superdex 200 10/300 GL kolumn. Renat protein lagrades vid en slutlig koncentration av 1-2 mg mL-1 i OST – lagringsbuffert (50 mm HEPES, 100 mM NaCl, 5% (v/v%) glycerol, 0.01% (w/v%) DDM, pH 7.5) vid 4 °C., Glycerolkoncentrationen i provet justerades till 20% (v/V%) för långtidslagring vid -80 °C.
rening av acceptorprotein scFv13-R4DQNAT utfördes som tidigare beskrivits52. Kortfattat, E. coli-stam BL21(DE3) redovisat plasmid pET28a-scFv13-R4(N34L, N77L)DQNAT som odlades i 1 L TB levereras med kanamycin. Kulturen inkuberades vid 37 ° C tills Abs600 nådde ~ 0,7, vid vilken punkt proteinuttryck inducerades genom tillsats av isopropyl β-D-1-tiogalaktopyranosid (IPTG) till en slutlig koncentration av 0,1 mm. proteinuttryck fick fortsätta för 20 h vid 25 ° C., Celler skördades och stördes identiskt som beskrivits ovan. ScFv13 – r4dqnat-proteinet renades med Ni – nta-harts följt av SEC enligt tillverkarens protokoll. Protein lagrades vid en slutlig koncentration av 1-2 mg mL-1 i lagringsbuffert (50 mm HEPES, 250 mM NaCl, 1 mM EDTA, pH 7, 5) vid 4 ° C.
extraktion av LLOs
protokollet för organisk lösningsmedelsextraktion av LLOs från E. coli-membran anpassades från ett tidigare beskrivet protocol34, 66., I de flesta fall odlades en enda koloni av stam CLM24 med en plasmid för målglykanbiosyntes (Tilläggstabell 2) över natten i LB-media. De anmärkningsvärda undantagen var LLOs med W. succinogenes N-glycan (WsLLOs), som framställts med hjälp av DH5a celler som bär pEpiFOS-5pgl5 fosmid (vänligen tillhandahållits av Dr. Markus Aebi), och LLO sbearing Man3GlcNAc2, som framställts med hjälp av Origami2(DE3) hnl::håkan ΔwaaL celler som transporterar plasmid pConYCGmCB. Övernattningsceller subkulturerades i 1 l TB kompletterat med ett lämpligt antibiotikum och odlades tills Abs600 nådde ~ 0.7., Inkubationstiden var temperaturen justeras till 30 °C för biosyntes av alla glycans med undantag för Man3GlcNAc2, som justerades till 16 °C. För plasmid pMW07-pglΔB, protein expression var inducerad med l-arabinose till en slutlig koncentration på 0,2% (w/v -%) medan för fosmid pEpiFOS-5pgl5 induktion var med isopropyl-β-d-1-thiogalactopyranoside (IPTG) till en slutlig koncentration av 1 mM. Alla andra plasmider som deltar konstitutiva projektansvariga och därmed inte kräver kemiska inducerare. Efter 16 h skördades celler genom centrifugering och cellpellets lyofiliserades till fullständig torrhet vid -70 ° C., För utvinning av CjLLOs, infödda och konstruerad ClLLOs, E. coli-O9 primer-adapter LLOs, och WsLLOs, den lyophilisates avbröts 10:20:3 mängdförhållandet av CHCl3:CH3OH:H2O lösning och inkubera det vid rumstemperatur i 15 min för att underlätta utvinningen av LLOs. För utvinning av LLO sbearing Man3GlcNAc2 glycan, lyofilisat har successivt upphängd i 10:20 (v/v%) CHCl3:CH3OH lösning, vatten och 10:20:3 CHCl3:CH3OH:H2O lösning med 15 min inkubation vid rumstemperatur mellan varje steg., I varje fall centrifugerades den slutliga suspensionen (4000×g) i 15 min, varefter det organiska skiktet (bottenskiktet) samlades och torkades med en vakuumkoncentrator följt av lyofilisering. Lyophilisates innehåller aktiva LLOs var resuspension i cell-gratis glykosylering buffert (10 mM HEPES -, pH 7.5, 10 mM MnCl2, och 0,1% (w/v -%) DDM) och förvaras vid 4 °C.
Beredning av råolja S30 extrakt
CLM24 källa stammar hade vuxit i 2×YTPG (10 g L−1 jästextrakt, 16 g L−1 tryptone, 5 g L−1 NaCl, 7 g L−1 K2HPO4, 3 g L−1 KH2PO4, 18 g L−1 glukos, pH 7,2) tills Abs600 nått ~3., För att generera OST-berikad extrakt, CLM24 redovisade plasmid pSF-CjPglB, pSF-CcPglB, pSF-DdPglB, pSF-DgPglB, eller pSF-DvPglB52 användes som källa stam. För att generera LLO-berikad extrakt, CLM24 redovisade plasmid pMW07-pglΔB användes som källa stam. För att skapa en pott extrakt som innehåller både OST och LLOs, CLM24 redovisade pMW07-pglΔB och pSF-CjOST användes som källa stam. Vid behov inducerades uttrycket av glykosyleringskomponenter med L-arabinos vid slutlig koncentration av 0,02% (w/v%)., Efter induktion fick proteinuttryck fortsätta vid 30 ° C till en densitet av OD600 ~ 3, vid vilken punktceller skördades genom centrifugering (5000×g) vid 4 °C i 15 min. Alla efterföljande steg utfördes vid 4 ° C om inget annat anges. Pelleterade celler tvättades tre gånger i S30-buffert (10 mM trisacetat, 14 mM magnesiumacetat, 60 mM kaliumacetat, pH 8.2). Efter den sista tvätten pelleterades cellerna vid 7000×G i 10 min och flashfrystes på flytande kväve. För att göra lysat tinades cellerna och resuspenderades till homogenitet i 1 mL S30-buffert per 1 g våtcellmassa., Celler stördes med hjälp av en Avestinemulsiflex – B15 högtryckshomogenisator vid 20 000-25 000 psi med en enda passage. Lysatet centrifugerades sedan två gånger vid 30,000×g för 30 min för att ta bort cellrester. Supernatant överfördes till ett nytt kärl och inkuberades med 250 rpm skakning vid 37 ° C under 60 min för att försämra endogena mRNA-transkript och störa befintliga polysomkomplex i lysatet. Efter centrifugering (15 000×g) i 15 minuter vid 4 °c samlades supernatanten upp, alikvoterades, frystes i flytande kväve och förvarades vid -80 ° C., S30-extraktet var aktivt i cirka tre frystappcykler och innehöll ~40 g L-1 totalt protein mätt med Bradford-analys.
Cell-gratis-glykoprotein syntes
För in vitro-glykosylering av renat acceptor protein, reaktioner har genomförts i 50 µL volym som innehåller 3 µg scFv13-R4DQNAT, 2 µg renat CjPglB, och 5 µg extraherade LLOs (i fall av Man3GlcNAc2 LLOs, 20 µg) som använts i in vitro-glykosylering buffert (10 mM HEPES -, pH 7.5, 10 mM MnCl2, och 0,1% (w/v -%) DDM). Reaktionsblandningen inkuberades vid 30 ° C under 16 h., För rå extrakt-baserade uttryck av glykoproteiner genomfördes ett tvåfasschema. I den första fasen utfördes proteinsyntes med ett modifierat PANOx-SP-system67. Specifikt laddades 1,5 mL mikrocentrifuger med 15 µL-reaktioner innehållande 200 ng plasmid-DNA, 30% (v/v%) S30−extrakt och följande: 12 mM magnesiumglutamat, 10 mM ammoniumglutamat, 130 mM kaliumglutamat, 1,2 mM adenosintrifosfat (ATP), 0,85 mM guanosintrifosfat (GTP), 0,85 mM uridintrifosfat (UTP), 0,85 mM cytidintrifosfat (CTP), 0,034 mg mL-1 folinsyra, 0.,171 mg mL-1 E. coli tRNA (Roche), 2 mM vardera av 20 aminosyror, 30 mm fosfoenolpyruvat (PEP, Roche), 0, 4 mM nikotinamidadenindinukleotid (NAD), 0, 27 mM koenzym-A (CoA), 4 mM oxalsyra, 1 mm putrescin, 1, 5 mM spermidin och 57 mM HEPES. För scFv13-R4DQNAT, hEPO22-DQNAT-26, hEPO36-DQNAT-40, och hEPO81-DQNAT85, denna fas genomfördes vid 30 °C i 4 h under oxiderande förhållanden, medan den för sfGFP217-DQNAT och sfGFP217-AQNAT denna fas genomfördes vid 30 °C i 5 min under reducerande förhållanden., För oxidationsbetingelser var extraktet förkonditionerat med 750 µM jodoacetamid i mörkret vid rumstemperatur i 30 min och reaktionsblandningen levererades med 200 mM glutation vid ett 3:1-förhållande mellan oxiderade och reducerade former. De aktiva sfGFP-utbytena från cellfria reaktioner kvantifierades genom mätning av fluorescens i-lysat och omvandling till koncentration med hjälp av en standardkurva som tidigare beskrivet39. I den andra fasen initierades proteinglykosylering genom tillsats av MnCl2 och DDM vid en slutlig koncentration av 10 mM och 0.,1% (w/v -%), respektive, och som får fortsätta vid 30 °C i 16 h. Som behövs, reaktioner kompletterades med 2 µg renat CjPglB (dvs, för CFGpS med LLO-berikad extrakt) eller 5 µg extraherade med lösningsmedel CjLLOs (dvs, för CFGpS med OST-berikad utdrag). Alla reaktioner stoppades genom att lägga till Laemmli prov buffert innehållande 5% ßME, efter vilka prover var kokt på 100 °C i 15 min och analyseras av SDS-PAGE och western blotting.
Western blot analysis
prover som innehåller 0,5 µg acceptorprotein laddades in i SDS-SIDGELER., Efter elektroforetisk separation överfördes proteiner från geler till Immobilon-p polyvinylidendifluorid (PVDF) membran (0.45 µm) enligt tillverkarens protokoll. Membran tvättades två gånger med TBS-buffert (80 g L−1 NaCl, 20 g L−1 KCl och 30 g L−1 Tris-base) följt av inkubation för 1 h i blockeringslösning (50 g L−1 fettfri mjölk i TBST (TBS levereras med 0,05% (v/v%) Tween-20)). Efter blockering tvättades membran 4 gånger med TBST med 10 min inkubation mellan varje tvätt., En första membranet var uppmätta med 6xHis-polyklonal antikropp (Abcam, ab137839, 1:7500) som specifikt känner igen hexahistidine epitop taggar medan en andra replikera membranet var uppmätta med något av följande: hR6 (1:10,000) serum från kanin som känner igen den infödda C. jejuni och C. lari glycan liksom konstruerad C. lari glycan eller ConA-HRP (Sigma, L6397, 1:2500) som erkänner Man3GlcNac och Man3GlcNAc2. Sondering av membran utfördes i minst 1 h med skakning vid rumstemperatur, varefter membran tvättades med TBST på samma sätt som beskrivits ovan., För utveckling inkuberades membran kort vid rumstemperatur med Western ECL-substrat (BioRad) och avbildades med hjälp av ett ChemiDocTM XRS+ – System. OST enzymer berikas i extrakt upptäcktes av en identisk SDS-PAGE förfarande som följts av Western blot analys med en polyklonal antikropp som är specifik till FLAGGAN epitop tag (Abcam, ab49763, 1:7500). Glycankomponenten i LLOs berikad i extrakt detekterades genom direkt spotting 10 µL extrakt på nitrocellulosmembran följt av detektion med hR6 serum. Okuperade immunoblotting bilder visas i Kompletterande Fig. 8.,
MS-analys
i Ca 2 µg scFv13-R4DQNAT protein i lösning var denaturerad med 6 M urea, sänkt med 10 mM DTT, inkuberas vid 34 °C i 1 h, därefter alkylerade med 58 mM iodoacetamide för 45 minuter i mörker vid rumstemperatur och härdas av den slutliga 36 mM DTT. Lösningen späddes sedan med 50 mM ammoniumbikarbonat (pH 8.0) till en slutlig buffertkoncentration av 1 m urea före trypsinuppslutning. Provet smältes med 0,2 µg trypsin för 18 h vid 37 ° C. matsmältningen stoppades genom tillsats av TFA till ett slutligt pH 2,2-2,5., Proverna avsaltades sedan med SOLA HRP SPE-patron (Termofisher Scientific). Patronerna konditionerades med 1 × 0, 5 mL 90% metanol, 0, 1% trifluorättiksyra (TFA) och jämviktades med 2 × 0, 5 mL 0, 1% (v/v%) TFA. Proverna späddes 1: 1 med 0.2% (v / v%) TFA och löper långsamt genom patronerna. Efter tvättning med 2 × 0,5 mL jämviktslösning eluerades peptider med 1 × 0,5 mL 50% (v/v%) acetonitril (ACN), 0,1% (v/v%) TFA och torkades i en hastighet vakuumcentrifug.,
nanoLC–MS/MS-analys genomfördes med hjälp av UltiMate3000 RSLCnano (Dionex) kopplad till en Orbitrap Fusion (ThermoFisher Vetenskapliga) masspektrometer utrustade med en nanospray Flex jonkälla. Varje prov ombildades 22 µL 0,5% (w/v -%) FA och 10 µL var lastas på ett Bifall PepMap 100 C18 fälla kolumn (5 µm 100 µm × 20 mm, 100 Å, ThermoFisher Vetenskapliga) med nanoViper Beslag på 20 µL min−1 0,5% FA online avsaltning., Efter 2 min bytte ventilen för att tillåta att peptider separeras på en Acclaim PepMap C18 Nano−kolonn (3 µm, 75 µm × 25 cm, ThermoFisher Scientific), i en 90 min gradient av 5 till 23% till 35% B vid 300 nL min-1 (3 till 73 till 93 min, respektive), följt av en 9-min ramp till 90% b, en 9-min håll vid 90% B och snabb omkopplare till 5% B i 1 min. Kolonnen återjämviktades med 5% B under 20 min före nästa körning. Orbitrap-fusionen fungerade i positivt jonläge med nanospray-spänning inställd på 1,7 kV och källtemperatur vid 275 °C., Extern kalibrering för FT, IT och quadrupole massanalysatorer utfördes före analysen. Orbitrap full MS survey scan (m/z 400-1800) följdes av topp 3 s databeroende högre Kollisionsdissociationsprodukt ion triggered ETD (HCD-PD-ETD) MS / MS skannar för prekursorpeptider med 2-7 laddningar över ett tröskeljontal på 50 000 med normaliserad kollisionsenergi på 32%., MS undersökning skanningar förvärvades vid en upplösningseffekt på 120,000 (FWHM vid m/z 200), med automatisk Gin kontroll (AGC) = 2e5 och maximal injektionstid (Max IT) = 50 ms, och HCD MS/MS skannar med en upplösning på 30,000 med AGC = 5e4, Max IT = 60 ms och med Q isoleringsfönster (m/z) vid 3 för massområdet m/z 105-2000. Dynamiska uteslutningsparametrar sattes till 1 inom 60 s uteslutningstid med ±10 ppm uteslutningsmassbredd. Produkt Ion utlösa lista bestod av toppar på 204.0867 Da (HexNAc oxonium ion), 138.0545 Da (HexNAc fragment), och 366.1396 Da (HexHexNAc oxonium joner)., Om en av HCD-produktjonerna i listan upptäcktes utlöstes två laddberoende ETD MS/MS-skanningar (EThcD) med HCD-tilläggsaktivering (SA) på samma prekursorjon och samlades in i en linjär jonfälla. För dubbelt laddade prekursorer fastställdes ETD-reaktionstiden enligt 150 ms och SA-energin till 30%, medan samma parametrar vid 125 ms respektive 20% användes för högre laddade prekursorer. För båda jonstyrda skanningar sattes fluoranten ETD-reagensmålet på 2e5, AGC-målet på 1e4, Max det på 105 ms och isoleringsfönstret vid 3. Alla data förvärvades med Xcalibur 3.,0 drift programvara och Orbitrap Fusion Tune Ansökan v. 2.1 (ThermoFisher Vetenskapliga).
alla MS och MS / MS raw spectra från varje prov söktes med Byonics v.2.8.2 (protein Metrics) med hjälp av E coli-proteindatabasen med tillsatt scFv13-R4DQNAT-proteinmålsekvens. Peptidsökningsparametrarna var följande: två missade klyvning för full trypsin matsmältning med fast karbamidometylmodifiering av cystein, variabla modifieringar av metioninoxidation och deamidering på asparagin/glutaminrester., Peptidmasstoleransen var 10 ppm och fragmentmasstoleransvärden för HCD och EThcD spectra var 0,05 respektive 0,6 Da. Både det maximala antalet vanliga och sällsynta modifieringar fastställdes till två. Glycan-sökningen utfördes mot en lista över 309 Däggdjursbundna n-länkade glykaner i Byonic-programvara. Identifierade peptider filtrerades för maximalt 2% FDR. Programvaran exporterade resultaten av sökningen till ett kalkylblad.
GFP-fluorescensaktivitet
aktiviteten hos cellfri härledd sfGFP bestämdes med användning av en fluorescensanalys i lysat som tidigare beskrivits39., Kort sagt, 2 µL cellfri syntetiserad glykosylerad sfGFP-reaktion späddes till 48 µL nanopurvatten. Lösningen placerades sedan i en costar 96-well black assay plate (Corning). Excitation och emissionsvåglängder för fluorescens med sfGFP var 485 respektive 528 nm.
enzymbunden immunosorbentanalys (ELISA)
costar 96-well ELISA-plattor (Corning) beläggs över natten vid 4 °C med 50 µl 1 mg mL−1 E. coli β-gal (Sigma-Aldrich) i 0, 05 m natriumkarbonatbuffert (pH 9, 6)., Efter att blockera med 5% (w/v -%) bovint serum albumin (BSA) i PBS för 3 timmar vid rumstemperatur, plåtarna var tvättade fyra gånger med PBST buffert (PBS, 0,05 procent (v/v%) Tween-20, för 0,3% (w/v -%) BSA) och inkuberas med seriellt efter utspädning renat scFv13-R4 prover eller vattenlösliga fraktioner av CFGpS lysates för 1 h i rumstemperatur. Proverna kvantifierades genom Bradford-analysen och en ekvivalent mängd totalt protein applicerades på plattan. Efter att ha tvättat fyra gånger med samma buffert tillsattes anti-6×-His-HRP-konjugerad kaninpolyklonal antikropp (Abcam) i 3% PBST till varje brunn för 1 h., Plattorna tvättades och utvecklades med hjälp av standardprotokoll.
in vitro cellproliferationstest
Human erytroleukemia TF–1-celler (Sigma) som kräver granulocyt–makrofagkolonistimulerande faktor (GM-CSF), interleukin 3 (IL-3) eller hEPO för tillväxt och överlevnad användes. Celler upprätthölls i RPMI-1640-media kompletterat med 10% FBS, 50 U mL-1 penicillin, 50 mg mL-1 streptomycin, 2 mM glutamin och 2 ng mL−1 GM-CSF vid 37 °C i en fuktad atmosfär innehållande 5% CO2., Efter 16 h inkubation i RPMI-1640 media utan GM-CSF, celler räknades, skördas, och resuspenderas i färska medier. 5 × 103 TF-1-celler per brunn frös i en 96-brunnstestplatta, och EPO-standarder eller prover tillsattes till slutliga önskade koncentrationer till varje brunn. Celler inkuberades med för 6 h i fuktig inkubator innan alamarblue®. Efter 12 h mättes fluorescenssignalen vid 560 nm/590 nm excitation/emissionsvåglängd.,
datatillgänglighet
Alla data som genereras under studien ingår i denna artikel och dess kompletterande informationsfiler, och är tillgängliga från författarna på rimlig begäran.