lokalizacje laboratoryjne

wszystkie prace DNA z udziałem współczesnych krewnych przeprowadzono na Uniwersytecie w Leicester. Krewni linii męskiej zostali wpisani za pomocą Promega PowerPlex Y23 i dla SNP definiujących Główne Europejskie y-haplogrupy w Leicester z podzbiorem typowania potwierdzonym na Université Paul Sabatier. Krewni linii żeńskiej zostali zsekwencjonowani dla całego mitochondrialnego genomu na Uniwersytecie w Leicester., DNA pozyskano ze starożytnych zębów i kości na Uniwersytecie w Yorku i Université Paul Sabatier w Tuluzie. Przygotowanie biblioteki i wzbogacenie celu przeprowadzono na Uniwersytecie w Yorku. Sekwencjonowanie jednostronne 100-bp przy użyciu hiseq 2000 (Illumina, CA, USA) zostało przeprowadzone w Zakładzie sekwencjonowania w Kopenhadze. Ukierunkowane sekwencjonowanie zarówno współczesnego, jak i starożytnego DNA przeprowadzono również w genomic technical platform PlaGe (Genopole, Tuluza, Francja) oraz w Protein Nucleic Acid Chemistry Laboratory na Uniwersytecie w Leicester. Poniżej przedstawiamy skróconą wersję stosowanych metod., Dla każdego kroku pełne informacje można znaleźć w metodach dodatkowych. Szczegóły dotyczące szeroko zakrojonych badań genealogicznych przeprowadzonych dla tego projektu można znaleźć w nocie dodatkowej 2.

pobieranie próbek

DNA zostało pobrane z próbek śliny współczesnych krewnych Ryszarda III, a wszyscy uczestnicy zostali zrekrutowani za świadomą zgodą po przeglądzie projektu przez komitet etyki badawczej Uniwersytetu w Leicester.

odkopano szkielet 1 i pobrano próbki w Warunkach czystych37., Wszyscy zaangażowani w wykopaliska w Grey Friars site, clean laboratory w Leicester i ci zaangażowani w laboratoria i prace laboratoryjne mieli swoje mitochondrialne i, dla mężczyzn, chromosomy Y wpisane. DNA zostało pobrane z próbek śliny, a wszyscy uczestnicy zostali zrekrutowani za świadomą zgodą.

ekstrakcja DNA z próbek starożytnych

DNA zostało wyekstrahowane z próbek zębów i kości (kości udowej). Wszystkie zabiegi były wykonywane w specjalnych laboratoriach antycznego DNA na Uniwersytecie w Yorku i Université Paul Sabatier w Tuluzie z zachowaniem odpowiednich środków zapobiegających skażeniu., Dwie półfabrykaty do ekstrakcji zostały włączone i traktowane dokładnie tak, jakby były ekstraktami przez cały proces. PCR i eksperymenty biblioteczne zawierały również dalsze puste kontrolki.

Sex-typing Test wykonany na szkielecie 1

zastosowano nowo zaprojektowany sex-typing test składający się z primerów PCR do jednoczesnego amplifikacji fragmentu SRY z regionami homologicznymi UTX i UTY. Test ten został zaprojektowany w celu umożliwienia współ amplifikacji stosunkowo niewielkich fragmentów SRY, UTX i UTY z próbek, które mogą zawierać zdegradowany DNA10.,

analiza mitochondrialnego obszaru kontrolnego szkieletu 1

Analiza hiperwariowalnych segmentów (HV1, HV2 i HV3) obszaru kontrolnego mtDNA została przeprowadzona poprzez amplifikację i bezpośrednie uporządkowanie wielu nakładających się fragmentów o wielkości od 153 do 250 bp (http://forensic.yonsei.ac.kr/protocol/mtDNA-midi-mini.pdf)22. Wybór amplikonów został użyty do klonowania produktów PCR w laboratorium w Tuluzie. Sekwencjonowanie zostało przeprowadzone przy użyciu Terminatora V3.,Zestaw do sekwencjonowania 1 cyklu (Applied Biosystems) i elektroforeza kapilarna na analizatorze genetycznym ABI Prism 3730 (Applied Biosystems) w laboratorium chemicznym kwasu nukleinowego na Uniwersytecie w Leicester lub na platformie technicznej genomowej PlaGe (Genopole).

mitochondrialny Genom/y-SNP/HIrisplex typowanie szkieletu 1

biblioteki zostały zbudowane po Meyerze i Kircher16, z tym wyjątkiem,że pierwszy etap filtracji między tępym zakończeniem naprawy a ligacją adaptera został zastąpiony przez inaktywację cieplną enzymów38, 39., Zaprojektowano dwa mikrozaczepy, jeden do wzbogacania mtDNA, a drugi do wzbogacania SNP. Wzbogacanie DNA przeprowadzono metodą hybrydyzacji przy użyciu Agilent 244K DNA SureSelect microarray (Agilent, Böblingen, Niemcy). W celu wychwytywania energii jądrowej sondy z chromosomem Y zostały zaprojektowane tak, aby pokrywały SNP istotne dla głównych linii Europejskich14. Kolejne sondy zostały zaprojektowane w celu pokrycia SNP istotnych dla markerów HIrisplex31. Te dwa zestawy sond (mitochondrialne i SNP) zostały użyte oddzielnie do wypełnienia dwóch różnych wzorów mikromacierzy w formacie 1 × 244k., Dla każdego microarray, protokół przechwytywania przeprowadzono po Hodges et al.15 z modyfikacjami zaproponowanymi przez Zhang i wsp.40 i Fortes i Paijmans38. Biblioteki zostały połączone w równych ilościach i uporządkowane na dwóch torach Platformy Illumina HiSeq 2000 w trybie 100 SE w zakładzie sekwencjonowania Uniwersytetu Kopenhaskiego w Danii.

odczyty raw z każdej biblioteki zostały posortowane na podstawie indeksu sześciu nukleotydów użytego podczas przygotowywania biblioteki. Do dalszych analiz wybrano tylko odczyty ze 100% dopasowaniem do indeksu., W wyniku dalszej analizy odrzucono 25 nukleotydów. Przycięte odczyty zostały zmapowane do autosomów i chromosomów płci z ludzkiego genomu referencyjnego build 37 (GRCh37) oraz do rCRS (NC_012920.1) za pomocą bwa 0.7.5 a-r405 (ref. 41). Przy każdym wyrównaniu pliki wyjściowe BAM były scalane przy użyciu SAMtools 0.1.19 (ref. 41) i duplikaty PCR zostały następnie usunięte. Odwzorowane odczyty były filtrowane na podstawie jakości odwzorowania > 29 i ich wyrównania do unikalnych pozycji wzdłuż sekwencji odniesienia.,

pozycje polimorficzne zostały zidentyfikowane za pomocą SAMtools (SAMtools 0.1.19) i bcftools. Wreszcie, vcfutils.pl została użyta do filtrowania listy wariantów zgodnie ze skalowanym genotypem > 20 i głębokością odczytu większą niż 10. Aby uniknąć nieporozumień ze względu na wzór deaminacji starożytnych cząsteczek DNA, wszystkie polimorficzne pozycje zgłaszane w pliku wyjściowym VCF zostały sprawdzone przez oko., W przypadku genomu mitochondrialnego zespół do odniesienia wizualizowano w Tablet42, natomiast wyrównanie odczytów zawierających SNP do chromosomów odniesienia wizualizowano za pomocą IGV43.

typowanie SNP przez PCR

podejście wychwytywania dawało niewystarczające pokrycie dla wszystkich SNP HIrisPlex i Y-chromosomu i dlatego primery zostały zaprojektowane do generowania amplikonów zawierających te SNP, jak również dwa SNP, które dalej definiują haplogrupę chromosomu Y: M285 (G1) i P287 (G2) (ref. 14). Zostały one wzmocnione w ramach reakcji multipleksowych po Römpler et al.,44 lub reakcje singleplex (z użyciem 40 cykli i bez wtórnego wzmocnienia) i sekwencjonowane na Ion Torrent po przygotowaniu biblioteki za pomocą Ion PGM 200 Xpress Template Kit i PGM 200 Sequencing Kit. Aby zwiększyć zasięg, singleplex PCR i sekwencjonowanie jednego markera (Rs28777) przeprowadzono zgodnie z Binladen et al.45

typowanie haplogrupy G definiującej SNP (M201, M285 i P287) powtórzono w Tuluzie przy użyciu singleplex PCRs. Sekwencjonowanie tych produktów PCR przeprowadzono przy użyciu Big-Dye Terminator V3.,Zestaw do sekwencjonowania 1 cyklu (Applied Biosystems) analizowany za pomocą elektroforezy kapilarnej na analizatorze genetycznym ABI Prism 3730 (Applied Biosystems) na platformie technicznej genomowej PlaGe (Genopole).

analiza haplotypów chromosomu Y

haplotypy chromosomu Y starożytnych i współczesnych próbek zostały uzyskane przy użyciu systemu PowerPlex Y23 (Promega) i analizowane za pomocą elektroforezy kapilarnej na analizatorze genetycznym ABI Prism 3730 (Applied Biosystems) na platformie technicznej genomowej PlaGe (Genopole) oraz na analizatorze genetycznym ABI Prism 3130xl (Applied Biosystems) na Uniwersytecie w Leicester., W przypadku szkieletu 1 przeprowadzono to na trzech oddzielnych ekstraktach (RM2, LM1 i LM3) w dwóch różnych starożytnych laboratoriach DNA (York i Tuluza). Dla współczesnych krewnych przeprowadzono to na dwóch różnych ekstraktach w dwóch różnych nowoczesnych laboratoriach(Leicester i Tuluza).

y-chromosomalne SNP analiza nowoczesnych próbek

Po określeniu y-haplotypu dla nowoczesnych Male-line próbek, przewidywane haplogrupy wyznaczono przy pomocy haplogrupy predyktora whittheya (http://www.hprg.com/hapest5/hapest5a/hapest5.htm?order=num)., Binarne markery obejmujące te i pokrewne rodowody były typowane w dwóch multipleksach przez procedurę minisequencing migawki (Applied Biosystems) i analizator genetyczny ABI3130xl (Applied Biosystems), a następnie potwierdzenie przy użyciu sekwencjonowania Sangera. Somerset 3 został oznaczony jako Hg I (M170+ M223−, M253−)14, co potwierdziło laboratorium w Tuluzie. Dla R1b-U152 określono Salta 1,2,4 i 5. Somersety 1,2,4 i 5 zostały przetestowane pod kątem SNP dzielących ten klad13 (Z56, M126, Z36, Z192, M160 i L2) przy użyciu sekwencjonowania Sangera w obu laboratoriach.,

Nowoczesna analiza mtDNA

obie próbki zostały powtórzone dwukrotnie.

próbki pobrano przy użyciu zestawów do pobierania DNA ORAGENE (DNA Genotek) i DNA ekstrahowanego przy użyciu dwóch różnych metod: protokołu Qiacube Blood and Body Fluid protocol (200 µl z 200 µl elucji) oraz Protokołu Oragene. W celu analizy obszaru kontrolnego próbki sekwencjonowano dwukrotnie w kierunku do przodu i do tyłu za pomocą dwóch nakładających się zestawów podkładów (15973-296 i 16524-614) za pomocą Terminatora Big-Dye V 3.1 (Applied Biosystems). Nie stwierdzono różnic między replikatami ani między próbkami.,

próbki zostały amplifikowane dla kompletnego genomu mitochondrialnego z obu ekstrakcji po Meyer et al.26 AMPLIKONÓW PCR zsekwencjonowano na Sekwenatorze PGM Ion Torrent na chipie Ion314. Biblioteki zostały przygotowane przy użyciu Ion Xpress Plus gDNA Fragment Library Preparation kit, natomiast przygotowanie szablonu i sekwencjonowanie przeprowadzono przy użyciu Ion PGM 200 Xpress Template Kit i Ion PGM 200 Sequencing Kit, odpowiednio. Odczyty Raw były mapowane z powrotem do rCRS (NC_012920.1) za pomocą oprogramowania TMAP dołączonego do wtyczki Ion Alignment 3.2.1 (Torrent Suite Software 3.2.,1) na serwerze Ion Torrent. Usuwanie zduplikowanych odczytów i wywołanie wariantu zostały wykonane przy użyciu SAMtools 0.1.19 (ref. 41) i lokalne porządkowanie przeprowadzono za pomocą narzędzia do analizy genomu Kit46. Lokalizacje wariantowe zostały przefiltrowane dla jakości podstawowej 20, jakości odwzorowania 50 i głębokości pokrycia 30, po czym zachowały się 33 polimorficzne lokalizacje. Wszystkie te miejsca zostały ręcznie sprawdzone i potwierdzone przez sekwencjonowanie Sangera w obu kierunkach i powtórzone dwukrotnie.,

Kontrola skażeń i kwantyfikacja

Współczesne skażenie DNA starożytnych szczątków było kontrolowane za pomocą następujących metod:

  1. 1

    Wykopaliska prowadzono w czystych warunkach (patrz metody uzupełniające)

  2. 2

    próbki przechowywano w czystych laboratoriach, a prace nad starożytnym DNA prowadzono tylko w specjalnie do tego przeznaczonych laboratoriach.

  3. 3

    oddzielne starożytne próbki były przetwarzane w oddzielnych laboratoriach w celu replikacji wyników.,

  4. 4

    wszyscy członkowie laboratorium i uczestnicy wykopali na maszynie mtDNA, a typowanie chromosomu Y przeprowadzono na wszystkich zaangażowanych mężczyznach. Żaden z nich nie miał dopasowanego typu mtDNA lub chromosomu Y.

jako dowód przeciwko znaczącemu zanieczyszczeniu, analiza DNA szkieletu 1 pokazuje idealne dopasowanie mtDNA do ML1 i różnicę pojedynczej Zasady z ML2. Wykazuje również wyraźny haplotyp Y-STR, który został powielony przy użyciu wielu ekstraktów generowanych i testowanych w dwóch oddzielnych laboratoriach., Wreszcie, badanie (patrz metody uzupełniające) wzoru substytucji w naszych czytaniach również to potwierdza.

Analiza statystyczna

stosując konserwatywne podejście na każdym kroku, obliczyliśmy Prawdopodobieństwo dla każdego elementu obserwowanego dowodu pod każdą z dwóch przeciwstawnych hipotez: hipoteza 1 (H1): szkielet 1 to Ryszard III, a hipoteza 2 (H2): szkielet 1 to nie Ryszard III.,

ponieważ uzasadnione było założenie, że wszystkie różne linie dowodowe są niezależne, łączne prawdopodobieństwo wszystkich dowodów uzyskano przez pomnożenie poszczególnych prawdopodobieństw pod każdą hipotezą. Waga dowodów dla H1, zwana współczynnikiem prawdopodobieństwa (LR), została następnie podana przez stosunek prawdopodobieństwa poniżej H1 do tego poniżej H2. Mówimy, że założenie jest „konserwatywne”, jeśli zmniejsza LR.

LR można przekształcić w prawdopodobieństwo, że H1 jest prawdziwe, biorąc pod uwagę wcześniejsze prawdopodobieństwo., Jako punkt wyjścia przyjęliśmy moment, w którym szkielet 1 został po raz pierwszy zaobserwowany i uznany za szkielet ludzki, ale przed dokonaniem jakichkolwiek ocen wieku, płci, stanu zdrowia i przyczyny śmierci. W tym momencie pojawiły się istotne dowody na to, że szkielet znaleziony w tym, co uważa się za lokalizację chóru Leicester Grey Friars, może być dziełem Ryszarda III. Wszystkie informacje dostępne w momencie odkrycia szkieletu 1, w tym jego dokładne położenie i charakter grobu, zostały uznane za podstawowe informacje, które mogą zapewnić wcześniejsze prawdopodobieństwo., Na podstawie tych informacji uważamy, że sceptyczny obserwator nie mógł racjonalnie przydzielić wcześniejszego prawdopodobieństwa mniej niż 1 na 40. Wartość ta została zaproponowana w poprzedniej analizie (http://rationalgareth.com/), w oparciu o to, co uważamy za oceny sceptyczne. Najwyższe prawdopodobieństwo, które może być uzasadnione wcześniejszymi dowodami, może wynosić 1 do 2.

w miarę możliwości wykorzystaliśmy odpowiednie, dostępne dane. Nieuchronnie wymagane są subiektywne osądy, na przykład odpowiednie populacje referencyjne i dotyczące prawdopodobieństwa błędu w zgłaszanych faktach., Tak dalece, jak wydawało się to możliwe i rozsądne, staraliśmy się być konserwatywni w naszym podejściu, na przykład, używając metody pseudocount, aby ustawić LR w kierunku neutralnej wartości 1, unikając w ten sposób fałszywych dużych wartości z niskich obserwowanych częstotliwości. Szczegóły dotyczące danych i metod stosowanych w statystycznej analizie danych radiowęglowych, wieku i płci szkieletu, obecności skoliozy, obecności ran przedśmiertnych, chromosomu Y i częstotliwości mtDNA można znaleźć w metodach dodatkowych. Podsumowując wyniki: DANE radiowęglowe dały współczynnik prawdopodobieństwa 1.,84.00 m2 Dane dotyczące wieku i płci dały prawdopodobieństwo 5,25, ponownie reprezentując ograniczone poparcie dla H1. Obecność jednego ramienia wyżej niż drugiego, odnotowana za życia Richarda, może być przypisana skoliozie (szkielet 1 miał ciężką idiopatyczną skoliozę młodzieńczą) lub dwóch innych znanych schorzeń, porażenia Erba i deformacji Sprengela, z których oba są bardzo rzadkie. W H1 powyższe stawki dają szacunkowe prawdopodobieństwo 0.,90 obserwując skoliozę podano opis wyglądu fizycznego Ryszarda III (=wskaźnik skoliozy podzielony przez sumę trzech wskaźników), który pomnożyliśmy przez 0,95, aby umożliwić możliwość, że zarejestrowany opis był nieprawidłowy. To prowadzi do LR 212, zapewniając umiarkowanie silne wsparcie dla H1. Obecność obrażeń przedśmiertnych dała LR 42, a więc umiarkowane wsparcie dla H1. Chromosom Y szkieletu 1 nie pasował do genealogicznie ustalonych patrylinealnych krewnych Ryszarda III., Może to być wyjaśnione fałszywym ojcostwem w jednym lub więcej z 19 domniemanych powiązań między ojcem a synem Ryszarda III i Henry ' ego Somerseta, piątego księcia Beaufort. Wyniki chromosomu Y wskazują również na jeszcze jedno fałszywe Zdarzenie ojcostwa pomiędzy Henry ' m Somersetem a jego pięcioma współczesnymi, domniemanymi potomkami patrylinearnymi. Aby zachować ostrożność, wybraliśmy opublikowany wskaźnik fałszywego ojcostwa,który był (1) niższy niż jakikolwiek inny, uznany przez nas wskaźnik 17, 47 i (2) na podstawie danych genealogicznych18., Do tego dodajemy Zdarzenie fałszywego ojcostwa w 19 domniemanych powiązaniach ojciec-syn pomiędzy Henry ' M Somersetem a pięcioma współczesnymi mężczyznami. Daje to prawdopodobieństwo co najmniej jednego fałszywego zdarzenia ojcostwa w 19 domniemanych relacji ojciec–syn między Ryszardem III i Henry Somerset 0,16. Biorąc pod uwagę, że zdarzenie fałszywego ojcostwa musiało mieć miejsce w przypadku H1, częstość populacji haplotypu Y szkieletu 1 jest taka sama w przypadku H1 i H2 i anuluje się w obliczeniach LR. Zatem LR wynosi 0,16, co stanowi Ograniczony dowód na obecność H1.,

sekwencje mtDNA szkieletu 1 i domniemanej 19-mejozowej matrylinearnej krewnej Ryszarda III, Michaela Ibsena, pasują całkowicie. (8994) Ta ostatnia obserwacja jest równie prawdopodobna pod H1 i H2, biorąc pod uwagę obserwowaną sekwencję Michaela Ibsena, a więc anuluje się w LR. W związku z tym do obserwacji sekwencji współdzielonej przez Michaela Ibsena i szkielet 1 potrzebna jest jedynie szansa.

aby uzyskać prawdopodobieństwo pod H1, wymagamy szybkości mutacji mtDNA, a w tym przypadku wysokie szacunki są konserwatywne. Parsons et al.,28 zgłoś 10 mutacji w regionie kontrolnym w 327 pokoleniach na podstawie danych genealogicznych. Ponieważ sugeruje to wyższy wskaźnik niż inne opublikowane szacunki i opiera się na danych genealogicznych, użyliśmy go do uzyskania prawdopodobieństwa 0,52 dla braku mutacji w 19 mejozach.

dla prawdopodobieństwa pod H2 wymagamy ułamka populacji haplotypu szkielet 1. Chociaż otrzymaliśmy pełną sekwencję genomu mtDNA ze szkieletu 1, zidentyfikowaliśmy niewiele opublikowanych danych porównawczych całego genomu z Anglii., Tak więc do analizy statystycznej wykorzystaliśmy tylko regiony kontrolne mtDNA między pozycjami 16,093 i 16,320 oraz między 00073 i 00188, dla których uzyskaliśmy odpowiednie dane porównawcze w języku angielskim z aktualizacji Röhl et al.30, uzupełnione sekwencjami mtDNA dostarczanymi przez Roots for Real (Genetic Ancestor Ltd., Clare, Suffolk, UK). Używanie tylko tych krótkich odcinków regionu kontrolnego pod H2 jest konserwatywne, ponieważ ułamek populacji obserwowanych sekwencji regionu kontrolnego nie może być mniejszy niż w pełnym genomie mtDNA., Odpowiednia populacja referencyjna liczy ponad 500 lat w przeszłości, ale ze względu na dużą liczebność populacji w badanym okresie, spodziewamy się, że częstość występowania populacji niewiele się zmieniła w ciągu ostatnich pięciu stuleci. W bazie danych z 1823 roku znaleźliśmy częstość występowania haplotypu szkieletu 1 na 0, do której dodajemy jeden przypadek zaobserwowany u Michaela Ibsena. Podejście to jest, ponownie, konserwatywne, ponieważ Michael został pobrany ze względu na jego znane genealogiczne pokrewieństwo z Ryszardem III. prowadzi to do LR 478 reprezentujących umiarkowanie silne dowody na H1.,

zauważyliśmy również, że w bazie danych 26 127 haplotypów europejskiego regionu kontroli mitochondrialnej nie ma dopasowań (www.empop.org)29. nie opieramy się na tej bazie danych, ponieważ jest ona ogólnoeuropejska, a nie specyficzna dla Anglii i ze względu na kwestie ustalenia, ale sugeruje, że szkielet 1 haplotyp może być znacznie rzadszy niż można wywnioskować z naszej mniejszej Angielskiej bazy danych. Zauważamy również, że mobilność kobiet wśród szlachty Europejskiej prawdopodobnie była znacznie wyższa niż w przypadku ogółu ludności, ze względu na praktyki małżeńskie związane z tworzeniem sojuszu politycznego., Takie praktyki dałyby pewne uzasadnienie dla korzystania z europejskiej bazy danych mtDNA, a więc dla uznania haplotypu znalezionego w szkielecie 1 i Michaela Ibsena za niezwykle rzadki. W dodatkowej tabeli 10 pokazujemy kilka przykładowych wyników przy użyciu europejskiej bazy danych w celu wykazania implikacji ustalenia, że szkielet 1 haplotypu jest tak rzadki, jak sugeruje ta baza danych.

LRs dla różnych kombinacji dowodów i dwóch prawdopodobieństw tylnych przedstawiono w dodatkowej tabeli 10., Wykorzystując wszystkie dowody, poparcie dla H1 jest niezwykle silne z LR wynoszącym 6,7 miliona, więc nasz sceptyk doprowadziłby do wniosku, że prawdopodobieństwo, że szkielet 1 nie jest Ryszardem III jest mniejsze niż 1 na 100 000, podczas gdy dla osób zajmujących pozycję początkową 1 na 2 Prawdopodobieństwo to jest znacznie mniejsze niż 1 na milion. Biorąc pod uwagę konserwatywne założenia leżące u podstaw naszych obliczeń opisanych powyżej, uważamy to za ustalenie prawdy H1 ponad wszelką wątpliwość.