szczepy bakterii i plazmidy

w tym badaniu wykorzystano następujące szczepy E. coli: DH5a, BL21(DE3) (Novagen), CLM24 i Origami2(DE3) gmd::kan δwaal. DH5a był używany do klonowania plazmidów i oczyszczania., BL21 (DE3) został użyty do ekspresji i oczyszczania białka akceptora scfv13-R4DQNAT, które było stosowane we wszystkich reakcjach glikozylacji in vitro. CLM24 jest glikooptymalizowaną pochodną W3110, która niesie delecję w genie kodującym ligazę WaaL, ułatwiając w ten sposób akumulację wstępnie zmontowanych glikanów na Und-PP36. CLM24 został użyty do oczyszczania enzymu CjOST, ekstrakcji rozpuszczalnikiem organicznym wszystkich glikanów bakteryjnych LLO sbearing oraz szczepu źródłowego do przygotowania ekstraktów z selektywnie wzbogaconymi składnikami glikozylacji i bez nich., Origami2 (DE3) gmd:: kan ΔwaaL został użyty do produkcji LLOs zawierających Man3GlcNAc2 i został wygenerowany przez sekwencyjną mutację z transdukcją fagową P1vir przy użyciu odpowiednich szczepów z kolekcji Keio 62 jako dawców, które zostały uzyskane z coli Genetic Stock Center (CGSC). W skrócie, lizat dawcy został wytworzony ze szczepu JW3597-1 (ΔrfaL734::kan), a powstały FAG został użyty do zainfekowania komórek docelowych Origami2 (DE3)., Po poszyciu transformatorów na płytach LB zawierających kanamycynę (Kan) wybrano udane przetworniki, a ich kasety rezystancyjne kan zostały usunięte przez transformację wrażliwym na temperaturę plazmidem pCP2063. Powstały szczep, Origami2 (DE3) ΔwaaL, został następnie użyty do późniejszej delecji genu gmd zgodnie z identyczną strategią, ale przy użyciu szczepu dawcy JW2038-1 (Δgmd751::kan).

wszystkie plazmidy użyte w badaniu zostały wymienione w dodatkowej Tabeli 2. Plazmidy skonstruowane w tym badaniu zostały wykonane przy użyciu standardowych protokołów klonowania i potwierdzone sekwencjonowaniem DNA., Były to m.in. Plazmid pJL1-scFv13-R4DQNAT został wygenerowany przez pierwszy PCR wzmacniający gen kodujący scFv13 – R4DQNAT z pET28a-scFv13-R4 (N34L, N77L)DQNAT, gdzie wprowadzono mutacje N34L i N77L w celu wyeliminowania domniemanych wewnętrznych miejsc glikozylacji w scFv13-r452. Otrzymany produkt PCR został następnie ligowany między miejscami ograniczenia Ncoi i SalI w plazmidzie pJL1, wektorze opartym na pET stosowanym dla CFPS49. Plazmid pJL1-sfGFP217-dqnat został wygenerowany przez ligowanie komercyjnie syntetyzowanego fragmentu DNA kodującego sfGFP217-DQNAT (Integrated DNA Technologies) do pJL1., Ta wersja sfGFP zawiera dodatkową wstawkę GT po K214, która rozszerza tę elastyczną pętlę przed ostatecznym arkuszem beta 64. W tę elastyczną pętlę, zaraz po T216, zaszczepiliśmy sekwencję 21 aminokwasów zawierającą witrynę glikozylacji C. jejuni AcrA N12334, ale z optymalnym sekkoniem DQNAT w miejsce natywnego sekkonu AcrA. Podobne procedury zostały użyte do wygenerowania plazmidów pJL1-sfGFP217-AQNAT, pjl1-hEPO22-DQNAT-26, pjl1-hEPO36-dqnat-40 i pjl1-hEPO81-DQNAT-85., W przypadku pjl1-hEPO22-DQNAT-26 gen dla dojrzałego ludzkiego EPO został zaprojektowany w taki sposób, że rodzimy sekon w N24 został zmieniony z 22-AENIT-26 na optymalny sekon bakteryjny, DQNAT. Przeprowadzono identyczne strategie klonowania, aby oddzielnie wprowadzić optymalne motywy DQNAT w miejsce rodzimych sekwonów hEPO 36-NENIT-40 I 81-LVNSS-85. Rekombinowana ekspresja Glik-adaptera E. coli O9 (Man3GlcNAc) na Und-PP została osiągnięta przez klonowanie genów kodujących enzymy mannozylotransferazy wbdb i wbdc pochodzące z E., coli ATCC31616 do montażu glikanu oraz RfbK i RfbM, również pochodzące z E. coli ATCC31616 do zwiększenia puli dostępnej GDP-mannozy, w E. coli MG1655. Plazmid pConYCGmCB został skonstruowany przez izotermiczny zespół Gibsona i koduje sztuczny operon składający się z: (i) glikozylotransferazy drożdżowej Alg13, Alg14, Alg1 i Alg2 dla biosyntezy glikanu man3glcnac2 I (ii) enzymów fosfomannomutazy E. coli (ManB) i mannozy-1-fosforanowej guanylotransferazy (ManC), które razem zwiększają dostępność substratów GDP-mannozy dla enzymów Alg1 i Alg2.,

ekspresja i oczyszczanie białka

Oczyszczanie CjPglB przeprowadzono zgodnie z wcześniej opisanym protokołem34. Krótko mówiąc, pojedyncza Kolonia E. coli CLM24 z plazmidem pSN1865 została wyhodowana przez noc w temperaturze 37 °C w 50 mL Luria-Bertani (LB; 10 g L−1 tryptonu, 5 g L−1 ekstraktu drożdżowego, 5 g L−1 NaCl, pH 7,2) z dodatkiem ampicyliny (Amp) i 0,2% (w/v%) D-glukozy. 1 L świeżego bulionu (TB; 12 g L−1 tryptonu, 24 G L-1 ekstraktu drożdżowego, 0,4% (v/v%) glicerolu, 10% (V/v%) 0,17 m KH2PO4/0.,72 M bufor fosforanowy K2HPO4), uzupełniony Amp i uprawiany aż absorbancja przy 600 nm (Abs600) osiągnie wartość ~0,7. Temperaturę inkubacji dostosowano do 16 °C, po czym ekspresję białka indukowano przez dodanie l-arabinozy do końcowego stężenia 0,02% (w/v%). Ekspresję białka można było kontynuować przez 20 godzin w temperaturze 16 °C. komórki były zbierane przez odwirowanie, a następnie przerywane za pomocą homogenizatora (Avestin C5 EmulsiFlex). Lizat odwirowywano w celu usunięcia resztek komórek, a supernatant ultracentryfugowano (100 000×g) przez 2 godziny w temperaturze 4 °C., Otrzymany granulat zawierający frakcję membranową został całkowicie wymieszany z homogenizatorem tkankowym Potter-Elvehjem w buforze zawierającym 50 mm HEPES, 250 mM NaCl, 10% (v/V%) glicerolu i 1% (w/v%) N-dodecylo-β-D-maltozydu (DDM) przy pH 7,5. Zawiesinę inkubowano w temperaturze pokojowej przez 1 h, aby ułatwić rozpuszczanie cjpglb w detergencie z rodzimych lipidów E. coli, które zostały usunięte przez późniejszą ultracentryfugację (100 000×g) przez 1 h w temperaturze 4 °C., Supernatant zawierający rozpuszczony DDM CjPglB został oczyszczony przy użyciu żywicy Ni-Nta (Thermo) zgodnie ze specyfikacją producenta, z tym wyjątkiem, że wszystkie bufory zostały uzupełnione o 1% (w/v%) DDM. Frakcję elucyjną z oczyszczania Ni-NTA poddano następnie chromatografii z wykluczeniem wielkości (sec) za pomocą systemu ÄKTA Explorer Fplc (GE Healthcare) z kolumną Superdex 200 10/300 gl. Oczyszczone białko przechowywano w końcowym stężeniu 1-2 mg mL−1 w buforze magazynowym OST (50 mm HEPES, 100 mM NaCl, 5% (v/V%) glicerolu, 0,01% (w/v%) DDM, pH 7,5) w temperaturze 4 °C., Stężenie glicerolu w próbce dostosowano do 20% (v/V%) w celu długotrwałego przechowywania w temperaturze -80 °C.

Oczyszczanie białka akceptora scFv13-R4DQNAT przeprowadzono zgodnie z opisem poprzednio 52. Krótko mówiąc, szczep E. coli BL21(DE3) przenoszący plazmid pET28a-scFv13-R4 (N34L, n77l)dqnat hodowano w 1 L TB dostarczanego z kanamycyną. Hodowlę inkubowano w temperaturze 37 °C, aż Abs600 osiągnął ~0,7, w którym to momencie indukowano ekspresję białka przez dodanie izopropylu β-d-1-tiogalaktopiranozydu (IPTG) do końcowego stężenia 0,1 mM. ekspresję białka można było kontynuować przez 20 h w temperaturze 25 °C., / Align = „center” bgcolor = „# e0ffe0 ” / cesarz chin / / align = center / Białko scFv13-R4DQNAT zostało oczyszczone przy użyciu żywicy Ni-NTA, a następnie SEC zgodnie z protokołami producenta. Białko przechowywano w końcowym stężeniu 1-2 mg mL-1 w buforze magazynowym (50 mm HEPES, 250 mM NaCl, 1 mm EDTA, pH 7,5) w temperaturze 4 °C.

ekstrakcja LLOs

protokół ekstrakcji rozpuszczalnikiem organicznym LLOs z błon E. coli został zaadaptowany na podstawie wcześniej opisanego protokołu 34,66., W większości przypadków pojedyncza Kolonia szczepu CLM24 z plazmidem do biosyntezy glikanu docelowego (dodatkowa Tabela 2) była uprawiana przez noc w pożywce LB. Wyjątkami były LLOs z N-glycanem W. succinogenes (WsLLOs), które zostały wyprodukowane przy użyciu komórek DH5a z fosmidem pEpiFOS-5pgl5(uprzejmie dostarczone przez Dr. Markus Aebi) i LLO Sbearing Man3GlcNAc2, które zostały wyprodukowane przy użyciu Origami2 (DE3) GMD::kan ΔwaaL komórki z plazmidem pConYCGmCB. W nocy komórki subkultura do 1 L TB uzupełnione odpowiednim antybiotykiem i hodowane, aż Abs600 osiągnie ~0,7., Temperatura inkubacji została dostosowana do 30 °C dla biosyntezy wszystkich glikanów z wyjątkiem Man3GlcNAc2, która została dostosowana do 16 °C. Dla plazmidu pMW07-pglΔB, ekspresja białka została indukowana l-arabinozą w końcowym stężeniu 0,2% (w/v%), podczas gdy dla fosmidu pEpiFOS-5pgl5 indukcja była z izopropylu β-D-1-tiogalaktopiranozydu (IPTG) w końcowym stężeniu 1 mM. plazmidy angażowały konstytutywne promotory, a zatem nie wymagały induktorów chemicznych. Po 16 godzinach zebrano komórki przez odwirowanie, a granulki komórkowe liofilizowano do całkowitego wysuszenia w temperaturze -70 °C., W celu ekstrakcji CjLLOs, natywnego i zaprojektowanego ClLLOs, E. coli O9 primer-adaptor LLOs i WsLLOs, liofilizaty zawieszono w stosunku objętościowym 10:20:3 w roztworze Chl3: CH3OH: H2O i inkubowano w temperaturze pokojowej przez 15 minut, aby ułatwić ekstrakcję Llos. Do ekstrakcji GLIKANU MAN3GLCNAC2 liofilizat zawieszano kolejno w roztworze 10: 20 (v/V%) CH3OH, wodzie i 10:20:3 CH3OH:H2o z 15-minutową inkubacją w temperaturze pokojowej pomiędzy każdym etapem., W każdym przypadku końcową zawiesinę odwirowywano (4000×g) przez 15 minut, po czym warstwę organiczną (warstwę dolną) zebrano i osuszono koncentratorem próżniowym, a następnie liofilizowano. Liofilizaty zawierające aktywne Llo wymieszano w buforze glikozylacji wolnej od komórek (10 mm HEPES, pH 7,5, 10 mm MnCl2 i 0,1% (w/v%) DDM) i przechowywano w temperaturze 4 °C.

preparat surowych ekstraktów S30

szczepy źródłowe clm24 wyhodowano w 2×YTPG (10 g L-1 ekstraktu drożdżowego, 16 g L−1 tryptonu, 5 g L−1 tryptonu, 5 g L−1 TRYPTONU). NaCl, 7 g L−1 K2HPO4, 3 G L−1 KH2PO4, 18 g l−1 glukozy, pH 7,2), aż Abs600 osiągnie ~3., Do wytworzenia ekstraktu wzbogaconego o OST, jako szczep źródłowy użyto CLM24 z plazmidem pSF-CjPglB, pSF-CcPglB, pSF-DdPglB, pSF-Dgpglb lub PSF-DvPglB52. Do wytworzenia ekstraktu wzbogaconego o LLO, jako szczep źródłowy użyto CLM24 z plazmidem pMW07-pglΔB. Do wytworzenia jednopłytkowego ekstraktu zawierającego zarówno OST, jak i LLOs, jako szczep źródłowy użyto CLM24 z pMW07-pglΔB i pSF-CjOST. W razie potrzeby indukowano ekspresję składników glikozylacyjnych za pomocą l-arabinozy w końcowym stężeniu 0,02% (w / v%)., Po indukcji ekspresja białka mogła przebiegać w temperaturze 30 °C do gęstości OD600 ~3, w którym to momencie komórki były zbierane przez odwirowanie (5000×g) w temperaturze 4 °C przez 15 minut. Wszystkie kolejne etapy były wykonywane w temperaturze 4 °C, O ile nie zaznaczono inaczej. Granulowane komórki przemyto trzykrotnie w buforze S30 (10 mM octan tris, 14 mM octan magnezu, 60 mM octan potasu, pH 8,2). Po ostatnim myciu komórki granulowano w temperaturze 7000×g przez 10 minut i zamrażano błyskawicznie na ciekłym azocie. W celu wytworzenia lizatu komórki rozmrożono i ponownie zmieszano do jednorodności w 1 mL buforu S30 na 1 g mokrej masy komórek., Komórki zostały zakłócone za pomocą homogenizatora wysokociśnieniowego Avestin EmulsiFlex-B15 przy 20 000-25 000 psi z jednym przejściem. Lizat następnie odwirowywano dwukrotnie w temperaturze 30 000×g przez 30 min w celu usunięcia resztek komórek. Supernatant został przeniesiony do nowego naczynia i inkubowany przy 250 obr. / min w temperaturze 37 °C przez 60 min w celu degradacji endogennych transkryptów mRNA i zakłócenia istniejących kompleksów polisomów w lizacie. Po odwirowaniu (15 000×g) przez 15 min w temperaturze 4 °C zebrano supernatant, podzielono go, zamrożono błyskawicznie w ciekłym azocie i przechowywano w temperaturze -80 °C., Ekstrakt S30 był aktywny przez około trzy cykle zamrażania i rozmrażania i zawierał ~40 g białka całkowitego L-1 mierzonego metodą Bradforda.

synteza glikoproteiny wolnej od komórek

w przypadku glikozylacji in vitro oczyszczonego białka akceptora przeprowadzono reakcje w objętości 50 µL zawierającej 3 µg scFv13-R4DQNAT, 2 µg oczyszczonego CjPglB i 5 µg wyekstrahowanego LLOs (w przypadku Man3glcnac2 LLOs, zastosowano 20 µg) w buforze glikozylacji in vitro (10 mm HEPES, pH 7,5, 10 mM MnCl2, oraz 0,1% (w / V%) DDM). Mieszaninę reakcyjną inkubowano w temperaturze 30 ° C przez 16 godzin., Dla surowej ekspresji glikoprotein na bazie ekstraktu wprowadzono schemat dwufazowy. W pierwszej fazie przeprowadzono syntezę białek za pomocą zmodyfikowanego systemu PANOx-SP67. W szczególności, 1,5 mL probówek mikrokentryfugowych zostało naładowanych reakcjami 15-µL zawierającymi 200 ng plazmidu DNA, 30% (v/V%) ekstraktu S30 i następujące: 12 mM glutaminian magnezu, 10 mM glutaminian amonu, 130 mM glutaminian potasu, 1,2 mM adenozynotrójfosforan (ATP), 0,85 mM guanozynotrójfosforan (GTP), 0,85 mM trifosforan urydyny (UTP), 0,85 mM trifosforan cytydyny (CTP), 0, 034 mg ml−1 kwasu folinowego, 0.,171 mg mL-1 E. coli tRNA (Roche), 2 mm po 20 aminokwasów, 30 mM fosfoenolopirogronianu (PEP, Roche), 0,4 mM dinukleotydu nikotynamidowo-adeninowego (NAD), 0,27 mM koenzymu A (CoA), 4 mM kwasu szczawiowego, 1 mM putrescyny, 1,5 mM spermidyny i 57 mm HEPES. Dla scFv13-R4DQNAT, hEPO22-dqnat-26, hEPO36-DQNAT-40 i hEPO81-dqnat85 faza ta została przeprowadzona w 30 °C przez 4 godziny w Warunkach utleniania, podczas gdy dla sfGFP217-DQNAT i sfGFP217-aqnat faza ta została przeprowadzona w 30 °C przez 5 minut w Warunkach redukcji., W Warunkach utleniających ekstrakt wstępnie kondycjonowano jodoacetamidem 750 µM w ciemności w temperaturze pokojowej przez 30 min, a mieszankę reakcyjną dostarczano glutationem 200 mM w stosunku 3:1 między formami utlenionymi i zredukowanymi. Aktywne plony sfGFP z reakcji wolnych od komórek oznaczono ilościowo, mierząc fluorescencję w lizacie i przekształcając w stężenie za pomocą standardowej krzywej, jak opisano wcześniej39. W drugiej fazie glikozylację białek rozpoczęto przez dodanie MnCl2 i DDM przy końcowym stężeniu 10 mM i 0.,W razie potrzeby reakcje uzupełniano 2 µg oczyszczonego CjPglB (tj. dla CFGpS z ekstraktami wzbogaconymi LLO) lub 5 µg ekstrahowanego rozpuszczalnikiem CjLLOs (tj. dla CFGpS z ekstraktami wzbogaconymi OST). Wszystkie reakcje zostały zatrzymane przez dodanie bufora próbki Laemmli zawierającego 5% ßME, po czym próbki gotowano w temperaturze 100 °C przez 15 minut i analizowano za pomocą SDS-PAGE i western blotting.

Analiza Western blot

próbki zawierające 0,5 µg białka akceptora zostały załadowane do żeli SDS-PAGE., Po separacji elektroforetycznej białka zostały przeniesione z żeli na membrany Difluorku poliwinylidenu Immobilon-P (PVDF) (0,45 µm) zgodnie z protokołem producenta. Membrany przemyto dwukrotnie buforem TBS (80 g L−1 NaCl, 20 g L−1 KCl i 30 g L-1 tris−base), a następnie inkubowano przez 1 h w roztworze blokującym (50 g L-1 mleka beztłuszczowego w TBST (TBS dostarczany z 0,05% (v/v%) Tween-20)). Po zablokowaniu membrany przemyto 4 razy TBST z 10-minutową inkubacją między każdym myciem., Pierwsza membrana została zbadana z przeciwciałem poliklonalnym 6xHis (Abcam, ab137839, 1:7500), który rozpoznaje znaczniki epitopu heksahystydyny, podczas gdy druga membrana replikowana została zbadana z jednym z następujących: hR6 (1:10 000) surowicy od królika, który rozpoznaje natywny C. jejuni i C. lari glycan, a także inżynierii C. lari glycan lub cona-HRP (Sigma, L6397, 1:2500), który rozpoznaje man3glcnac i man3glcnac2. Sondowanie membran przeprowadzono przez co najmniej 1 h z wytrząsaniem w temperaturze pokojowej, po czym membrany przemyto TBST w taki sam sposób, jak opisano powyżej., W celu rozwoju, membrany były krótko inkubowane w temperaturze pokojowej z zachodnim substratem ECL (BioRad) i obrazowane za pomocą systemu ChemiDocTM XRS+. Enzymy OST wzbogacone w ekstrakty zostały wykryte przez identyczną procedurę SDS-PAGE, a następnie przez Analizę Western blot z przeciwciałem poliklonalnym specyficznym dla znacznika EPITOPE FLAG (Abcam, ab49763, 1:7500). Glycanowy Składnik LLOs wzbogacony w ekstrakty został wykryty poprzez bezpośrednie wykrycie 10 µL ekstraktów na membranach nitrocelulozowych, a następnie wykrycie w surowicy hR6. Nieobrobione obrazy immunoblot pokazano na dodatkowym rys. 8.,

analiza MS

około 2 µg białka scFv13-R4DQNAT w roztworze denaturowano 6 M mocznika, zmniejszono 10 mM DTT, inkubowano w temperaturze 34 °C przez 1 h, następnie alkilowano 58 mM jodoacetamidem przez 45 min W ciemności w temperaturze pokojowej i gaszono końcowym 36 mM DTT. Następnie roztwór rozcieńczono 50 mM wodorowęglanem amonu (pH 8,0) do końcowego stężenia buforowego 1 M mocznika przed trawieniem trypsyny. Próbka była trawiona 0,2 µg trypsyny przez 18 h w temperaturze 37 °C. trawienie zostało zatrzymane przez dodanie TFA do końcowego pH 2,2-2,5., Następnie próbki odsolono wkładem SOLA HRP SPE (Thermofisher Scientific). Wkłady kondycjonowano 1 × 0,5 mL 90% metanolu, 0,1% kwasu trifluorooctowego (TFA) i równoważono 2 × 0,5 mL 0,1% (v/V%) TFA. Próbki rozcieńczono 1: 1 z 0,2% (v/v%) TFA i powoli przepuszczano przez wkłady. Po umyciu 2 × 0,5 mL roztworu równowagi, peptydy eluowano 1 × 0,5 mL 50% (v/V%) acetonitrylu (ACN), 0,1% (V/V%) TFA i suszono w wirówce próżniowej.,

analizę nanoLC–MS / MS przeprowadzono przy użyciu UltiMate3000 rslcnano (Dionex) sprzężonego ze spektrometrem masowym Orbitrap Fusion (Thermofisher Scientific) wyposażonym w źródło jonów nanospray Flex. Każda próbka została odtworzona w 22 µL 0,5% (w/V%) FA, a 10 µL załadowano na kolumnę pułapkową Acclaim PepMap 100 C18 (5 µm, 100 µm × 20 mm, 100 Å, ThermoFisher Scientific) z łącznikami nanoViper w temperaturze 20 µL min-1 0,5% Fa do odsalania on-line., Po 2 minutach zawór przełącza się, aby umożliwić oddzielenie peptydów na kolumnie Acclaim PepMap C18 nano (3 µm, 75 µm × 25 cm, ThermoFisher Scientific), w 90-minutowym gradiencie od 5 do 23% do 35% B przy 300 nL min−1 (odpowiednio 3 do 73 do 93 min), a następnie 9-minutowe rozbijanie do 90% B, 9-minutowe trzymanie przy 90% B i szybkie przełączanie do 5% B w 1 min. Kolumna została ponownie zrównana z 5% B przez 20 min przed kolejnym biegiem. Fuzja Orbitrap działała w trybie jonów dodatnich z napięciem nanospraya ustawionym na 1,7 kV i temperaturą źródła na poziomie 275 °C., Przed analizą przeprowadzono zewnętrzną kalibrację analizatorów masy FT, IT i quadrupole. Po badaniu Orbitrap full ms survey scan (m / z 400-1800) przeprowadzono 3 zależne od danych dane o wyższej dysocjacji kolizji ETD (HCD-pd-ETD) MS/MS w poszukiwaniu peptydów prekursorowych z 2-7 ładunkami powyżej progu liczby jonów 50,000 z znormalizowaną energią zderzenia 32%., Skany pomiarowe ms uzyskiwano z mocą rozdzielczą 120 000 (FWHM przy m/z 200), z automatyczną kontrolą Gin (AGC) = 2E5 i maksymalnym czasem wtrysku (Max IT) = 50 ms, a skany HCD MS/MS z rozdzielczością 30 000 przy AGC = 5E4, Max IT = 60 ms i z okienkiem izolacji Q (M/z) przy 3 dla zakresu mas m/z 105-2000. Dynamiczne parametry wyłączenia ustawiono na 1 w ciągu 60 s czasu wyłączenia z szerokością masy wyłączenia ±10 ppm. Lista wyzwalaczy jonowych produktu składała się z pików o wartości 204,0867 Da (Jon oksoniowy HexNAc), 138,0545 Da (fragment Heksnac) i 366,1396 Da (jony oksoniowe HexHexNAc)., W przypadku wykrycia jednego z jonów produktu HCD z listy, uruchamiane były dwa zależne od ładunku skany ETD MS/MS (EThcD) z aktywacją uzupełniającą HCD (SA) na tym samym Jonie prekursorze i zbierane w liniowym pułapku jonowym. W przypadku prekursorów z podwójnym ładowaniem czas reakcji ETD ustalony na 150 ms i energię SA został ustalony na 30%, podczas gdy te same parametry na 125 ms i 20%, odpowiednio, zostały wykorzystane w przypadku prekursorów z wyższym ładowaniem. Dla obu skanów wyzwalanych jonami, cel odczynnika fluorantenowego ETD został ustawiony na 2e5, cel AGC na 1E4, Max to na 105 ms i okno izolacji na 3. Wszystkie dane zostały uzyskane przy użyciu Xcalibur 3.,0 oprogramowanie operacyjne i aplikacja Orbitrap Fusion Tune V. 2.1 (Thermofisher Scientific).

wszystkie surowe widma MS I MS/MS z każdej próbki zostały przeszukiwane za pomocą technologii V. 2.8.2 (Protein Metrics) przy użyciu bazy danych białek E coli z dodaną sekwencją docelową białka scFv13-R4DQNAT. Parametry wyszukiwania peptydów były następujące: dwa pominięte rozszczepienie dla pełnego trawienia trypsyny ze stałą modyfikacją karbamidometylową cysteiny, zmienne modyfikacje utleniania metioniny i deamidacja na resztach asparaginy / glutaminy., Tolerancja masy peptydów wynosiła 10 ppm, a wartości tolerancji masy fragmentów dla widm HCD i EThcD wynosiły odpowiednio 0,05 i 0,6 Da. Zarówno Maksymalna liczba wspólnych, jak i rzadkich modyfikacji została ustalona na dwa. Wyszukiwanie glikanów zostało przeprowadzone na podstawie listy 309 ssaków N-linkowanych glikanów w oprogramowaniu Byonic. Zidentyfikowane peptydy były filtrowane dla maksymalnie 2% FDR. Program wyeksportował wyniki wyszukiwania do arkusza kalkulacyjnego.

aktywność fluorescencyjna GFP

aktywność sfGFP wolnego od komórek oznaczono za pomocą analizy fluorescencji w lizacie, jak opisano wcześniej39., Krótko, 2 µL wolnej od komórek syntetyzowanej glikozylowanej reakcji sfGFP rozcieńczono do 48 µL nanopure wody. Roztwór został następnie umieszczony w czarnej tabliczce Probierczej Costar 96-well (Corning). Fale wzbudzenia i emisji dla fluorescencji sfGFP wynosiły odpowiednio 485 i 528 nm.

enzym-linked immunosorbent analysis (ELISA)

Costar 96-well ELISA płytki (Corning) zostały pokryte przez noc w temperaturze 4 °C 50 µl 1 mg mL−1 E. coli β-gal (Sigma-Aldrich) w 0,05 M buforze węglanu sodu (pH 9,6)., Po zablokowaniu 5% (w/v%) albuminy surowicy bydlęcej (BSA) w PBS przez 3 h w temperaturze pokojowej, płyty przemyto czterokrotnie buforem Pbst (PBS, 0,05% (v/v%) Tween-20, 0,3% (w/v%) BSA) i inkubowano seryjnie rozcieńczonymi próbkami oczyszczonymi scFv13-R4 lub rozpuszczalnymi frakcjami lizatów CFGpS przez 1 h w temperaturze pokojowej. Próbki oznaczono ilościowo za pomocą testu Bradforda i na płytkę naniesiono równoważną ilość białka całkowitego. Po czterokrotnym umyciu tym samym buforem do każdej studni dodano przeciwciało poliklonalne anty-6×-his-HRP sprzężone z królikiem (Abcam) w 3% PBST przez 1 godzinę., Płyty zostały umyte i opracowane przy użyciu standardowych protokołów.

test proliferacji komórek in vitro

ludzkie erytroleukemia komórki TF-1 (Sigma), które wymagają czynnika stymulującego tworzenie kolonii granulocytów i makrofagów (GM–CSF), interleukiny 3 (IL-3) lub hEPO do wzrostu i przeżycia. Komórki utrzymywano w pożywce RPMI-1640 z dodatkiem 10% FBS, 50 U ml−1 penicyliny, 50 mg mL−1 streptomycyny, 2 mM glutaminy i 2 ng mL−1 GM-CSF w temperaturze 37 °C w nawilżonej atmosferze zawierającej 5% CO2., Po 16-godzinnej inkubacji w mediach RPMI-1640 bez GM-CSF, komórki były liczone, pobierane i ponownie zawieszane w świeżych mediach. 5 × 103 komórki TF-1 na studnię zaszczepiono w 96-studziennej płytce testowej, a normy EPO lub Próbki dodano do końcowych pożądanych stężeń do każdej studni. Komórki inkubowano przez 6 godzin w wilgotnym inkubatorze przed dodaniem alamarBlue®. Po 12 godzinach sygnał fluorescencji mierzony był przy długości fali wzbudzenia/emisji 560 nm/590 nm.,

dostępność danych

wszystkie dane wygenerowane podczas badania są zawarte w tym artykule i jego dodatkowych plikach informacyjnych i są dostępne od autorów na uzasadnione żądanie.