laboratóriumi helyek

a modern rokonokat érintő összes DNS-munkát a leicesteri Egyetemen végezték. A hímivarú rokonokat Promega PowerPlex Y23-mal, valamint a Leicesterben a fő európai Y-haplocsoportokat meghatározó SNP-kkel gépelték be, a gépelés egy részét az Université Paul Sabatier megerősítette. A leicesteri Egyetemen a teljes mitokondriális genomhoz szekvenálták a Női Vonalú rokonokat., A DNS-t a York-i Egyetem és a toulouse-i Paul Sabatier Egyetem ősi fogaiból és csontjaiból nyerték ki. Könyvtári előkészítést és céldúsítást végeztek a York-i Egyetemen. Egyvégű 100-bp szekvenálás egy HiSeq 2000 (Illumina, CA, USA) végeztünk a Koppenhágai szekvenálás létesítmény. Mind a modern, mind az ősi DNS célzott szekvenálását a PlaGe (Genopole, Toulouse, Franciaország) genomikai technikai platformon, valamint a Leicesteri Egyetem fehérje Nukleinsavkémiai laboratóriumában is elvégezték. Az alábbiakban az alkalmazott módszerek kondenzált változatát adjuk meg., Minden egyes lépésnél a teljes információ megtalálható a kiegészítő módszerekben. A projekthez végzett kiterjedt genealógiai kutatás részleteit a 2. Kiegészítő megjegyzés tartalmazza.

mintagyűjtemény

a DNS-t Richard III modern rokonainak nyálmintáiból nyerték ki, és minden résztvevőt informált beleegyezéssel toboroztak a Leicesteri Egyetem kutatási Etikai Bizottságának a projekt felülvizsgálatát követően.

az 1.csontvázat feltárták, és tiszta körülmények között vett mintákat37., Mindenki, aki részt vett az ásatásban a Grey Friars telephelyen, a leicesteri tiszta laboratóriumban, valamint a laboratóriumokban és a labor munkájában, mitokondriális volt, a férfiak esetében Y-kromoszómákat gépeltek. A DNS-t nyálmintákból nyerték ki, és minden résztvevőt informált beleegyezéssel vettek fel.

ősi minták DNS-kivonása

a DNS-t fogakból és csont (combcsont) mintákból nyerték ki. Minden eljárást a York-i Egyetem és a toulouse-i Paul Sabatier Egyetem dedikált ősi DNS-laboratóriumaiban végeztek, megfelelő Szennyeződési óvintézkedésekkel., Két extrakciós nyersdarabot is bevontak, és úgy kezeltek, mintha kivonatok lennének az egész folyamat során. A PCR-k és a könyvtári kísérletek további üres vezérlőket is tartalmaztak.

1. csontvázon végzett szex-gépelési vizsgálat

a SRY fragmentum UTX-szel és UTY homológ régiókkal történő együtterősítéséhez PCR-primerekből álló, újonnan tervezett szex-gépelési vizsgálatot alkalmaztak. Ezt a vizsgálatot úgy tervezték, hogy lehetővé tegye a sry, UTX és UTY viszonylag kis méretű töredékeinek együtterősítését a degradált DNA10-et valószínűleg tartalmazó mintákból.,

Mitokondriális kontroll régió elemzése Csontváz 1

Elemzése a hypervariable szegmensek (HV1, HV2, valamint HV3) a mtDNA kontroll régió által végzett erősítő, valamint közvetlenül sorozatot, hogy több egymást átfedő töredékek kezdve 153 250 bp méretű (http://forensic.yonsei.ac.kr/protocol/mtDNA-midi-mini.pdf)22. A toulouse-i laborban a PCR-termékek klónozásához különféle amplikonokat használtak. A szekvenálást a V3 Nagyfesték Terminátor segítségével végezték.,1 ciklusszekvenáló készlet (alkalmazott Biosystems) és kapilláris elektroforézis ABI Prism 3730 genetikai analizátoron (alkalmazott Biosystems) a Leicesteri Egyetem fehérje nukleinsav kémiai laboratóriumában vagy a PlaGe (Genopole) genomikai MŰSZAKI platformon.

Mitokondriális genom/Y-SNP/HIrisplex gépelés a Csontváz 1

a Könyvtárak épültek következő Meyer, valamint Kircher16, azzal a kivétellel, hogy az első szűrés lépés között a tompa végén javítása, az adapter lekötésével volt, amelyet hő inaktiválás a enzymes38,39., Két mikroarrayt terveztek, az egyik az mtDNA dúsítására, a másik pedig a nukleáris SNP dúsítására. A DNS-dúsítást hibridizációs rögzítéssel végezték az Agilent 244K DNS SureSelect microarray (Agilent, Böblingen, Németország) segítségével. A nukleáris elfogáshoz az Y-kromoszóma szondákat úgy tervezték, hogy lefedjék a főbb európai vonalak szempontjából releváns SNP-ket14. További szondákat terveztek a HIrisplex31 markerekre vonatkozó SNP-k lefedésére. Ezt a két szondakészletet (mitokondriális és SNP) külön-külön használták fel az 1 × 244k formátumú két különböző mikroarray minta kitöltésére., Minden egyes mikroarray esetében a rögzítési protokollt Hodges et al.15 a Zhang et al által javasolt módosításokkal.40 és Fortes és Paijmans38. A könyvtárakat equimoláris mennyiségben egyesítették, és az Illumina HiSeq 2000 platform két sávján, 100 SE üzemmódban, a dániai Koppenhágai Egyetem szekvenáló létesítményében szekvenálták.

az egyes könyvtárak nyers olvasását a könyvtárkészítés során használt hat nukleotid index alapján rendeztük. A további elemzésekhez csak az indexhez 100% – os arányban illeszkedő olvasókat választották ki., Olvas rövidebb, mint 25 nukleotidokat dobtak ki a további elemzésből. A levágott szövegeket a 37-es (GRCh37) humán referencia-genomból és az rCRS-ből (NC_012920.1) származó autoszómákra és nemi kromoszómákra térképezték fel a bwa 0.7.5 a-r405 (ref. 41). Minden igazításban a kimeneti bam fájlokat a SAMtools 0.1.19 (ref. 41) A PCR másolatokat később eltávolították. A leképezett leolvasásokat >29 leképezési minőség alapján szűrtük, és a referenciasorozat mentén egyedi pozíciókhoz igazítottuk őket.,

a polimorf pozíciókat Samtoolokkal (SAMtools 0.1.19) és bcftoolokkal azonosították. Végül, vcfutils.pl a variánsok listájának szűrésére a >20 phred-scaled genotípus és a 10-nél nagyobb olvasási mélység alapján került sor. Annak elkerülése érdekében, hogy az ősi DNS-molekulák deaminációs mintája miatt hibás legyen, a VCF kimeneti fájlban jelentett összes polimorf pozíciót szemmel ellenőrizték., A mitokondriális genom esetében a referenciához való illesztést a Tablet42-ben vizualizálták, míg az SNP-ket tartalmazó leolvasások igazítását a referencia kromoszómákhoz az IGV43 segítségével vizualizálták.

SNP gépelés PCR

a rögzítési megközelítés nem biztosított elegendő lefedettséget az összes HIrisPlex és Y-kromoszóma SNP számára, ezért a primereket úgy tervezték, hogy olyan amplikonokat hozzanak létre, amelyek tartalmazzák ezeket az SNP-ket, valamint két SNP-t, amelyek tovább definiálják a G Y-kromoszóma haplocsoportot: M285 (G1) és P287 (G2) (ref. 14). Ezeket a römpler et al-t követő multiplex reakciók részeként erősítették.,44 vagy singleplex reakciók (40 cikluson keresztül, másodlagos amplifikáció nélkül), és az Ion Torrent-en az Ion PGM 200 Xpress Template Kit és a PGM 200 szekvenáló készlet segítségével szekvenálva. A lefedettség növelése érdekében a Singleplex PCR-t és az egyik marker (rs28777) szekvenálását Binladen et al.45

A G haplocsoportot meghatározó SNP-k (M201, M285 és P287) gépelését Toulouse-ban megismételték singleplex PCR-k alkalmazásával. Ezeknek a PCR-termékeknek a szekvenálását Nagyfestékű Terminátor V3 segítségével végezték.,1 ciklus szekvenáló készlet (alkalmazott Biosystems), amelyet kapilláris elektroforézissel analizáltak egy ABI Prism 3730 genetikai analizátoron (alkalmazott Biosystems) a PlaGe (Genopole) genomikai MŰSZAKI platformon.

Y-kromoszóma egy elemzés

Ősi vagy modern minták’ Y-kromoszóma haplotypes kapott segítségével a PowerPlex Y23 Rendszer (Promega), valamint elemzi a kapilláris elektroforézis egy ABI Prism 3730 Genetikai Analizátor (Applied Biosystems) a genomikus műszaki platform PlaGe (Genopole), valamint egy ABI Prism 3130xl Genetikai Analizátor (Applied Biosystems), a University of Leicester., Az 1. csontváz esetében ezt három különálló kivonaton (RM2, LM1 és LM3) hajtották végre két különböző ősi DNS laboratóriumban (York és Toulouse). A modern rokonok számára ezt két különböző kivonaton végezték el két különböző modern laboratóriumban (Leicester és Toulouse).

Y-kromoszómális SNP elemzése modern minták

meghatározása után az Y-haplotípus a modern férfi-line minták, a várható haplocsoport segítségével határoztuk meg Whit Athey haplocsoport predictor (http://www.hprg.com/hapest5/hapest5a/hapest5.htm?order=num)., Az ezeket és a kapcsolódó vonalakat lefedő bináris markereket két multiplexbe gépelték be a SNaPshot minisequencing procedure (Applied Biosystems) és az ABI3130xl Genealy Analyzer (Applied Biosystems) segítségével, majd a Sanger szekvenálással történő megerősítést követően. A Somerset 3− at Hg I (M170+ M223−, M253 -) 14 származékként határozták meg, amelyet a toulouse-i labor is megerősített. Az R1b-U152-re vonatkozóan 1,2,4 és 5 somersetet állapítottak meg. A Somersets 1,2,4-et és 5-öt tesztelték az SNP-knek a klád13 (Z56, M126, Z36, Z192, M160 és L2) szekvenálásával mindkét laborban.,

Modern mtDNA analízis

mindkét mintát kétszer replikálták.

A mintákat Oragén DNS-Gyűjtőkészletekkel (DNS Genotek) és két különböző módszerrel extrahált DNS-vel vettük: a Qiacube vér-és testfolyadék protokoll (200 µl 200 µl elúcióval) és az Oragén protokoll. A kontrollrégió elemzéséhez a mintákat két egymást átfedő alapozó készlet (15973-296 és 16524-614) segítségével kétszer szekvenálták előre és hátra, Nagyfestékű Terminátor V 3.1 (alkalmazott Biosystems) segítségével. Nem találtak különbséget a másolatok vagy a minták között.,

A mintákat a Meyer et al után mindkét extrakcióból a teljes mitokondriális genomra erősítették.26 PCR amplikont szekvenáltak egy Ion Torrent PGM Szekvenátoron egy Ion314 chipen. A könyvtárakat az Ion Xpress Plus gDNA fragmentum Library Preparation kit segítségével készítettük el, míg a sablonkészítést és a szekvenálást az Ion PGM 200 Xpress Template Kit, illetve az Ion PGM 200 szekvenáló készlet segítségével hajtottuk végre. Raw olvasás leképezték vissza a rCRS (NC_012920.1) segítségével TMAP szoftver tartalmazza az Ion Igazítás plugin 3.2.1 (Torrent Suite Software 3.2.,1) Az Ion Torrent szerveren. Duplikált olvasás eltávolítása és variáns hívás végeztünk SAMtools 0.1.19 (ref. 41) és a helyi realizálást a Kit46 Genomelemző eszközzel végezték. A 20-as alapminőséget, az 50-es minőséget és a 30-as lefedettség mélységét szűrték, majd 33 polimorf helyet tartottak meg. Ezeket az oldalakat manuálisan ellenőrizték, és Sanger-szekvenálással mindkét irányban megerősítették, majd kétszer megismételték.,

Szennyezés-ellenőrzési, valamint mennyiségi

a Modern DNS-szennyeződés az ősi továbbra is irányította a következő módszerek:

  1. 1

    Ásatást végeztek alatt tiszta körülmények között (lásd a Kiegészítő Módszerek)

  2. 2

    a Minta tárolása tiszta labs ősi DNS munkát végezni csak külön ősi DNS lebonyolítására.

  3. 3

    különálló ősi mintákat külön laboratóriumokban dolgoztunk fel az eredmények reprodukálására.,

  4. 4

    minden labortag és ásatási résztvevő az mtDNS-t gépelte és Y-kromoszómát gépelt minden érintett férfin. Egyiknek sem volt megfelelő mtDNA vagy Y-kromoszóma típusa.

a jelentős szennyeződéssel szembeni bizonyítékként az 1. csontváz DNS-analízise tökéletes mtDNS-t mutat az ML1-hez, és egyetlen bázis-különbséget az ML2-hez képest. Ez egy egyértelmű Y-STR haplotípust is mutat, amelyet számos, két különálló laborban előállított és tesztelt kivonattal replikáltak., Végül a helyettesítési minta vizsgálata (lásd a kiegészítő módszereket) a mi olvasatunkban is támogatja ezt.

statisztikai elemzés

konzervatív megközelítést alkalmazva minden egyes lépésben kiszámítottuk a megfigyelt bizonyítékok minden egyes tételének valószínűségét két ellentétes hipotézis alapján: 1.hipotézis (H1): az 1. csontváz III, a 2. hipotézis (H2): az 1. csontváz nem Richard III.,

mivel ésszerű volt feltételezni, hogy az összes különböző bizonyítási vonal független volt, az összes bizonyíték közös valószínűségét az egyes hipotézisek alapján az egyes hasonlók szorzásával nyerték. A H1-re vonatkozó bizonyítékok súlyát, az úgynevezett valószínűségi arányt (LR), ezután a H1 alatti valószínűség aránya adta a H2 alatti valószínűséghez. Azt mondjuk, hogy egy feltételezés “konzervatív”, ha csökkenti az LR-t.

az LR lehet alakítani a valószínűsége, hogy H1 igaz, adott egy korábbi valószínűség., Elvittük, mint kiindulási pont abban a pillanatban, hogy ez a Csontváz 1 volt először megfigyelhető elismert, mint egy emberi csontváz, de mielőtt bármilyen értékelések kortól, nemtől, egészségi állapota, valamint a halál készültek. Ezen a ponton, volt jelentős bizonyíték arra, hogy a csontváz talált, amit úgy vélik, hogy már a helyét Leicester Grey Friars kórus lehet, hogy Richard III. Az összes rendelkezésre álló információk idején, hogy a csontváz 1 ben előkerült, beleértve a pontos helyét és a természet a sír, tekintették ezt az elemzést háttérinformációk, amelyek tájékoztatják a korábbi valószínűség., Ezen információk alapján úgy gondoljuk, hogy egy szkeptikus megfigyelő ésszerűen nem tudott volna 40-ből 1-nél kisebb előzetes valószínűséget kijelölni. Ezt az értéket egy korábbi elemzésben javasolták (http://rationalgareth.com/), A szkeptikus értékelések alapján. A legnagyobb valószínűség, amelyet az előzetes bizonyítékok igazolhatnak, 1 lehet a 2-ben.

releváns, rendelkezésre álló adatokat használtunk, ahol lehetséges. Elkerülhetetlenül szubjektív ítéletekre van szükség, például a releváns referenciapopulációkra, valamint a jelentett tények hibáinak valószínűségére., Amennyire lehetségesnek és ésszerűnek tűnt, igyekeztünk konzervatívnak lenni a megközelítésünkben, például pszeudokount módszerrel, hogy az LR-t az 1 semleges érték felé torzítsuk, így hajlamosak elkerülni a hamis nagy értékeket az alacsony megfigyelt frekvenciáktól. A radiokarbon adatok statisztikai elemzésében használt adatok és módszerek, a csontváz kora és neme, a scoliosis jelenléte, a perimortem sebek jelenléte, az Y-kromoszóma és az mtDNS frekvencia adatai a kiegészítő módszerekben találhatók. Az eredmények összefoglalása: a radiokarbon adatok valószínűségi arányt mutattak 1.,84 képviselő korlátozott támogatást h1. Az életkor, illetve a szex adatok alapján valószínűsíthető adag 5.25, újra képviselő korlátozott támogatás a H1. A Richard élete során jelentett egyik váll magasabb, mint a másik, a scoliosisnak tulajdonítható (az 1. csontváz súlyos idiopátiás serdülőkori scoliosis volt) vagy két másik ismert állapot, az Erb bénulása és a Sprengel deformitása, mindkettő nagyon ritka. A H1 alatt a fenti arányok becsült valószínűsége 0.,90 megfigyelése scoliosis tekintettel a leírás Richard III fizikai megjelenése (=a scoliosis Arány osztva az összeg a három arány), amit szorozva 0,95 annak lehetővé tétele érdekében, hogy a rögzített leírás helytelen volt. Ez 212-es LR-hez vezet, amely mérsékelten erős támogatást nyújt a H1 számára. A perimortem sérülések jelenléte 42 LR-t adott, így mérsékelt támogatást nyújtott a H1-hez. Az 1.csontváz Y-kromoszómája nem egyezik meg III., Ez azzal magyarázható, hogy a hamis apasági esemény egy vagy több 19 feltételezett apa–fia kapcsolatok között Richard III Henry Somerset, ötödik herceg Beaufort. Az Y-kromoszóma eredmények egy újabb hamis apasági eseményt is jeleznek Henry Somerset és öt kortárs, feltételezett patrilineáris leszármazottja között. A konzervatívság érdekében olyan közzétett hamis apasági rátát választottunk, amely (1) alacsonyabb volt,mint bármely más közzétett arány, amelyet figyelembe vettünk17, 47 és (2) a genealógiai adatok alapján.18., Ehhez hozzáadjuk a hamis apasági eseményt a 19 feltételezett apa-fiú kapcsolat Henry Somerset és öt kortárs férfi Somerset között. Ez legalább egy hamis apasági esemény valószínűségét adja a 19 feltételezett apa–fiú kapcsolat között, III. Richárd és Henry Somerset között, 0.16. Tekintettel arra, hogy a H1 alatt hamis apasági eseménynek kellett bekövetkeznie, az 1.csontváz Y-haplotípusának populációs gyakorisága megegyezik a H1 és H2 alatt, és törlődik az LR számításban. Így az LR 0,16, ami korlátozott bizonyítékot jelent a H1 ellen.,

az 1-es csontváz mtDNS-szekvenciái és III. Richárd feltételezett 19-meiózis matrilineáris rokona, Michael Ibsen teljesen megegyeztek. A 21-meiózis relatív is illeszkedik, kivéve egy bázis (8994). Ez utóbbi megfigyelés szintén valószínű a H1 és H2 alatt, tekintettel Michael Ibsen megfigyelt szekvenciájára, így az LR-ben megszűnik. Így csak a Michael Ibsen és a Skeleton 1 által megosztott sorozat megfigyelésére van szükség.

a H1 alatti valószínűség eléréséhez az mtDNA mutációs rátára van szükség, ebben az esetben a magas becslések konzervatívak. Parsons et al.,28 jelentés 10 kontroll régió mutációk 327 generációk segítségével genealógiai adatok. Mivel ez magasabb arányt sugall, mint a többi közzétett becslés, és genealógiai adatokon alapul, arra használtuk, hogy 0, 52-es valószínűséget derítsünk ki 19 meiózisban mutáció nélkül.

a H2 alatti valószínűség érdekében az 1 haplotípus csontvázának populációs frakciójára van szükség. Bár a teljes mtDNA genomszekvenciát a Skeleton 1-ből szereztük be, kevés közzétett teljes genom-összehasonlító adatot azonosítottunk Angliából., Így a statisztikai elemzéshez csak az mtDNA ellenőrzési régiókat használtuk a 16,093 és 16,320 pozíciók között, valamint a 00073 és 00188 között, amelyekhez megfelelő angol összehasonlító adatokat kaptunk Röhl et al frissítéséből.30, kiegészítve mtDNA szekvenciákkal, amelyeket a Roots for Real (genetikai ős Kft., Clare, Suffolk, UK). A kontroll régiónak csak a H2 alatti rövid szakaszainak használata konzervatív, mivel a megfigyelt kontrollrégió-szekvenciák populációs frakciója nem lehet kevesebb, mint a teljes mtDNS genomé., A releváns referenciapopuláció a múltban több mint 500 év, de a figyelembe vett időszak nagy népessége miatt arra számítunk, hogy a népesség gyakorisága az elmúlt öt évszázadban alig változott. Az 1 haplotípus csontvázának gyakoriságát 1823 között 0-nak találtuk az adatbázisban, amelyhez hozzáadjuk a Michael Ibsen-ben megfigyelt egy példányt. Ez a megközelítés, ismét, konzervatív, mint Michael mintavételezték miatt ismert genealógiai kapcsolat Richard III. ez vezet egy LR 478 képviselő mérsékelten erős bizonyíték h1.,

azt is megjegyezte, hogy nem volt egyezés adatbázis 26,127 Európai mitokondriális kontroll régió haplotypes (www.empop.org)29. Nem támaszkodnak ez az adatbázis, mert Európa-szerte, mint inkább konkrét Angliába, mert a ascertainment kérdések, de ez azt sugallja, hogy a Csontváz 1 egy lehet sokkal ritkább, mint lehet következtetni a kisebb angol adatbázis. Azt is megjegyezzük, hogy a női mobilitás az európai nemesség körében valószínűleg sokkal magasabb volt, mint a lakosság esetében, a politikai szövetségképzéssel kapcsolatos házassági gyakorlatok miatt., Az ilyen gyakorlatok némi indoklást adnának az európai mtDNA-adatbázis használatához, és így a Skeleton 1-ben és Michael Ibsen-ben található haplotípus rendkívül ritkának tekinthető. A 10. kiegészítő táblázatban néhány szemléltető eredményt mutatunk be az Európai adatbázis segítségével annak megállapítására, hogy az 1 haplotípus csontváz olyan ritka-e, mint azt az adatbázis javasolja.

a bizonyítékok különböző kombinációira és két hátsó valószínűségre vonatkozó LRs-t a 10.kiegészítő táblázat mutatja., Használatával minden, a bizonyítékok, a támogatás a H1 rendkívül erős egy LR 6.7 millió, tehát, hogy a szkeptikus lenne hajtott, hogy a következtetésre jutott, hogy annak a valószínűsége, hogy a Csontváz 1 nem Richard III kevesebb, mint 1 100,000, míg azoknál, akik egy 1 2 kiindulási helyzet, hogy valószínűsége sokkal kisebb, mint 1 millió. Figyelembe véve a fent leírt számításunk alapjául szolgáló konzervatív feltételezéseket, ezt úgy tekintjük, hogy ésszerű kétséget kizáróan megállapítjuk a H1 igazságát.