Bakteriális törzsek, illetve plazmidok

A következő E. coli törzsek használták ebben a vizsgálatban: DH5a, BL21(DE3) (Novagen), CLM24, valamint Origami2(DE3) gmd::kan ΔwaaL. A DH5a-t plazmid klónozásra és tisztításra használták., A BL21-et(de3) az összes in vitro glikozilációs reakcióban alkalmazott scFv13-R4DQNAT akceptor fehérje expressziójára és tisztítására használták. A CLM24 a w3110 gliko-optimalizált származéka, amely deléciót hordoz a WaaL ligázt kódoló génben, ezáltal megkönnyítve az előre összeszerelt glikánok felhalmozódását az Und-PP36-on. CLM24 használták megtisztulás a CjOST enzim, szerves oldószer alapú kitermelés minden HELLÓ sbearing bakteriális glycans, a forrás törzs-előkészítő kivonatok nélkül szelektíven dúsított glikozilációs alkatrészek., Origami2 (DE3) gmd:: A kan ΔwaaL-t Man3GlcNAc2 hordozó LLOs előállítására használták, és szekvenciális mutáció útján hozták létre p1vir fág transzdukcióval, a Keio collection62 megfelelő törzseinek donorként történő felhasználásával, amelyeket a Coli genetikai Állományközpontból (CGSC) nyertek. Röviden, a donor lizátumot a jw3597-1 törzsből (ΔrfaL734::kan) állították elő, és a keletkező fágot az Origami2(DE3) célsejtek megfertőzésére használták., Miután galvanizáló transformants a LB lemezeket tartalmazó kanamycin (Kan), sikeres transductants voltak kiválasztva, s a Kan ellenállás kazetták eltávolították átalakításával a hőmérséklet-érzékeny plazmid pCP2063. A kapott törzset, az Origami2(DE3) ΔwaaL-t ezután a gmd gén későbbi törlésére használták egy azonos stratégia szerint, de a jw2038-1 (Δgmd751::kan) donor törzs felhasználásával.

a vizsgálatban használt összes plazmid szerepel a 2. Kiegészítő táblázatban. Az ebben a vizsgálatban épített plazmidokat szabványos klónozási protokollok alkalmazásával készítették, és DNS-szekvenálással igazolták., Ezek a következők voltak. A pjl1-scFv13-R4DQNAT plazmidot az scfv13-r4dqnat(pET28a-scFv13-R4)dqnat (n34l, N77L) kódoló gén első PCR-amplifikálásával hozták létre, ahol az n34l és N77L mutációkat vezették be az scFv13-R452 putatív belső glikozilációs helyeinek kiküszöbölésére. A kapott PCR-terméket ezután a PJL1 plazmidban, a cfps49-ben használt pET-alapú vektorban az NcoI és a SalI restrikciós helyek között ligálták. A pjl1-sfGFP217-DQNAT plazmidot egy kereskedelmileg szintetizált SFGFP217-DQNAT (integrált DNS-technológiák) kódoló DNS-fragmentum pjl1-be ligálásával hozták létre., Ez a verzió az sfGFP tartalmaz egy további GT behelyezés után K214, amely kiterjeszti ezt a rugalmas hurok, mielőtt a végső béta sheet64. Ebbe a rugalmas hurokba, közvetlenül a T216 után, egy 21-aminosavszekvenciát oltottunk be, amely a C. jejuni AcrA N123 glikozilációs site34-et tartalmazza, de optimális dqnat szekvenciával a natív AcrA szekvon helyett. Hasonló eljárásokat alkalmaztak a pjl1-sfGFP217-AQNAT, pJL1-hEPO22-DQNAT-26, pJL1-hEPO36-DQNAT-40 és pJL1-hEPO81-DQNAT-85 plazmidok előállítására., A pjl1-hEPO22-DQNAT-26 esetében az érett humán EPO génjét úgy tervezték meg, hogy az N24 natív szekvonját 22-AENIT-26-ról optimális bakteriális szekvonra, DQNATRA cseréljék. Azonos klónozási stratégiákat hajtottak végre az optimális DQNAT motívumok külön-külön történő bevezetésére a natív hEPO sequons 36-NENIT-40 és 81-LVNSS-85 helyett. Az E. coli O9 primer adapter glican (Man3GlcNAc) rekombináns expresszióját Und-PP-n a Wbdb-t és a Wbdc-ből származó mannoziltranszferáz enzimeket kódoló gének klónozásával sikerült elérni., coli ATCC31616 a glycan, valamint az RfbK és RfbM összeszerelésére, amely szintén E. coli ATCC31616-ból származik az E. coli mg1655-ben rendelkezésre álló GDP-mannóz-készlet növelésére. Plazmid pConYCGmCB épített izoterm Gibson közgyűlés, illetve kódolja egy mesterséges operon áll: (i) az élesztő glycosyltransferases Alg13, Alg14, Alg1, valamint Alg2 a Man3GlcNAc2 glycan biosynthesis12, valamint (ii) az E. coli enzim phosphomannomutase (ManB), valamint a mannóz-1-foszfát guanylyltransferase (Biztos), ami együtt növelje a rendelkezésre álló GDP-mannóz hordozók a Alg1, valamint Alg2 enzimek.,

Protein expresszió és tisztítás

a Cjpglb tisztítását egy korábban leírt protokoll szerint végeztük34. Röviden, egyetlen kolónia E. coli CLM24 hordozó plazmid pSN1865 nőtt egy éjszakán át 37 °C-on 50 mL Luria-Bertani (LB; 10 g L-1 tripton, 5 g l−1 élesztő kivonat, 5 g L – 1 NaCl, pH 7.2) kiegészítve ampicillin (Amp) és 0,2% (w/V%) D-glükóz. Az éjszakai sejteket 1 liter friss levesbe (TB; 12 g L−1 tripton, 24 g L−1 élesztőkivonat, 0,4% (v/v%) glicerinbe, 10% (v/V%) 0,17 M KH2PO4/0.,72 M k2hpo4 foszfát puffer), erősítővel kiegészítve és addig termesztve, amíg a 600 nm-es abszorbancia (Abs600) el nem éri a ~0,7 értéket. Az inkubációs hőmérsékletet 16 °C-ra állítottuk be, majd a fehérje expresszióját az l-arabinóz 0,02% – os (w/v%) végső koncentrációhoz történő hozzáadásával indukáltuk. A fehérje expresszióját 16 °C-on 20 órán keresztül engedélyezték.a sejteket centrifugálással szüretelték, majd homogenizátorral (Avestin C5 EmulsiFlex) megszakították. A lizátumot centrifugálták a sejthulladékok eltávolítására, a felülúszót pedig ultrakentrifikálták (100 000×g) 2 órán át 4 °C-on., A membránfrakciót tartalmazó kapott pelletet 50 mM HEPES-t, 250 mM NaCl-t, 10% (v/v%) glicerint és 1% (w/v%) n-dodecil-β-d-maltozidot (DDM) tartalmazó pufferben lévő Potter-Elvehjem Szövet homogenizátorral teljes mértékben reszuszpendáltuk 7,5 pH-n. A szuszpenziót szobahőmérsékleten 1 órán keresztül inkubáltuk a cjpglb natív E. coli lipidjeiből származó mosószer oldásának megkönnyítése érdekében, amelyeket az ezt követő ultracentrifugálással (100 000×g) távolítottak el 1 órán át 4 °C-on., A DDM-szolubilizált CjPglB-t tartalmazó felülúszót a gyártó specifikációja szerint ni-NTA gyantával (Thermo) tisztítottuk, azzal a kivétellel, hogy az összes puffert 1% (w/v%) DDM-mel egészítettük ki. A Ni-NTA tisztításból származó elúciós frakciót ezután méretkorlátozó kromatográfiának (SEC) vetették alá egy ÄKTA Explorer FPLC rendszerrel (GE Healthcare), Superdex 200 10/300 GL oszlopmal. A tisztított fehérjét 1-2 mg mL−1 végső koncentrációban tároltuk OST tárolópufferben (50 mM HEPES, 100 mM NaCl, 5% (v/V%) glicerinben, 0,01% (w / v%) DDM, pH 7,5) 4 °C-on., A mintában a glicerin koncentrációját 20%-ra (v/v%) állítottuk be a -80 °C-on történő hosszú távú tároláshoz.

az scfv13-R4DQNAT akceptor fehérje tisztítását az előző leírtaknak megfelelően végeztük el52. Röviden, a plazmid pET28a-scFv13-R4(N34L, N77L) dqnatot hordozó E. coli BL21(DE3)törzset 1 L kanamicinnel szállított TB-ben termesztették. A kultúra keresztül 37 °C-on, amíg Abs600 elérte ~0.7, ekkor fehérje kifejezést által kiváltott kívül izopropil-β-d-1-thiogalactopyranoside (IPTG), hogy egy végső koncentrációja 0,1 mM. Fehérje expressziós engedte, hogy folytassa a 20 h 25 °C hőmérsékleten., A sejteket a fent leírtak szerint szüretelték és szétzilálták. Az scFv13-R4DQNAT fehérjét ni-NTA gyantával tisztítottuk, majd a SEC-t a gyártó előírásainak megfelelően. Fehérje tárolták a végső koncentrációja 1-2 mg mL−1 tároló-pufferben (50 mM HEPES, 250 mM NaCl, 1 mM EDTA, pH 7.5) 4 °C.

Kitermelés LLOs

A jegyzőkönyv szerves oldószeres extrakciójával LLOs E. coli membrán volt, átvéve a korábban leírt protocol34,66., A legtöbb esetben, egyetlen kolónia törzs CLM24 hordozó plazmid cél glycan bioszintézis (kiegészítő táblázat 2) nőtt egyik napról a másikra LB média. A figyelemre méltó kivételek a W. succinogenes N-glycan (WsLLOs), amelyet DH5a sejtekkel állítottak elő, amelyek a pEpiFOS-5pgl5 fosmidot hordozzák (Dr. Markus Aebi kedvesen biztosította), valamint az LLO Sbearing Man3GlcNAc2, amelyet Origami2(DE3) gmd felhasználásával állítottak elő: kan ΔwaaL sejtek, amelyek plazmid pConYCGmCB-t hordoznak. Az egyik napról a másikra a sejteket 1 liter TB-be szubkulturálták, megfelelő antibiotikummal kiegészítve, majd az Abs600 ~0, 7 eléréséig termesztették., Az inkubációs hőmérséklet kiigazításra került, hogy 30 °C-bioszintézis minden glycans kivéve Man3GlcNAc2, amely kiigazításra került, hogy 16 °C. A plazmid pMW07-pglΔB, fehérje kifejezést okozta l-arabinose a végleges koncentráció 0,2% – os (w/v%), míg a fosmid pEpiFOS-5pgl5 indukciós volt izopropil-β-d-1-thiogalactopyranoside (IPTG) a végső koncentrációja 1 mM. Minden más plazmidok benne alakuló szervezők, így nem volt szükség kémiai ingerre. 16 óra elteltével a sejteket centrifugálással szüretelték, a sejtpelleteket liofilizálták, hogy -70 °C-on teljes szárazságot érjenek el., A cjllos, a native and engineered ClLLOs, az E. coli O9 primer adapter LLOs és a WsLLOs kivonásához a liofilizátumokat 10:20:3 arányban felfüggesztették a CHCl3:CH3OH:H2O oldat térfogatarányában, és szobahőmérsékleten 15 percig inkubálták, hogy megkönnyítsék a LLOs kinyerését. Az LLO sbearing Man3GlcNAc2 glycan kinyeréséhez a liofilizátumot 10:20 (v/v%) CHCl3:CH3OH oldatban, vízben és 10:20:3 CHCl3:CH3OH:H2O oldatban, 15 perc inkubációval szobahőmérsékleten, minden lépés között., Mindegyik esetben a végső szuszpenziót 15 percig centrifugáltuk (4000×g), majd a szerves réteget (alsó réteget) összegyűjtöttük, majd vákuumkoncentrátorral szárítottuk, majd liofilizáltuk. Lyophilisates tartalmazó aktív LLOs volt újraszuszpendált a sejt-ingyenes glikozilációs pufferben (10 mM HEPES pH 7.5, 10 mM MnCl2, 0,1% – os (w/v%) DDM) tárolt, 4 °C.

Előkészítése nyers S30 kivonatok

CLM24 forrás törzsek voltak, nőtt a 2×YTPG (10 g L−1 élesztő kivonat, 16 g L−1 tryptone, 5 g L−1 NaCl, 7 g L−1 K2HPO4, 3 g L−1 KH2PO4, 18 g L−1 glükóz, pH 7,2), amíg a Abs600 elérte a ~3., Ahhoz, hogy létrehoz OST-dúsított kivonat, CLM24 hordozó plazmid pSF-CjPglB, pSF-CcPglB, pSF-DdPglB, pSF-DgPglB, vagy pSF-DvPglB52 használták a forrás törzs. LLO-dúsított kivonat előállításához a CLM24 hordozó pmw07-pglΔB plazmidot használták forrás törzsként. Az OST-t és LLOs-t egyaránt tartalmazó egyedényes kivonat előállításához a PMW07-pglΔB-t és pSF-CjOST-t hordozó CLM24-et használták forrás törzsként. Szükség szerint a glikozilációs komponensek expresszióját l-arabinózsal indukálták 0, 02% (w/v%) végső koncentrációban., Az indukció után a fehérjeexpresszió 30 °C-on OD600 ~3 sűrűségig folytatható, ekkor a sejteket centrifugálással (5000×g) 4 °C-on 15 percig szüretelték. Minden további lépést 4 °C-on végeztünk, hacsak másként nem jelezzük. A pelletált sejteket háromszor mossuk S30 pufferben (10 mM tris-acetát, 14 mM magnézium-acetát, 60 mM kálium-acetát, pH 8,2). Az utolsó mosás után a sejteket 10 percen át 7000×g-on pelletálták, majd folyékony nitrogénre fagyasztották. A lizátum előállításához a sejteket felolvasztottuk, és 1 g nedves sejttömegre jutó 1 mL S30 pufferben homogenitásig reszuszpendáltuk., A sejteket megszakították egy Avestin EmulsiFlex-B15 nagynyomású homogenizátorral, 20 000-25 000 psi–vel, egyetlen átjáróval. A lizátumot ezután kétszer centrifugáltuk 30 000×g-on 30 percig, hogy eltávolítsuk a sejthulladékot. Felülúszó átszállították egy új hajó, majd inkubáljuk 250 rpm remeg 37 °C-on 60 perc rontja endogén mrns átiratát, megzavarhatja a meglévő polysome komplexek a lysate. A centrifugálást (15 000×g) követően 4 °C-on 15 percig felülúszót gyűjtöttek, alikvotáltak, folyékony nitrogénben villogtak, és -80 °C-on tárolták., Az S30 kivonat körülbelül három fagyasztási felolvasztási cikluson keresztül volt aktív, és ~40 g L-1 teljes fehérjét tartalmazott a Bradford vizsgálattal mérve.

Cell-ingyenes glikoprotein szintézis

in vitro glikozilációs a tisztított elfogadó fehérje, reakciók végeztek ki egy 50 µL térfogatú tartalmazó 3 µg scFv13-R4DQNAT, 2 µg tisztított CjPglB, 5 µg kivont LLOs (abban az esetben, Man3GlcNAc2 LLOs, 20 µg használták) az in vitro glikozilációs pufferben (10 mM HEPES pH 7.5, 10 mM MnCl2, 0,1% – os (w/v%) DDM). A reakcióelegyet 30 ° C-on 16 órán át inkubáltuk., A glikoproteinek nyers kivonatalapú expressziójára kétfázisú rendszert hajtottak végre. Az első fázisban a fehérjeszintézist módosított PANOx-SP rendszerrel végeztük67. Pontosabban, 1,5 mL mikrocentrifuga csövek alá 15-µL reakciók tartalmazó 200 ng plazmid DNS-t, 30% – os (v/v%) S30 kivonat, valamint a következő: a 12 mM-es magnézium-glutamát, 10 mM ammónium-glutamát, 130 mM-es kálium-glutamát, 1.2 mM adenozin-trifoszfát (ATP), 0.85 mM guanozin-trifoszfát (GTP), 0.85 mM uridine trifoszfát (UTP), 0.85 mM citidin-trifoszfát (CTP), 0.034 mg mL−1 folinic sav, 0.,171 mg mL-1 E. coli tRNA (Roche), 2 mM mindegyik 20 aminosav, 30 mM foszfoenolpiruvát (PEP, Roche), 0,4 mM nikotinamid adenin dinukleotid (NAD), 0,27 mM koenzim-a (CoA), 4 mM oxálsav, 1 mM putrescu, 1,5 mM spermidin és 57 mM HEPES. Az scFv13-R4DQNAT, a hEPO22-DQNAT-26, a hEPO36-DQNAT-40 és a hEPO81-DQNAT85 esetében ezt a fázist oxidáló körülmények között 30 °C-on 4 órán keresztül, míg az sfGFP217-DQNAT és az sfGFP217-AQNAT esetében ezt a fázist 30 °C-on, 5 percen keresztül, redukáló körülmények között hajtották végre., Oxidációs körülmények között a kivonatot előkondicionáltuk 750 µM-es jódacetamiddal, szobahőmérsékleten 30 percig, a reakcióelegyet pedig 200 mM-es glutationnal, 3:1 arányban az oxidált és redukált formák között. A sejtmentes reakciókból származó aktív sfGFP-hozamot a fluoreszcencia in-lizátum mérésével számszerűsítettük,és a korábban leírt standard görbe segítségével koncentrációvá alakítottuk39. A második fázisban a proteinglikozilációt MnCl2 és DDM hozzáadásával indították el 10 mM és 0 végső koncentrációban.,1% (w/V%), illetve hagyjuk, hogy folytassa 30 °C-on 16 h. szükség szerint, reakciók kiegészítettük 2 µg tisztított cjpglb (azaz a CFGpS LLO-dúsított kivonatok) vagy 5 µg oldószerrel extrahált cjllos (azaz a CFGPS OST-dúsított kivonatok). Az összes reakciót leállítottuk 5% ßME-t tartalmazó Laemmli mintapuffer hozzáadásával, majd a mintákat 15 percig 100 °C-on forraltuk, majd az SDS-PAGE és a western blotting elemezte.

Western blot analysis

0,5 µg akceptor fehérjét tartalmazó mintákat töltöttek be SDS-PAGE gélekbe., Az elektroforetikus elválasztást követően a fehérjéket a gélekből Immobilon-p polivinilidén-difluorid (PVDF) membránokra (0,45 µm) helyezték át a gyártó protokollja szerint. A membránokat kétszer TBS pufferrel (80 g L−1 NaCl, 20 g L−1 KCl és 30 g L−1 Tris-base) mossuk, majd 1 órán át inkubáljuk blokkoló oldatban (50 g l−1 zsírmentes tej tbst-ben (TBS 0,05% (v/v%) Tween-20)). A blokkolás után a membránokat 4-szer mossuk TBST-vel, 10 perc inkubációval minden mosás között., Első membrán szondáztak meg a 6xHis-poliklonális antitest (Abcam, ab137839, 1:7500), hogy kifejezetten elismeri, hexahistidine epitope kategória, míg a második párhuzamos membrán volt a tapintása, az egyik a következő: hR6 (1:10,000) szérum a nyúl, hogy felismeri a natív C. jejunira, illetve C. lari glycan, valamint a mesterséges C. lari glycan vagy Napsugár-HRP (Sigma, L6397, 1:2500), amely felismeri Man3GlcNac, valamint Man3GlcNAc2. A membránok tapintását legalább 1 órán keresztül szobahőmérsékleten rázással végezték, majd a membránokat TBST-vel a fent leírtak szerint mossuk., A fejlesztés érdekében a membránokat rövid ideig szobahőmérsékleten inkubáltuk Western ECL szubsztráttal (BioRad), majd ChemiDocTM XRS+rendszerrel imagáltuk. A kivonatokban dúsított OST enzimeket azonos SDS-PAGE eljárással detektálták, majd a Western blot analízist a FLAG epitope címkére specifikus poliklonális antitesttel (Abcam, ab49763, 1:7500) követték. A kivonatokban dúsított LLOs glikánkomponensét úgy detektáltuk, hogy 10 µL kivonatot közvetlenül a nitrocellulóz membránokra pecsételtünk, majd hR6 szérummal kimutattuk. A levágatlan immunoblot képeket kiegészítő ábra mutatja. 8.,

MS elemzés

Körülbelül 2 µg scFv13-R4DQNAT fehérje megoldás az volt, denaturált 6 M karbamid, kedvezményes, 10 mM DTT, inkubálják 34 °C, 1 h, akkor alkilált 58 mM iodoacetamide 45 perc a sötétben, szobahőmérsékleten kioltja végső 36 mM DTT. Az oldatot ezután 50 mM-es ammónium-hidrogén-karbonáttal (pH 8.0) hígítottuk 1 M karbamid végső pufferkoncentrációjára a tripszin emésztése előtt. A mintát 0,2 µg tripszinnel emésztettük 18 órán keresztül 37 °C-on., A mintákat ezután sola HRP SPE patronnal (Thermofisher Scientific) sótalanították. A patronokat 1 × 0,5 mL 90% metanollal, 0,1% trifluorecetsavval (TFA) kondicionálták, és 2 × 0,5 mL 0,1% (v/V%) TFA-val egyenlítették ki. A mintákat 1:1 arányban hígítottuk 0,2% (v/v%) TFA-val, majd lassan haladtunk át a patronokon. 2 × 0,5 mL equilibrációs oldattal történő mosás után a peptideket 1 × 0,5 mL 50% (v/v%) acetonitril (ACN), 0,1% (v/v%) TFA-val eluáltuk, majd sebességi vákuum centrifugában szárítottuk.,

a nanoLC-MS / MS analízist UltiMate3000 Rslcnano (Dionex) alkalmazásával végezték, amely egy Nanospray Flex Ionforrással felszerelt Orbitrap Fusion (Thermofisher Scientific) tömegspektrométerrel volt összekapcsolva. Minden minta elkészített 22 µL 0,5% – os (w/v%) FA, 10 µL volt rakják egy Elismerést PepMap 100 C18 csapda oszlop (5 µm 100 µm × 20 mm, 100 Å, ThermoFisher Tudományos) a nanoViper Szerelvények 20 µL / min−1 0,5% – os FA on-line desalting., Után 2 perc, a szelep kapcsolva, lehetővé teszi, peptidek, hogy külön egy Elismerést PepMap C18 nano oszlop (3 µm, 75 µm × 25 cm, ThermoFisher Tudományos), 90 perc gradiens 5 23% 35% B 300 nL / min−1 (3 73 93 min-kal), majd a 9-min mélyítő 90% – B, 9-min tartsa a 90% – át, B-gyors kapcsoló 5% – B a 1 min. Az oszlopot a következő futást megelőzően 20 percig 5% B-vel újra kiegyenlítették. Az Orbitrap Fusion pozitív ion üzemmódban működött, nanoszűrő feszültsége 1,7 kV, forráshőmérséklete 275 °C volt., Az FT, IT és quadrupole tömeganalizátorok külső kalibrálását az elemzés előtt végezték el. Az Orbitrap full ms survey scan (m / z 400-1800) követte Top 3 s adatfüggő magasabb ütközés disszociációs termék ion kiváltott ETD (HCD-pd-ETD) MS/MS vizsgál prekurzor peptidek 2-7 díjak felett küszöbérték ion száma 50.000 normalizált ütközés energia 32%., MS survey vizsgálatok szerezték meg a megoldása hatalom 120.000 (FWHM az m/z 200), Automata Gin Vezérlés (AGC) = 2e5, a maximális befecskendezési idő (Max IT) = 50 ms, valamint HCD MS/MS vizsgálatok felbontással 30 000 AGC = 5e4, Max IT = 60 ms Q elszigeteltség ablak (m/z) 3-kor a tömeg tartomány m/z 105-2000. A dinamikus kizárási paramétereket 60 s-os kizárási időtartamon belül 1-re állítottuk be ±10 ppm kizárási tömegszélességgel. Termék Ion trigger lista állt csúcsok 204.0867 Da (HexNAc oxonium ion), 138.0545 Da (HexNAc fragmentum), és 366.1396 Da (HexHexNAc oxonium ionok)., Ha a listában szereplő HCD termékionok egyikét észlelték, két töltésfüggő ETD MS/MS vizsgálatot (EThcD) aktiváltak HCD kiegészítő aktiválással (SA) ugyanazon prekurzor ionon, és egy lineáris ioncsapdában gyűjtötték össze. A kétszeresen feltöltött prekurzorok esetében a 150 ms-os ETD reakcióidőt és az SA-energiát 30% – ra, míg a magasabb töltésű prekurzorok esetében ugyanezeket a paramétereket 125 ms-ra, illetve 20% – ra határozták meg. Mindkét ion indított vizsgálatok, fluorantén ETD reagens cél volt beállítva 2e5, AGC cél 1e4, Max a 105 ms elszigeteltség ablak a 3. Az összes adatot az Xcalibur 3 használatával szerezték be.,0 operation software and Orbitrap Fusion Tune Application v. 2.1 (Thermofisher Scientific).

minden egyes mintából származó MS és MS/MS raw spektrumot a Byonics v.2.8.2 (Protein Metrics) segítségével kerestünk az e coli fehérjeadatbázis segítségével, hozzáadott scFv13-R4DQNAT protein célszekvenciával. A peptid Keresési paraméterei a következők voltak: két kihagyott hasítás a teljes tripszin emésztéshez a cisztein rögzített karbamidometil-módosításával, a metionin oxidációjának változó módosításával, valamint az aszparagin/glutaminmaradékok deamidálásával., A peptid tömegtűrése 10 ppm volt, a fragmentum tömegtűrési értéke pedig 0,05, illetve 0,6 Da volt. Mind a gyakori, mind a ritka módosítások maximális számát kettőre határozták meg. A glycan keresést a Byonic szoftver 309 emlős n-linked glikánja ellen hajtották végre. Az azonosított peptideket legfeljebb 2% FDR-re szűrtük. A szoftver exportálta a keresés eredményeit egy táblázatba.

GFP fluoreszcencia aktivitás

a sejtmentes származtatott sfGFP aktivitását a korábban leírt in-Lizát fluoreszcencia analízissel határozták39., Röviden, 2 µL sejtmentes szintetizált glikozilált sfGFP reakciót 48 µL nanopure vízbe hígítottuk. A megoldást ezután egy Costar 96-kút fekete vizsgálati lemezbe (Corning) helyezték. Az sfgfp fluoreszcencia gerjesztési és emissziós hullámhossza 485, illetve 528 nm volt.

enzimhez kötött immunszorbens analízis (ELISA)

Costar 96-well ELISA lemezeket (Corning) 4 °C-on egy éjszakán át 50 µl 1 mg mL−1 E. coli β-gal (Sigma-Aldrich) 0,05 M nátrium-karbonát pufferben (pH 9,6) vontak be., Miután szobahőmérsékleten 5% (w/v%) szarvasmarhafélék szérumalbumin (BSA)-ját 3 órán át PBS-ben blokkolták, a lemezeket négyszer pbst pufferrel (PBS, 0,05% (v/v%) Tween-20, 0,3% (w/v%) BSA-val) mossuk, majd szobahőmérsékleten szériálisan hígított scfv13-R4 mintákkal vagy cfgps lizátumok oldható frakcióival inkubáljuk 1 órán keresztül. A mintákat a Bradford-vizsgálattal számszerűsítették, és ezzel egyenértékű mennyiségű teljes fehérjét alkalmaztak a lemezre. Miután négyszer ugyanazzal a pufferrel mostuk, az anti-6× – his-HRP konjugált nyúl poliklonális antitestet (Abcam) 3% PBST-ben adtuk minden kúthoz 1 órán keresztül., A lemezeket szabványos protokollokkal mosták és fejlesztették ki.

In vitro sejtproliferációs vizsgálat

humán erythroleukemia TF-1 sejtek (Sigma), amelyek granulocyta–makrofág kolónia stimuláló faktort (GM-CSF), interleukin 3 (IL-3) vagy hEPO-t igényelnek a növekedéshez és a túléléshez. A sejteket 10% FBS, 50 U mL−1 penicillin, 50 mg mL−1 sztreptomicin, 2 mM glutamin és 2 ng mL−1 GM-CSF-vel kiegészített rpmi-1640 közegben tartottuk 5% CO2-t tartalmazó, nedvesített légkörben., A GM-CSF nélküli rpmi-1640 közegben 16 óra inkubálás után a sejteket megszámolták, betakarították és friss közegben reszuszpendálták. Kútonként 5 × 103 TF-1 cellát vetettünk be egy 96-kút vizsgálati lemezbe, és EPO szabványokat vagy mintákat adtunk a végső kívánt koncentrációkhoz minden egyes kúthoz. Az alamarblue®hozzáadása előtt a sejteket 6 órán keresztül inkubáltuk nedves inkubátorban. 12 óra elteltével a fluoreszcencia jelet 560 nm/590 nm gerjesztési/emissziós hullámhosszon mértük.,

az adatok rendelkezésre állása

a vizsgálat során keletkezett összes adat ebben a cikkben és annak kiegészítő információs fájljaiban található, és a szerzők kérésére rendelkezésre állnak.