tulpini Bacteriene și plasmide

următoarele tulpini de E. coli au fost utilizate în acest studiu: DH5a, BL21(DE3) (Novagen), CLM24, și Origami2(DE3) gmd::kan ΔwaaL. DH5a a fost utilizat pentru clonarea și purificarea plasmidelor., BL21(DE3) a fost folosit pentru exprimarea și purificarea scFv13-R4DQNAT acceptor de proteine, care a fost folosit în toate în vitro glicozilare reacții. CLM24 este o glico-optimizat derivat de W3110 care poartă o deleție în gena care codifică WaaL ligase, facilitând, astfel, acumularea de preasamblate glicanii pe Und-PP36. CLM24 a fost folosit pentru purificarea CjOST enzime organice, pe baza de solvent de extracție de toate LLO sbearing bacteriene glicanii, și sursa tulpina pentru prepararea extractelor cu și fără selectiv imbogatit glicozilare componente., Origami2(DE3) gmd::kan ΔwaaL a fost folosit pentru producerea de Man3GlcNAc2-rulment LLOs și a fost generată de mutații secvențiale cu P1vir fagul transducție folosind respective tulpini din Keio collection62 în calitate de donatori, care au fost obținute din Coli Stoc Genetic Center (CGSC). Pe scurt, donator lizat a fost generat de tulpina JW3597-1 (ΔrfaL734::kan) și rezultă fagul a fost folosit pentru a infecta Origami2(DE3) celulele țintă., După placare transformanții pe LB plăci care conțin kanamicină (Kan), succes transductants au fost selectate și lor Kan rezistență casete au fost eliminate prin transformarea cu sensibile la temperatură plasmidă pCP2063. Rezultate tulpina, Origami2(DE3) ΔwaaL, a fost apoi utilizat pentru ștergerea ulterioară a gmd gene potrivit unui identice strategie, dar folosind tulpina de donator JW2038-1 (Δgmd751::kan).toate plasmidele utilizate în studiu sunt enumerate în tabelul suplimentar 2. Plasmidele construite în acest studiu au fost realizate folosind protocoale standard de clonare și confirmate prin secvențiere ADN., Acestea au inclus următoarele. Plasmida pJL1-scFv13-R4DQNAT a fost generată de primul PCR amplificarea genei care codifică scFv13-R4DQNAT de exprimare pet28a-scFv13-R4(N34L, N77L)DQNAT, unde N34L și N77L mutații au fost introduse pentru a elimina posibilele interne glicozilare site-uri în scFv13-R452. Produsul PCR rezultat a fost apoi legat între situsurile de restricție NcoI și SalI în plasmida pJL1, un vector bazat pe pET utilizat pentru CFPS49. Plasmida pJL1-sfGFP217-DQNAT a fost generată de ligatura comercială sintetizat fragment de ADN codare sfGFP217-DQNAT (Integrat Tehnologii de ADN) în pJL1., Această versiune de sfGFP conține o suplimentare de GT de inserție după K214, care se extinde această buclă flexibilă înainte de final beta sheet64. În această buclă flexibilă, imediat după T216, am altoit un 21-secvență de aminoacizi care conțin C. jejuni AcrA N123 glicozilare site34, dar cu un optim DQNAT sequon în loc de nativ AcrA sequon. Proceduri similare au fost folosite pentru a genera plasmide pJL1-sfGFP217-AQNAT, pJL1-hEPO22-DQNAT-26, pJL1-hEPO36-DQNAT-40, și pJL1-hEPO81-DQNAT-85., În caz de pJL1-hEPO22-DQNAT-26, gena pentru om matur EPO a fost proiectat astfel încât nativ sequon la N24 a fost schimbat de la 22-AENIT-26 pentru o optimă bacteriene sequon, DQNAT. Identice cu clonarea de strategii au fost efectuate pentru a introduce separat optimă DQNAT motive în loc de nativ jieyang sequons 36-NENIT-40 și 81-LVNSS-85. Recombinant expresie a E. coli O9 primer-adaptor glycan (Man3GlcNAc) pe Und-PP a fost realizat prin clonarea genelor care codifică WbdB și WbdC mannosyltransferase enzime derivate din E., coli ATCC31616 pentru asamblarea este, și RfbK și RfbM, de asemenea, derivate din E. coli ATCC31616 pentru creșterea disponibili din PIB-manoză, în E. coli MG1655. Plasmida pConYCGmCB a fost construită prin izoterme Gibson asamblare și codifică o artificială operon format din: (i) drojdie glycosyltransferases Alg13, Alg14, Alg1, și Alg2 pentru Man3GlcNAc2 glycan biosynthesis12 și (ii) E. coli enzime phosphomannomutase (ManB) și manoză-1-fosfat guanylyltransferase (Manchester), care, împreună, crește disponibilitatea de a PIB-manoză substraturi pentru Alg1 și Alg2 enzime.,

expresia și purificarea proteinelor

purificarea CjPglB a fost efectuată conform unui protocol descris anterior34. Pe scurt, o singură colonie de E. coli CLM24 realizarea plasmidă pSN1865 a fost crescut peste noapte la 37 °C în 50 mL de Luria-Bertani (LB; 10 g L−1 tryptonă, 5 g L−1 extract de drojdie, 5 g L−1 NaCl, pH 7,2) completate cu ampicilina (Amp) și 0,2% (w/v%) d-glucoză. Celulele peste noapte au fost subculturate în 1 L de bulion proaspăt teribil( TB; 12 g L−1 triptonă, 24 G L−1 extract de drojdie, 0,4% (v/v%) glicerol, 10% (v/v%) 0,17 m KH2PO4/0.,72 m tampon fosfat k2hpo4), suplimentat cu Amp și crescut până când absorbția la 600 nm (Abs600) a atins o valoare de ~0,7. Temperatura de incubare a fost ajustată la 16 °C, după care expresia proteinei a fost indusă prin adăugarea de l-arabinoză la o concentrație finală de 0,02% (g/v%). Expresia proteinei a fost lăsată să continue timp de 20 h la 16 °C. celulele au fost recoltate prin centrifugare și apoi perturbate folosind un omogenizator (Avestin C5 Emulglex). Lizatul a fost centrifugat pentru a îndepărta resturile celulare, iar supernatantul a fost ultracentrifugat (100,000×g) timp de 2 ore la 4 °C., Rezultate pelete conțin membrana fracțiune a fost complet omogenizată cu un Olar-Elvehjem țesut omogenizator în tampon conținând 50 mM HEPES, 250 mM NaCl, 10% (v/v%) glicerol, și 1% (w/v%) n-dodecil-β-d-maltoside (DDM), la pH 7.5. Suspensia a fost incubată la temperatura camerei timp de 1 h pentru a facilita solubilizarea detergentului cjpglb din lipidele native de E. coli, care au fost îndepărtate prin ultracentrifugare ulterioară (100,000×g) timp de 1 h la 4 °C., Supernatantul care conține cjpglb solubilizat DDM a fost purificat folosind rășină Ni-nta (Thermo) conform specificațiilor producătorului, cu excepția faptului că toate tampoanele au fost completate cu 1% (w/v%) DDM. Eluarea fracțiune de Ni-NTA purificare a fost apoi supus la dimensiunea cromatografia de excludere (SEC), folosind un ÄKTA Explorer FPLC sistem (GE Healthcare), cu Superdex 200 10/300 GL coloana. Proteina purificată a fost păstrată la o concentrație finală de 1-2 mg mL-1 în tampon de stocare OST (50 mm HEPES, 100 mM NaCl, 5% (v/v%) glicerol, 0,01% (g/v%) DDM, pH 7,5) la 4 °C., Glicerol concentrația în probă a fost ajustat la 20% (v/v%) pentru depozitarea pe termen lung la -80 °C.

de Purificare de acceptor de proteine scFv13-R4DQNAT a fost efectuată după cum este descris previously52. Pe scurt, tulpina de E. coli BL21(DE3), care transportă plasmidă de exprimare pet28a-scFv13-R4(N34L, N77L)DQNAT fost cultivate în 1 L de TB furnizate cu kanamicina. Cultura a fost incubate la 37 °C până Abs600 ajuns la ~0.7, moment în care expresia proteinelor a fost indusă prin adaos de izopropil β-d-1-thiogalactopyranoside (IPTG) până la o concentrație finală de 0,1 mM. Expresia proteinelor a fost permis pentru a continua timp de 20 sec la 25 °C., Celulele au fost recoltate și perturbate identic așa cum este descris mai sus. Proteina scFv13-R4DQNAT a fost purificată folosind rășină Ni-NTA urmată de SEC conform protocoalelor producătorului. Proteine fost depozitate la o concentrație finală de 1-2 mg mL−1 în tampon de stocare (50 mM HEPES, 250 mM NaCl, 1 mM EDTA, pH 7.5) la 4 °C.

Extracția de LLOs

protocolul de extracție cu solvent organic de LLOs de E. coli membrane a fost adaptat de la un descris anterior al acesteia34,66., În majoritatea cazurilor, o singură colonie de tulpină CLM24 care transportă o plasmidă pentru biosinteza glicanului țintă (tabelul suplimentar 2) a fost cultivată peste noapte în medii LB. Cu excepții notabile au fost LLOs poartă W. succinogenes N-glycan (WsLLOs), care au fost produse folosind DH5a celulele care transportă pEpiFOS-5pgl5 fosmid (furnizat cu amabilitate de Dr. Markus Aebi), și LLO sbearing Man3GlcNAc2, care au fost produse folosind Origami2(DE3) gmd::kan ΔwaaL celulele care transportă plasmidă pConYCGmCB. Celulele peste noapte au fost subculturate în 1 L de TB suplimentat cu un antibiotic adecvat și cultivate până când Abs600 a ajuns la ~0.7., Temperatura de incubare a fost ajustat la 30 °C pentru biosinteza de toate glicanii cu excepția Man3GlcNAc2, care a fost ajustat la 16 °C. Pentru plasmidă pMW07-pglΔB, expresia proteinelor a fost indusă cu l-arabinoza la o concentrație finală de 0,2% (w/v%), în timp ce pentru fosmid pEpiFOS-5pgl5 de inducție a fost cu izopropilic β-d-1-thiogalactopyranoside (IPTG) la o concentrație finală de 1 mM. Toate celelalte plasmide implicate constitutiv promotori și, prin urmare, nu necesită chimice inductori. După 16 ore, celulele au fost recoltate prin centrifugare, iar peletele celulare au fost liofilizate pentru a se usca complet la -70 °C., Pentru extragerea de CjLLOs, nativ și proiectat ClLLOs, E. coli O9 primer-adaptor LLOs, și WsLLOs, cele liofilizate au fost suspendate în 10:20:3 raport volumetric de CHCl3:CH3OH:H2O soluție și se incubează la temperatura camerei timp de 15 min, pentru a facilita extracția de LLOs. Pentru extragerea de LLO sbearing Man3GlcNAc2 glycan, liofilizat a fost suspendat succesiv într-10:20 (v/v%) CHCl3:CH3OH soluție, apă, și 10:20:3 CHCl3:CH3OH:H2O soluție cu 15 min de incubare la temperatura camerei între fiecare pas., În fiecare caz, suspensia finală a fost centrifugată (4000×g) timp de 15 minute, după care stratul organic (stratul inferior) a fost colectat și uscat cu un concentrator de vid urmat de liofilizare. Liofilizate conțin active LLOs au fost resuspendate în celula de glicozilare tampon (10 mM HEPES, pH 7.5, 10 mM MnCl2, și 0,1% (w/v%) DDM) și se depozitează la 4 °C.

Pregătirea brut S30 extracte

CLM24 sursa tulpinile au fost cultivate în 2×YTPG (10 g L−1 extract de drojdie, 16 g L−1 tryptonă, 5 g L−1 NaCl, 7 g L−1 K2HPO4, 3 g L−1 KH2PO4, 18 g L−1 glucoza, pH 7,2) până la Abs600 ajuns la ~3., Pentru a genera OST îmbogățit cu extract de CLM24 realizarea plasmidă pSF-CjPglB, pSF-CcPglB, pSF-DdPglB, pSF-DgPglB, sau pSF-DvPglB52 a fost folosit ca sursă de tulpina. Pentru a genera extract îmbogățit cu LLO, CLM24 care transportă plasmida pMW07-pglΔB a fost utilizată ca tulpină sursă. Pentru a genera o oală extract care conține atât OST și LLOs, CLM24 realizarea pMW07-pglΔB și pSF-CjOST a fost folosit ca sursă de tulpina. După cum a fost necesar, expresia componentelor de glicozilare a fost indusă cu L-arabinoză la concentrația finală de 0,02% (g/v%)., După inducție, expresia proteinei a fost lăsată să se desfășoare la 30 °C până la o densitate de OD600 ~3, moment în care celulele au fost recoltate prin centrifugare (5000×g) la 4 °C timp de 15 min. Toate etapele ulterioare au fost efectuate la 4 °C, dacă nu se specifică altfel. Celulele granulate au fost spălate de trei ori în tampon S30 (acetat de tris 10 mM, acetat de magneziu 14 mM, acetat de potasiu 60 mM, pH 8,2). După ultima spălare, celulele au fost granulate la 7000×g timp de 10 min și înghețate flash pe azot lichid. Pentru a face lizat, celulele au fost dezghețate și resuspendate până la omogenitate în 1 mL de tampon S30 pe 1 g de masă celulară umedă., Celulele au fost perturbate folosind un omogenizator de înaltă presiune Avestin Emulglex-B15 la 20.000-25.000 psi cu un singur pasaj. Lizatul a fost apoi centrifugat de două ori la 30,000×g timp de 30 min pentru a îndepărta resturile celulare. Supernatantul a fost transferat într-un vas nou și incubat cu 250 rpm agitând la 37 °C timp de 60 min pentru a degrada transcrierile ARNm endogene și a perturba complexele polizomice existente în lizat. După centrifugare (15.000×g) timp de 15 min la 4 °C, supernatantul a fost colectat, alicotat, înghețat în azot lichid și depozitat la -80 °C., Extractul S30 a fost activ timp de aproximativ trei cicluri de îngheț-dezgheț și a conținut ~40 g proteină totală L−1 măsurată prin testul Bradford.

Cell-free glicoproteina sinteza

Pentru in vitro glicozilare a purificat acceptor de proteine, reacțiile au fost efectuate în volum de 50 µL conținând 3 µg de scFv13-R4DQNAT, 2 µg de purificat CjPglB, și 5 µg extras LLOs (în caz de Man3GlcNAc2 LLOs, 20 µg fost folosit) in vitro glicozilare tampon (10 mM HEPES, pH 7.5, 10 mM MnCl2, și 0,1% (w/v%) DDM). Amestecul de reacție a fost incubat la 30 ° C timp de 16 ore., Pentru expresia pe bază de extract brut a glicoproteinelor, a fost implementată o schemă în două faze. În prima fază, sinteza proteinelor a fost efectuată cu un sistem PANOx-SP modificat67. În mod special, microcentrifugă de 1,5 mL tuburi fost taxat cu 15-µL reacții care conțin 200 ng ADN-ul plasmidic, 30% (v/v%) extract S30 și următoarele: 12 mM glutamat de magneziu, 10 mM glutamat de amoniu, 130 mM glutamat de potasiu, 1.2 mM adenozin trifosfat (ATP), 0.85 mM guanozin trifosfat (GTP), 0.85 mM uridin trifosfat (UTP), 0.85 mM citidin trifosfat (CTP), 0.034 mg mL−1 acid folinic, 0.,171 mg mL−1 E. coli tRNA (Roche), 2 mM fiecare din 20 de aminoacizi, 30 mM phosphoenolpyruvate (PEP, Roche), 0,4 mM nicotinamid-adenin-dinucleotid (NAD), 0,27 mM-coenzima A (CoA), 4 mM acid oxalic, 1 mM putresceină, 1,5 mM spermidina, și 57 mM HEPES. Pentru scFv13-R4DQNAT, hEPO22-DQNAT-26, hEPO36-DQNAT-40, și hEPO81-DQNAT85, această etapă a fost efectuată la 30 °C timp de 4 h în condiții de oxidare, în timp ce pentru sfGFP217-DQNAT și sfGFP217-AQNAT această etapă a fost efectuată la 30 °C timp de 5 min, în condiții reducătoare., Pentru condiții de oxidare, extract de pre-condiționat cu 750 µM iodoacetamide în întuneric, la temperatura camerei, timp de 30 min și reacția mix a fost alimentat cu 200 mM glutation la un raport 3:1 între oxidat și redus de forme. Active sfGFP randamentele de mobil-gratuit reacții au fost cuantificată prin măsurarea fluorescenței în-lizat și transformarea în concentrație folosind o curbă standard anterior described39. În a doua fază, glicozilarea proteică a fost inițiată prin adăugarea de MnCl2 și DDM la o concentrație finală de 10 mM și 0.,1% (w/v%), respectiv, și-a permis să procedeze la 30 °C timp de 16 h. După cum este necesar, reacțiile au fost suplimentate cu 2 µg de purificat CjPglB (de exemplu, pentru CFGpS cu LLO îmbogățit cu extracte) sau 5 µg solvent extras CjLLOs (de exemplu, pentru CFGpS cu OST îmbogățit cu extracte). Toate reacțiile au fost oprite prin adăugarea de Laemmli eșantion tampon conținând 5% ßME, după care probele au fost fierte la 100 °C timp de 15 min și analizate prin SDS-PAGE și western blotting.

analiza Western blot

probele care conțin 0,5 µg de proteină acceptor au fost încărcate în geluri SDS-PAGE., După separarea electroforetică, proteinele au fost transferate din geluri pe membrane de poliviniliden Difluorură de Imobilon-P (PVDF) (0,45 µm) în conformitate cu protocolul producătorului. Membranele au fost spălate de două ori cu tampon TBS (80 g L−1 NaCl, 20 g L−1 KCl, și 30 g L−1 Tris-bază), urmată de incubare timp de 1 h în soluție de blocare (50 g L−1 non-grăsime din lapte în TBST (TBS furnizate cu 0,05% (v/v%) Tween-20)). După blocare, membranele au fost spălate de 4 ori cu TBST cu incubare 10 min între fiecare spălare., O prima membrana a fost cercetat cu 6xHis-anticorpilor policlonali (Abcam, ab137839, 1:7500), care recunoaște în mod specific hexahistidine epitop tag-uri în timp ce o a doua replica membrana a fost cercetat cu una dintre următoarele: hR6 (1:10000) cu ser de iepure care recunoaște nativ C. jejuni și C. lari glycan precum și proiectat C. lari glycan sau ConA-HRP (Sigma, L6397, 1:2500) recunoaște că Man3GlcNac și Man3GlcNAc2. Sondarea membranelor a fost efectuată timp de cel puțin 1 oră cu agitare la temperatura camerei, după care membranele au fost spălate cu TBST în același mod ca cel descris mai sus., Pentru dezvoltare, membranele au fost incubate scurt la temperatura camerei cu substrat Western ECL (BioRad) și imaginate folosind un sistem ChemiDocTM XRS+. OST enzime îmbogățit cu extracte au fost detectate de un identice SDS-PAGE procedura urmată de testul Western blot cu o anticorpilor policlonali specifici pentru STEAGUL epitop tag (Abcam, ab49763, 1:7500). Este componentă a LLOs îmbogățit cu extracte fost detectat prin direct spotting 10 µL de extracte pe membrane de nitroceluloză, urmată de detectarea cu hR6 ser. Imaginile imunoblot neprocesate sunt prezentate în Fig suplimentar. 8.,

MS analiză

Aproximativ 2 µg de scFv13-R4DQNAT proteine în soluție a fost denaturat cu 6 M uree, redusă cu 10 mM DTT, incubate la 34 °C timp de 1 h, apoi alchilat cu 58 mM iodoacetamide pentru 45 de min la întuneric, la temperatura camerei și se stinge de finală 36 mM DTT. Soluția a fost apoi diluată cu bicarbonat de amoniu de 50 mM (pH 8,0) până la o concentrație tampon finală de 1 m uree înainte de digestia tripsinei. Proba a fost digerată cu 0,2 µg de tripsină timp de 18 ore la 37 °C. digestia a fost oprită prin adăugarea TFA la un pH final 2,2–2,5., Probele au fost apoi desalinizate cu cartuș SOLA HRP SPE (ThermoFisher Scientific). Cartușele au fost condiționate cu 1 × 0,5 mL 90% metanol, 0,1% acid trifluoroacetic (TFA) și echilibrate cu 2 × 0,5 mL 0,1% (V/V%) TFA. Probele au fost diluate 1: 1 cu 0,2% (v/V%) TFA și au trecut încet prin cartușe. După spălare cu 2 × 0,5 mL de soluție de echilibrare, peptidele au fost eluate cu 1 × 0,5 mL de 50% (v/V%) acetonitril (ACN), 0,1% (v/V%) TFA și uscate într-o centrifugă de vid de viteză.,

nanoLC–MS/MS analiză a fost efectuată folosind UltiMate3000 RSLCnano (Dionex) cuplat la o Orbitrap Fusion (ThermoFisher Scientific) spectrometru de masă echipate cu o nanospray Flex Ion Sursă. Fiecare probă a fost reconstituit în 22 µL de 0,5% (w/v%) FA și 10 µL a fost încărcat pe un Aprecieri PepMap 100 C18 capcana coloana (5 µm, 100 µm × 20 mm, 100 Å, ThermoFisher Scientific) cu nanoViper Accesorii la 20 µL min−1 de 0,5% FA de linia de desalinizare., După 2 min, supapa schimbat pentru a permite peptide să fie separate pe un Aprecieri PepMap C18 nano coloana (3 µm, 75 µm × 25 cm, ThermoFisher Scientific), în 90 min gradient de la 5 la 23% la 35% B la 300 nL min−1 (3 la 73 la 93 min, respectiv), urmată de un 9-min rampă la 90% B, a 9-min ține la 90% B și rapid comuta la 5% B în 1 min. Coloana a fost reechilibrată cu 5% B timp de 20 de minute înainte de următoarea rulare. Fuziunea Orbitrap funcționa în modul ion pozitiv cu tensiunea nanospray setată la 1,7 kV și temperatura sursei la 275 °C., Calibrarea externă pentru analizoarele de masă FT, IT și quadrupol a fost efectuată înainte de analiză. La Orbitrap plin MS sondaj de scanare (m/z 400-1800) a fost urmată de Top 3 s dependente de date de Coliziune mai Mare de disociere de produs, ion declanșat ETD (HCD-pd-ETD) MS/MS scanează pentru precursor peptide cu 2-7 taxe peste un prag ion contele de 50.000 cu normalizat energie de coliziune de 32%., MS sondaj scanează au fost achiziționate de la o putere rezolvarea de 120.000 (FWHM de la m/z 200), cu Automate de Gin Control (AGC) = 2e5 și timp maxim de injectare (Max) = 50 ms, și HCD MS/MS scanează la o rezoluție de 30.000, cu AGC = 5e4, Max = 60 ms și cu Q izolare fereastra (m/z) la 3 pentru intervalul de masă m/z 105-2000. Parametrii dinamici de excludere au fost stabiliți la 1 în 60 s durata de excludere cu ±10 ppm lățimea masei de excludere. Produsul Ion declanșa listă a constat în vârfuri la 204.0867 Da (HexNAc oxonium ion), 138.0545 Da (HexNAc fragment), și 366.1396 Da (HexHexNAc oxonium ioni)., Dacă unul dintre ionii de produs HCD din listă a fost detectat, două scanări ETD MS/MS dependente de sarcină (EThcD) cu activare suplimentară HCD (SA) pe același Ion precursor au fost declanșate și colectate într-o capcană de ioni lineară. Pentru precursorii cu sarcină dublă, timpul de reacție al ETD stabilit la 150 ms și energia SA a fost stabilit la 30%, în timp ce aceiași parametri la 125 ms și, respectiv, 20%, au fost utilizați pentru precursorii cu sarcină mai mare. Pentru ambele scanări declanșate de ioni, obiectivul reactivului fluoranten ETD a fost stabilit la 2E5, ținta AGC la 1E4, max IT la 105 ms și fereastra de izolare la 3. Toate datele au fost obținute utilizând Xcalibur 3.,0 software-ul de operare și Orbitrap Fusion Tune Application v. 2.1 (ThermoFisher Scientific).

Toate MS și MS/MS prime spectrele din fiecare probă au fost căutate folosind Byonics v. 2.8.2 (Proteine Valori) folosind E-coli proteine baza de date cu adaos de scFv13-R4DQNAT proteine secvența țintă. Peptida parametrii de căutare au fost după cum urmează: două ratat clivaj pentru full digestia cu tripsina fix carbamidomethyl modificarea cisteină, variabilă modificări de metionină oxidare, și deamidation pe asparagina/glutamina reziduuri., Toleranța la masa peptidelor a fost de 10 ppm, iar valorile toleranței la masa fragmentelor pentru spectrele HCD și EThcD au fost de 0,05 și, respectiv, 0,6 Da. Atât numărul maxim de modificări comune, cât și cele rare au fost stabilite la două. Căutarea glycan a fost efectuată pe o listă de 309 glicani n-mamifere legate în software-ul Byonic. Peptidele identificate au fost filtrate pentru maxim 2% FDR. Software-ul a exportat rezultatele căutării într-o foaie de calcul.

activitatea fluorescenței GFP

activitatea sfGFP derivată fără celule a fost determinată utilizând o analiză a fluorescenței în lizat, așa cum s-a descris anterior39., Pe scurt, 2 µL de reacție sfGFP glicozilată sintetizată fără celule a fost diluată în 48 µL de apă nanopură. Soluția a fost apoi plasată într-o placă de testare Costar 96-well black (Corning). Lungimile de undă de excitație și emisie pentru fluorescența sfGFP au fost de 485 și, respectiv, 528 nm.

Enzyme-linked immunosorbent analiză (ELISA)

Costar 96-ei bine plăci ELISA (Corning) au fost acoperite peste noapte la 4 °C cu 50 µl de 1 mg mL−1 E. coli β-gal (Sigma-Aldrich) în 0.05 M carbonat de sodiu soluție tampon (pH 9.6)., După blocarea cu 5% (w/v%) albumină serică bovină (BSA) în PBS pentru 3 h la temperatura camerei, plăcile au fost spălate de patru ori cu PBST tampon (PBS, de 0,05% (v/v%) Tween-20, cu 0,3% (w/v%) BSA) și incubate cu diluat în serie purificat scFv13-R4 probe sau solubil fracțiuni de CFGpS lysates pentru 1 h la temperatura camerei. Probele au fost cuantificate prin testul Bradford și o cantitate echivalentă de proteină totală a fost aplicată pe placă. După spălarea de patru ori cu același tampon, anticorpul policlonal de iepure conjugat anti-6×-His-HRP (Abcam) în 3% PBST a fost adăugat în fiecare godeu timp de 1 oră., Plăcile au fost spălate și dezvoltate folosind protocoale standard.

In vitro de celule de proliferare celulara

Uman eritroleucemia TF-1 celule (Sigma) care necesită granulocite–macrofage factor de stimulare a coloniei (GM-CSF), interleukina 3 (IL-3), sau jieyang pentru creșterea și supraviețuirea au fost folosite. Celulele au fost menținute în medii RPMI−1640 suplimentate cu 10% FBS, 50 U mL−1 penicilină, 50 mg mL−1 streptomicină, 2 mm glutamină și 2 ng mL-1 GM-CSF la 37 °C într-o atmosferă umidificată conținând 5% CO2., După incubarea de 16 ore în medii RPMI-1640 fără GM-CSF, celulele au fost numărate, recoltate și resuspendate în medii proaspete. 5 × 103 celule TF-1 pe godeu au fost însămânțate într-o placă de testare cu 96 de godeuri, iar standardele sau probele EPO au fost adăugate la concentrațiile finale dorite în fiecare godeu. Celulele au fost incubate timp de 6 ore in incubator umed inainte de adaugarea alamarBlue®. După 12 ore, semnalul de fluorescență a fost măsurat la lungimea de undă de excitație/emisie de 560 nm/590 nm.,

disponibilitatea datelor

toate datele generate în timpul studiului sunt incluse în acest articol și fișierele sale cu informații suplimentare și sunt disponibile de la autori la cerere rezonabilă.