locații de laborator

toate lucrările ADN care implică rudele moderne au fost efectuate la Universitatea din Leicester. De sex masculin-line rude au fost testate folosind Promega PowerPlex Y23 și pentru Snp definirea principalelor Europeană Y-haplogroups în Leicester cu un subset de dactilografiere fiind confirmat la Université Paul Sabathier. Rudele de linie feminină au fost secvențiate pentru întregul genom mitocondrial la Universitatea din Leicester., ADN-ul a fost extras din dinți și oase antice la Universitatea din York și Université Paul Sabatier, Toulouse. Pregătirea bibliotecii și îmbogățirea țintei au fost făcute la Universitatea din York. Secventierea Single-end 100-bp folosind un HiSeq 2000 (Illumina, CA, SUA) a fost efectuata la facilitatea de secventiere de la Copenhaga. Secvențierea țintită a ADN-ului modern și antic a fost, de asemenea, efectuată la platforma tehnică genomică PlaGe (Genopole, Toulouse, Franța) și la laboratorul de Chimie a acidului Nucleic proteic de la Universitatea din Leicester. Mai jos oferim o versiune condensată a metodelor utilizate., Pentru fiecare pas, informații complete pot fi găsite în metodele suplimentare. Detalii legate de cercetarea genealogică extinsă efectuată pentru acest proiect pot fi găsite în nota suplimentară 2.

colectarea probelor

ADN-ul a fost extras din probe de salivă ale rudelor moderne ale lui Richard III și toți participanții au fost recrutați cu consimțământ informat în urma revizuirii proiectului de către Comitetul de etică al cercetării Universității din Leicester.

scheletul 1 a fost excavat și probele prelevate în condiții curate37., Toți cei implicați în excavare la Grey Friars site-ul, curat laborator în Leicester și cei implicați în laboratoare și muncă de laborator a lor mitocondriale și, pentru bărbați, Y-cromozomi tastat. ADN-ul a fost extras din probele de salivă și toți participanții au fost recrutați cu consimțământul informat.

extracția ADN-ului probelor antice

ADN-ul a fost extras din dinți și oase (femur) probe. Toate procedurile au fost efectuate în laboratoare dedicate ADN antice de la Universitatea din York și Université Paul Sabatier, Toulouse, cu măsuri de precauție adecvate de contaminare., Două semifabricate de extracție au fost incluse și tratate exact ca și cum ar fi fost extrase pe parcursul întregului proces. PCR – urile și experimentele de bibliotecă au inclus, de asemenea, controale suplimentare.

testul de dactilografiere a sexului efectuat pe scheletul 1

a fost utilizat un nou test de dactilografiere a sexului care conține primeri PCR pentru co-amplificarea fragmentului SRY cu regiunile omoloage UTX și Yu. Acest test a fost conceput pentru a permite co-amplificarea fragmentelor de dimensiuni relativ mici de SRY, UTX și UTY din eșantioane susceptibile să conțină ADN degradat10.,

regiunii de control Mitocondrial analiza Scheletului 1

Analiza hypervariable segmente (HV1, HV2 și HV3) din mtDNA regiunii de control a fost efectuată prin amplificarea și direct de secvențiere multiple care se suprapun fragmente variind de la 153 la 250 bp în dimensiune (http://forensic.yonsei.ac.kr/protocol/mtDNA-midi-mini.pdf)22. O selecție de ampliconi a fost utilizată pentru clonarea produselor PCR în laboratorul din Toulouse. Secvențierea a fost efectuată folosind Terminatorul cu vopsea mare V3.,1 ciclu de secvențiere kit (applied Biosystems) și prin electroforeză capilară pe un ABI Prism 3730 Genetice Analizor (applied Biosystems) la Proteine de Acid Nucleic Laboratorul de Chimie de la Universitatea din Leicester sau la genomice platformă tehnică PlaGe (Genopole).

Mitocondrial genomul/Y-SNP/HIrisplex tastarea de Schelet 1

Biblioteci au fost construite următoarele Meyer și Kircher16, cu excepția faptului că prima filtrare pas între capătul bont de reparații și adaptor de ligatura a fost înlocuit de inactivare termică a enzymes38,39., Au fost proiectate două microarrays, unul pentru îmbogățirea mtDNA și altul pentru îmbogățirea SNP nucleară. Îmbogățirea ADN-ului a fost realizată prin captarea hibridizării utilizând microarray-ul Agilent 244k SureSelect (Agilent, Böblingen, Germania). Pentru captarea nucleară, sondele cu cromozomul Y au fost concepute pentru a acoperi SNP-urile relevante pentru principalele linii Europene14. Alte sonde au fost proiectate pentru a acoperi SNP-urile relevante pentru markerii HIrisplex31. Aceste două seturi de sonde (mitocondriale și SNP) au fost utilizate separat pentru a umple cele două modele microarray diferite de format 1 × 244k., Pentru fiecare microarray, protocolul de captare a fost efectuat după Hodges et al.15 cu modificările propuse de Zhang și colab.40 și Fortes și Paijmans38. Bibliotecile au fost grupate în cantități echimolare și secvențiate pe două benzi ale platformei Illumina HiSeq 2000 în modul 100 SE la facilitatea de secvențiere a Universității din Copenhaga, Danemarca.

citirile brute din fiecare bibliotecă au fost sortate pe baza indicelui de șase nucleotide utilizat în timpul pregătirii bibliotecii. Doar citirile cu o potrivire de 100% cu indicele au fost selectate pentru analize suplimentare., Citirile mai scurte de 25 de nucleotide au fost eliminate din analiza ulterioară. Împodobite citește au fost mapate la autozomi și cromozomi sexuali la om referință genomului construi 37 (GRCh37) și la rCRS (NC_012920.1) folosind bwa 0.7.5 o-r405 (ref. 41). În fiecare aliniere, fișierele BAM de ieșire au fost îmbinate folosind SAMtools 0.1.19 (ref. 41) și duplicatele PCR au fost eliminate ulterior. Mapate citește au fost filtrate în funcție de o cartografiere de calitate >29 și alinierea lor la poziții unice de-a lungul referință de ordine.,

Polimorfă poziții au fost identificate cu ajutorul SAMtools (SAMtools 0.1.19) și bcftools. În cele din urmă, vcfutils.pl a fost folosit pentru a filtra lista de variante în funcție de o Phred-scalate genotip posterior probabilitate de calitate >20 și o citi adâncime mai mare decât 10. Pentru a evita greșelile din cauza modelului de dezaminare a moleculelor ADN antice, toate pozițiile polimorfe raportate în fișierul de ieșire vcf au fost verificate prin ochi., În caz de genomul mitocondrial, ansamblul de referință a fost vizualizate în Tablet42, în timp ce alinierea citește conține SNPs de referință cromozomi fost vizualizate folosind IGV43.

SNP tastarea prin PCR

capturarea abordare a cedat insuficient de acoperire pentru toate HIrisPlex și Y-cromozom Snp și, prin urmare, primeri au fost concepute pentru a genera ampliconilor conțin aceste Snp, precum și două Snp, care în continuare defini Y-cromozom grupa G: M285 (G1) și P287 (G2) (ref. 14). Acestea au fost amplificate ca parte a reacțiilor multiplex după Römpler et al.,44 sau reacții singleplex (folosind 40 de cicluri și fără amplificare secundară) și secvențiate pe torrentul Ion după pregătirea bibliotecii folosind Ion PGM 200 Xpress Template Kit și PGM 200 Sequencing Kit. Pentru a crește gradul de acoperire, singleplex PCR și secvențiere de un marker (rs28777) a fost efectuată în conformitate cu Binladen et al.45

Tastarea din grupa G definirea SNPs (M201, M285 și P287) a fost repetat în Toulouse, folosind singleplex Pcr. Secvențierea acestor produse PCR a fost efectuată utilizând Terminatorul cu vopsea mare V3.,Kit de secvențiere a ciclului 1 (Applied Biosystems) analizat prin electroforeză capilară pe un analizor Genetic ABI Prism 3730 (Applied Biosystems) la platforma tehnică genomică PlaGe (Genopole).

Y-cromozomiale haplotip analiza

Antice și moderne probe’ Y-cromozomiale haplotipuri au fost obținute folosind PowerPlex Y23 System (Promega) și analizate prin electroforeză capilară pe un ABI Prism 3730 Genetice Analizor (applied Biosystems) la genomice platformă tehnică PlaGe (Genopole) și pe un ABI Prism 3130xl Genetice Analizor (applied Biosystems) de la Universitatea din Leicester., Pentru scheletul 1, Acest lucru a fost efectuat pe trei extracte separate (RM2, LM1 și LM3) în două laboratoare diferite de ADN vechi (York și Toulouse). Pentru rudele moderne, acest lucru a fost realizat pe două extracte diferite în două laboratoare moderne diferite (Leicester și Toulouse).

Y-cromozomiale SNP analiza probele moderne

în Urma stabilirii Y-haplotip pentru moderne de sex masculin-line probe, a prezis haplogrupul a fost determinată folosind Whit Aceia e haplogrupul predictor (http://www.hprg.com/hapest5/hapest5a/hapest5.htm?order=num)., Binar markeri acoperă și legate de aceste linii au fost introduse în două multiplexuri de Imagine minisequencing procedura (applied Biosystems) și o ABI3130xl Genetic Analyzer (applied Biosystems), urmată de confirmare folosind secvențiere Sanger. Somerset 3 a fost determinat a fi Hg i (M170+ M223−, M253−)14 derivat, confirmat în continuare de laboratorul din Toulouse. S-a stabilit că somersetele 1,2,4 și 5 sunt derivate pentru R1b-U152. Somersets 1,2,4 și 5 au fost testate pentru Snp împărțirea acest clade13 (Z56, M126, Z36, Z192, M160 și L2), folosind secvențiere Sanger în ambele laboratoare.,

analiza modernă mtDNA

ambele probe au fost replicate de două ori.

au fost prelevate Probe folosind Oragene ADN-ul kituri de Colectare (ADN Genotek) și ADN-ul extras folosind două metode diferite: Qiacube Sângelui și a Fluidelor protocol (200 µl 200 µl de eluție) și Oragene protocol. Pentru a analiza regiunii de control, probele au fost ordonate de două ori, atât în direcția înainte și înapoi cu ajutorul a două se suprapun grund seturi (15973-296 și 16524-614) folosind Big-Colorant Terminator V 3.1 (applied Biosystems). Nu s-au constatat diferențe între replici sau între eșantioane.,probele au fost amplificate pentru genomul mitocondrial complet din ambele extracții după Meyer et al.26 AMPLICONI PCR au fost secvențiați pe un Sequencer PGM cu Torrent Ion pe un cip Ion314. Bibliotecile au fost pregătite folosind Ion Xpress Plus gDNA Fragment Biblioteca kit de Pregătire, în timp ce modelul de pregătire și succesiunea au fost efectuate folosind Ion PGM 200 Xpress Șablon Kit și Ion PGM 200 de Secvențiere Kit, respectiv. Raw reads au fost trasate înapoi la rCRS (NC_012920.1) folosind TMAP software-ul inclus în Ion Aliniere plugin 3.2.1 (Torrent Suite Software 3.2.,1) pe serverul Torrent Ion. Duplicate citește eliminarea și apelarea variantei au fost efectuate folosind SAMtools 0.1.19 (ref. 41) și realinierea locală a fost realizată cu setul de instrumente pentru analiza Genomului46. S-au filtrat siturile variante pentru calitatea de bază 20, calitatea cartografierii 50 și adâncimea de acoperire 30 după care s-au păstrat 33 de situri polimorfe. Toate aceste site-uri au fost verificate manual și confirmate prin secvențierea Sanger în ambele direcții și replicate de două ori.,

control al Contaminării și cuantificarea

ADN-ului Modern contaminarea vestigii antice au fost controlate prin următoarele metode:

  1. 1

    Excavare a fost efectuată în condiții curate (vezi Metode Suplimentare)

  2. 2

    Probele au fost stocate în curat laboratoare și ADN-ul vechi lucrare efectuată numai în dedicate ADN vechi facilități.

  3. 3

    probe antice Separate au fost prelucrate în laboratoare separate pentru a reproduce rezultatele.,

  4. 4

    Toți Membrii laboratorului și participanții la excavare au avut ADN-ul mtdn și tastarea cromozomului Y a fost efectuată pe toți bărbații implicați. Nici unul nu a avut un mtDNA de potrivire sau de tip cromozom Y.

ca dovadă împotriva contaminării semnificative, analiza ADN a scheletului 1 arată o potrivire perfectă a mtDNA cu ML1 și o diferență de o singură bază cu ML2. De asemenea, arată un haplotip clar Y-STR, care a fost replicat folosind un număr de extracte generate și testate în două laboratoare separate., În cele din urmă, o examinare (a se vedea metodele suplimentare) a modelului de substituție din citirile noastre susține și acest lucru.folosind o abordare conservatoare la fiecare pas, am calculat o probabilitate pentru fiecare element de dovezi observate sub fiecare dintre cele două ipoteze opuse: ipoteza 1 (H1): scheletul 1 este Richard III și ipoteza 2 (H2): scheletul 1 nu este Richard III.,deoarece era rezonabil să se presupună că toate liniile diferite de dovezi erau independente, probabilitatea comună a tuturor dovezilor a fost obținută prin înmulțirea probabilității individuale sub fiecare ipoteză. Greutatea dovezilor pentru H1, numită raportul probabilității (LR), a fost apoi dată de raportul dintre probabilitatea sub H1 și cea sub H2. Spunem că o presupunere este „conservatoare” dacă reduce LR.

LR poate fi convertit într-o probabilitate ca H1 să fie adevărat, având în vedere o probabilitate anterioară., Am luat ca punct de plecare momentul în care scheletul 1 a fost observat pentru prima dată și recunoscut ca schelet uman, dar înainte de a se face orice evaluare a vârstei, sexului, stării de sănătate și cauzei decesului. În acel moment, există dovezi substanțiale că un schelet găsit în ceea ce se crede a fi fost locația Leicester Grey Friars cor ar putea fi aceea de Richard al III-lea. Toate informațiile disponibile în momentul în care Schelet 1 a fost descoperit, inclusiv locația sa exactă și natura din mormânt, a fost considerat pentru analiza informații de fond care pot informa înainte de probabilitate., Pe baza acestor informații, considerăm că un observator sceptic nu ar fi putut atribui în mod rezonabil o probabilitate anterioară mai mică de 1 din 40. Această valoare a fost propusă într-o analiză anterioară (http://rationalgareth.com/), bazată pe ceea ce considerăm a fi evaluări sceptice. Cea mai mare probabilitate care ar putea fi justificată de dovezile anterioare ar putea fi 1 din 2.

am folosit datele relevante, disponibile acolo unde este posibil. În mod inevitabil, sunt necesare judecăți subiective, de exemplu, populațiile de referință relevante și despre probabilitățile de eroare în faptele raportate., Pe cât părea posibil și rezonabil, ne-am străduit să fie conservatoare în abordarea noastră, de exemplu, folosind un pseudocount metodă de a influența LR față de o valoare neutră a 1, astfel, tendința de a evita false valori mari de joasă frecvența observată. Detaliile datelor și metodelor utilizate în analiza statistică a datelor radiocarbonului, vârsta și sexul scheletului, prezența scoliozelor, prezența rănilor perimortem, cromozomul Y și datele de frecvență mtDNA pot fi găsite în metodele suplimentare. Pentru a rezuma rezultatele: datele cu radiocarbon au dat un raport de probabilitate de 1.,84 reprezentând suport limitat pentru H1. Datele privind vârsta și sexul au dat o rație de probabilitate de 5, 25, reprezentând din nou un sprijin limitat pentru H1. Prezența unui umăr mai mare decât celălalt, raportată în timpul vieții lui Richard, ar putea fi atribuită scoliozei (scheletul 1 a avut scolioză idiopatică severă cu debut adolescent) sau altor două afecțiuni cunoscute, paralizia Erb și deformarea Sprengel, ambele fiind foarte rare. Sub H1, ratele de mai sus dau o probabilitate estimată de 0.,90 din observarea scoliozei având în vedere descrierea aspectului fizic al lui Richard al III-lea (=rata scoliozei împărțită la suma celor trei rate), pe care am înmulțit-o cu 0,95 pentru a permite posibilitatea ca descrierea înregistrată să fie incorectă. Acest lucru duce la un LR de 212, oferind un sprijin moderat puternic pentru H1. Prezența leziunilor perimortem a dat un LR de 42, și astfel un sprijin moderat pentru H1. Cromozomul Y al scheletului 1 nu se potrivea cu cel al rudelor patrilineale determinate genealogic de Richard al III-lea., Acest lucru ar putea fi explicat printr-un eveniment fals–paternitate în una sau mai multe dintre cele 19 presupuse legături tată-fiu între Richard al III-lea și Henry Somerset, al cincilea Duce de Beaufort. Rezultatele cromozomului Y indică, de asemenea, un alt eveniment fals-paternitate între Henry Somerset și cei cinci descendenți contemporani, presupuși patrilini. Pentru a fi conservator, am selectat un false publicate de paternitate rată (1) mai mici decât orice alte publicate rata pe care am considered17,47 și (2) pe baza genealogice date18., La aceasta adăugăm evenimentul fals-paternitate în 19 presupuse legături tată-fiu între Henry Somerset și cinci Somersets de sex masculin contemporan. Acest lucru dă o probabilitate de cel puțin un eveniment de paternitate fals în 19 presupuse legături tată–fiu între Richard III și Henry Somerset de 0.16. Având în vedere că un eveniment fals-paternitate trebuie să fi avut loc sub H1, frecvența populației scheletului 1 y-haplotip este aceeași sub H1 și H2 și anulează în calculul LR. Astfel, LR este 0.16, reprezentând dovezi limitate împotriva H1.,secvențele mtDNA ale scheletului 1 și presupusa rudă matrilinie 19-meioză a lui Richard al III-lea, Michael Ibsen, s-au potrivit complet. O rudă de 21-meioză se potrivește, de asemenea, cu excepția unei baze (8994). Ultima observație este la fel de probabil sub H1 și H2 având în vedere secvența observată de Michael Ibsen, și astfel anulează în LR. Astfel, avem nevoie doar de probabilități pentru observarea secvenței împărtășite de Michael Ibsen și Skeleton 1.pentru a obține probabilitatea sub H1, avem nevoie de rata mutației mtDNA, iar în acest caz estimările ridicate sunt conservatoare. Parsons și colab.,28 raportați 10 mutații ale regiunii de control în 327 de generații utilizând date genealogice. Deoarece acest lucru sugerează o rată mai mare decât alte estimări publicate și se bazează pe date genealogice, am folosit-o pentru a obține o probabilitate de 0,52 pentru nici o mutație în 19 meioză.pentru Probabilitatea sub H2, avem nevoie de fracțiunea populației din haplotipul scheletului 1. Deși am obținut secvența completă a genomului mtDNA de la scheletul 1, am identificat puține date publicate de comparație a genomului întreg din Anglia., Astfel, pentru analiza statistică am folosit doar mtDNA regiuni de control între pozițiile 16,093 și 16,320 și între 00073 și 00188, pentru care am obținut potrivit engleză compararea datelor dintr-o actualizare de Röhl et al.30, suplimentat cu secvențe mtDNA furnizate de Roots for Real (Genetic strămoș Ltd., Clare, Suffolk, Marea Britanie). Utilizarea numai a acestor secțiuni scurte ale regiunii de control sub H2 este conservatoare, deoarece fracțiunea populației din secvențele regiunii de control observate nu poate fi mai mică decât cea a genomului mtDNA complet., Populația de referință relevantă este de peste 500 de ani în trecut, dar datorită dimensiunii mari a populației în perioada luată în considerare, ne așteptăm ca frecvențele populației să se fi schimbat puțin în ultimele cinci secole. Am constatat că frecvența Haplotipului scheletului 1 este 0 între 1823 în baza de date, la care adăugăm singura instanță observată în Michael Ibsen. Această abordare este, din nou, conservatoare, deoarece Michael a fost eșantionat datorită relației sale genealogice cunoscute cu Richard III. acest lucru duce la un LR de 478 reprezentând dovezi moderat puternice pentru H1.,

de asemenea, Am observat că nu au existat meciuri într-o bază de date de 26,127 Europeană a regiunii de control mitocondrial haplotipuri (www.empop.org)29. Nu ne mai bazăm pe această bază de date, pentru că este la nivel european, mai degrabă decât specifice pentru Anglia și pentru că de constatare probleme, dar sugerează că Scheletul 1 haplotip poate fi mult mai rare decât poate fi dedusă din mai redusă în engleză baza de date. De asemenea, observăm că mobilitatea femeilor în rândul nobilimii europene este probabil să fi fost mult mai mare decât pentru populația generală, din cauza practicilor de căsătorie legate de formarea Alianței Politice., Astfel de practici ar oferi o justificare pentru utilizarea bazei de date europene mtDNA și, astfel, pentru a considera haplotipul găsit în scheletul 1 și Michael Ibsen ca fiind extrem de rar. În tabelul suplimentar 10, prezentăm câteva rezultate ilustrative utilizând baza de date Europeană pentru a demonstra implicațiile stabilirii faptului că haplotipul scheletului 1 este la fel de rar pe cât sugerează baza de date respectivă.

LRs pentru diferite combinații de dovezi, și două probabilități posterioare, sunt prezentate în tabelul suplimentar 10., Folosind toate dovezile, suportul pentru H1 este extrem de puternic, cu un LR de 6,7 milioane, astfel încât scepticul nostru ar fi condus la concluzia că probabilitatea ca scheletul 1 Să nu fie Richard III este mai mică de 1 din 100.000, în timp ce pentru cei care iau o poziție de pornire 1 în 2 probabilitatea este mult mai mică de 1 la un milion. Luând în considerare ipotezele conservatoare care stau la baza calculului nostru descris mai sus, considerăm acest lucru ca stabilind adevărul H1 fără îndoială rezonabilă.