Laboratorium steder
Alle DNA-arbeid med moderne slektninger ble utført ved University of Leicester. Hanne-line slektninger ble skrevet ved hjelp av Promega PowerPlex Y23 og for SNPs å definere de viktigste Europeiske Y-haplogroups i Leicester med et delsett av det å skrive blir bekreftet ved Université Paul Sabatier. Kvinne-linje slektninger ble sekvensert for hele mitokondrie genom ved University of Leicester., DNA ble ekstrahert fra gamle tenner og bein ved Universitetet i York, og Université Paul Sabatier, Toulouse. Biblioteket forberedelse og mål berikelse ble gjort ved University of York. Enkelt-end 100-bp-sekvensering ved hjelp av en HiSeq 2000 (Illumina, CA, USA) ble utført i København Sekvensering Anlegget. Målrettet sekvensering av både moderne og gamle-DNA ble også gjennomført på genomisk teknisk plattform PlaGe (Genopole, Toulouse, Frankrike) og på Proteiner nukleinsyre Kjemi Laboratorium ved University of Leicester. Nedenfor gir vi et sammendrag av metodene som brukes., For hvert trinn, full informasjon kan bli funnet i den Supplerende Metoder. Detaljene rundt den omfattende genealogiske undersøkelser gjennomført for dette prosjektet kan bli funnet i den Supplerende Note 2.
prøvetaking
DNA ble ekstrahert fra spytt eksempler på moderne slektninger av Richard III, og alle deltakerne ble rekruttert med informert samtykke følgende prosjekt for gjennomgang av University of Leicester forskningsetiske Komité.
Skjelett 1 ble gravd ut og prøver tatt under rene conditions37., Alle som er involvert i den utgraving i Grå Friars nettstedet, er de rene laboratorium i Leicester, og de som er involvert i laboratorier og labwork hadde sine mitokondrie og, for menn, Y-kromosomer skrev inn. DNA ble ekstrahert fra spytt prøver og alle deltakerne ble rekruttert med informert samtykke.
DNA-ekstraksjon av gamle prøver
– DNA ble ekstrahert fra tenner og bein (femur) prøver. Alle prosedyrer ble utført i dedikert gamle DNA-laboratorium ved University of York og Université Paul Sabatier, Toulouse, med rette forurensning forsiktighetsregler på plass., To utvinning feltene var inkludert og behandlet akkurat som om de var ekstrakter gjennom hele prosessen. Pcr-er og bibliotek eksperimenter også inkludert ytterligere blank kontroller.
Sex-skrive-analysen er utført på Skjelettet 1
En nyutviklet sex-skrive-analysen består av PCR-primere for co-amplifikasjon av SRY-fragment med UTX og UTY homologe regioner ble brukt. Denne analysen ble utviklet for å aktivere relativt liten størrelse fragmenter av SRY, UTX og UTY å være co-forsterket fra prøvene sannsynlig å inneholde dårligere DNA10.,
Mitokondrie-kontroll-regionen analyse av Skjelettet 1
Analyse av den hypervariable segmenter (HV1, HV2 og HV3) av mtDNA-kontroll-regionen ble gjennomført ved å forsterke og direkte sekvensering av flere overlappende fragmenter alt fra 153 250 bp i størrelse (http://forensic.yonsei.ac.kr/protocol/mtDNA-midi-mini.pdf)22. Et utvalg av amplikoner ble brukt til kloning av PCR-produkter i lab i Toulouse. Sekvensering ble utført ved hjelp av Store-Dye Terminator V3.,1 syklus sekvensering kit (Applied Biosystems) og ved kapillær elektroforese på en ABI Prism 3730 Genetiske Analyser (Applied Biosystems) på Proteiner nukleinsyre Kjemi Laboratorium ved University of Leicester eller på genomisk teknisk plattform PlaGe (Genopole).
Mitokondrie genom/Y-SNP/HIrisplex å skrive av Skjelettet 1
Bibliotek ble bygget følge Meyer og Kircher16, med unntak av at den første filtrering trinn mellom den butte enden reparasjon og adapter ligation ble byttet ut med varme inaktivering av enzymes38,39., To microarrays ble utformet, en for mtDNA berikelse og en annen for kjernefysisk SNP berikelse. DNA berikelse ble utført av hybridisering ta med Agilent 244k DNA SureSelect microarray (Agilent, Böblingen, Tyskland). For kjernefysisk fange, Y-kromosom prober ble utformet for å dekke SNPs relevante i forhold til de store Europeiske lineages14. Videre prober ble utformet for å dekke SNPs relevant for HIrisplex31 markører. Disse to sett av prober (mitokondrie og SNPs) ble brukt hver for seg for å fylle to forskjellige microarray design av en 1 × 244K format., For hver microarray, fangst-protokollen ble utført følgende Hodges et al.15 med de endringer som er foreslått av Zhang et al.40 og Fortes og Paijmans38. Bibliotekene ble sammenslått i ekvimolare mengder og sekvensert på to kjørefelt av Illumina HiSeq 2000-plattformen i 100 SE-modus ved sekvensering innretningen av Universitetet i København, Danmark.
The raw leser fra hvert bibliotek ble sortert basert på den seks-nukleotid-indeksen som brukes i biblioteket forberedelse. Leser bare med en 100% match til indeksen ble valgt for videre analyser., Leser kortere enn 25 nukleotider ble forkastet fra videre analyse. Den trimmede leser ble kartlagt for å autosomes og sex kromosomer fra den menneskelige referanse genom bygge 37 (GRCh37) og til rCRS (NC_012920.1) ved hjelp av bwa 0.7.5 en-r405 (ref. 41). I hver justering, utgang bam-filer som ble slått sammen ved hjelp av SAMtools 0.1.19 (ref. 41) og PCR-duplikater ble fjernet i ettertid. Den tilordnede leser ble filtrert basert på en kartlegging kvalitet >29 og deres justering til unike posisjoner langs referanse rekkefølge.,
Polymorf stillinger ble identifisert ved hjelp av SAMtools (SAMtools 0.1.19) og bcftools. Til slutt, vcfutils.pl ble brukt for å filtrere listen av varianter i henhold til en Phred-skalert genotype posterior sannsynlighet kvalitet >20 og les dybde høyere enn 10. For å unngå miscalling på grunn av deamination mønster av gamle DNA-molekyler, alle polymorf stillinger rapportert i vcf-filen ble sjekket av øyet., I tilfelle av mitokondrie genom, montering til det ble visualisert i Tablet42, mens justering av lyder som inneholder SNPs til referanse-kromosomer ble visualisert ved hjelp av IGV43.
SNP-typing av PCR
fangst tilnærming gir tilstrekkelig dekning for alle HIrisPlex og Y-kromosom SNPs og derfor primere var utformet for å generere amplikoner som inneholder disse SNPs samt to SNPs, noe som ytterligere definerer Y-kromosom haplogroup G: M285 (G1) og P287 (G2) (ref. 14). Disse ble forsterket som en del av multiplex reaksjoner følgende Römpler et al.,44 eller singleplex reaksjoner (med 40 sykluser og med ingen sekundær amplification) og sekvensert på Ion Torrent følgende bibliotek forberedelse med Ion PGM 200 Xpress Mal Kit og PGM 200 Sekvensering Kit. For å øke dekningen, singleplex PCR og sekvensering av en markør (rs28777) ble gjennomført i henhold til Binladen et al.45
å Skrive av haplogroup G definere SNPs (M201, M285 og P287) ble gjentatt i Toulouse ved hjelp av singleplex pcr-er. Sekvensering av disse PCR-produktene ble utført ved hjelp av Store-Dye Terminator V3.,1 syklus sekvensering kit (Applied Biosystems) analysert ved kapillær elektroforese på en ABI Prism 3730 Genetiske Analyser (Applied Biosystems) på genomisk teknisk plattform PlaGe (Genopole).
Y-kromosom-haplotype analyse
Gamle og moderne prøvene’ Y-kromosom haplotypes ble innhentet ved hjelp av den PowerPlex Y23 System (Promega) og analysert av kapillær elektroforese på en ABI Prism 3730 Genetiske Analyser (Applied Biosystems) på genomisk teknisk plattform PlaGe (Genopole) og på en ABI Prism 3130xl Genetic Analyzer (Applied Biosystems) ved Universitetet i Leicester., For Skjelettet 1, dette ble utført på tre ulike ekstrakter (RM2, LM1 og LM3) i to forskjellige gamle DNA-laboratorier (York og Toulouse). For den moderne slektninger, dette ble gjennomført på to ulike ekstrakter i to forskjellige moderne laboratorier (Leicester og Toulouse).
Y-kromosom-SNP-analyse av moderne prøvene
Følgende bestemmelse av Y-haplotype for den moderne mann-linje-prøvene, spådde haplogroup ble fastsatt ved hjelp av Whit De er haplogroup prediktor (http://www.hprg.com/hapest5/hapest5a/hapest5.htm?order=num)., Binære markører som dekker disse og beslektede linjene ble skrevet inn i to multiplexes av SNaPshot minisequencing prosedyre (Applied Biosystems) og en ABI3130xl Genetiske Analysatoren (Applied Biosystems) etterfulgt av bekreftelse med Sanger-sekvensering. Somerset 3 var fast bestemt på å være Hg jeg (M170+ M223−, M253−)14 avledet, ytterligere bekreftet ved laboratoriet i Toulouse. Somersets 1,2,4 og 5 ble bestemt til å være avledet for R1b-U152. Somersets 1,2,4 og 5 ble testet for SNPs sondring dette clade13 (Z56, M126, Z36, Z192, M160 og L2) med Sanger-sekvensering i både labs.,
Moderne mtDNA-analyse
Begge prøvene ble gjentatt to ganger.
Prøvene ble tatt ved hjelp av Oragene DNA-Collection kit (DNA Genotek) og DNA ekstrahert ved hjelp av to forskjellige metoder: Qiacube Blodet og Kroppens Væske-protokollen (200 µl med 200 µl elution) og Oragene protokollen. For å analysere kontroll regionen, prøver ble sekvensert to ganger i både forover og revers ved hjelp av to overlappende primersett (15973-296 og 16524-614) ved hjelp av Store-Dye Terminator V 3.1 (Applied Biosystems). Ingen forskjeller ble funnet mellom replikater eller mellom prøvene.,
Prøvene ble forsterket for fullstendig mitokondrie genome fra både utdrag følgende Meyer et al.26 PCR amplikoner ble sekvensert på en Ion Torrent PGM Sequencer på en Ion314 Chip. Bibliotekene var forberedt på å bruke Ion Xpress Pluss gDNA-Fragment Bibliotek Forberedelse kit, mens mal for utarbeidelse og sekvensering ble utført ved hjelp av Ion PGM 200 Xpress Mal Kit og Ion PGM 200 Sekvensering Kit, henholdsvis. Raw-leser ble kartlagt tilbake til rCRS (NC_012920.1) ved hjelp av TMAP programvare inkludert i Ion-Justering plugin 3.2.1 (Torrent Suite-Programvaren 3.2.,1) på Ion Torrent-server. Duplikat leser fjerning og en variant ringer ble utført ved hjelp av SAMtools 0.1.19 (ref. 41) og lokale igjen ble gjennomført med Genom Analyse Verktøyet Kit46. Variant steder ble filtrert for Base Kvalitet 20, Kartlegging av Kvalitet på 50 og Dybde i Dekningen 30 følgende hvorav 33 polymorf områder ble beholdt. Alle disse områdene har blitt manuelt kontrollert og bekreftet av Sanger-sekvensering i begge retninger og gjentatt to ganger.,
Forurensning kontroll og kvantifisering
Moderne DNA-kontaminering av den gamle restene ble kontrollert for ved følgende metoder:
- 1
Utgravning ble gjennomført under rene forhold (se Utfyllende Metoder)
- 2
Prøvene ble lagret i ren laboratorier og gamle DNA-arbeide utføres kun i egne gamle DNA-fasiliteter.
- 3
Separate gamle prøvene ble behandlet i egne laboratorier for å replikere resultatene.,
- 4
Alle lab medlemmer og utgraving deltakerne hadde sitt mtDNA skrevet og Y-kromosomet å skrive inn ble gjennomført på alle menn som er involvert. Ingen hadde en matchende mtDNA-eller Y-kromosom type.
Som bevis mot betydelig forurensning, DNA-analyse av Skjelettet 1 viser en perfekt mt-dna match til ML1 og en single-base forskjellen med ML2. Det viser også en klar Y-STR haplotype, som har blitt kopiert ved hjelp av en rekke ekstrakter laget og testet i to separate labs., Til slutt, en undersøkelse (se Utfyllende Metoder) av substitusjon mønster i vår leser også støtter dette.
Statistiske analyser
Ta en konservativ tilnærming på hvert trinn, har vi beregnet en sannsynlighet for hvert element av observert bevis under hver av to motstridende hypoteser: Hypotese 1 (H1): Skjelett 1 er Richard III, og Hypotese 2 (H2): Skjelett 1 er ikke Richard III.,
Som det var rimelig å anta at alle de forskjellige linjene av bevis ble uavhengig, felles sannsynligheten for at alle bevisene var innhentet ved multiplikasjon av den enkelte likelihoods under hver hypotese. Vekten av bevis for H1, kalt likelihood ratio (LR), ble da gitt ved forholdet mellom sannsynligheten under H1 til at under H2. Vi sier at en forutsetning er ‘konservative’ hvis det reduserer LR.
LR kan konverteres til en sannsynlighet for at H1 er sann, er det gitt en før sannsynlighet., Vi tok som utgangspunkt i det øyeblikket at Skjelettet 1 ble observert og gjenkjent som et menneskelig skjelett, men før noen vurderinger av alder, kjønn, helsetilstand og dødsårsaken ble gjort. På dette punktet, var det betydelige bevis for at et skjelett som ble funnet i det som er antatt å ha blitt plasseringen av Leicester Grå Friars kor kan være at Richard III. All informasjon som er tilgjengelig på det tidspunktet at Skjelettet 1 ble avdekket, inkludert dens nøyaktige posisjon og arten av graven, ble ansett for denne analysen som bakgrunnsinformasjon som kan informere før sannsynlighet., På grunnlag av denne informasjonen, mener vi at en skeptisk observatør ikke med rimelighet kunne tildelt en tidligere sannsynlighet mindre enn 1 i 40. Denne verdien ble foreslått i en tidligere analyse (http://rationalgareth.com/), basert på det vi vurderer til å være skeptisk vurderinger. Den høyeste sannsynligheten for at kunne bli rettferdiggjort ved skriftlig bevis kan være 1, 2.
Vi har brukt relevante, tilgjengelige data der det er mulig. Uunngåelig subjektive vurderinger er nødvendig, for eksempel relevant referanse bestander, og om sannsynligheten for feil i rapporterte fakta., Så langt som syntes det er mulig og rimelig, vi prøvde å være konservativ i vår tilnærming, for eksempel ved hjelp av en pseudocount metode for å påvirke LR mot en nøytral verdi av 1, og dermed har en tendens til å unngå falske store verdier fra lave observerte frekvenser. Detaljer av dataene og metodene som brukes i statistiske analyser av radiocarbon data, alder og kjønn på skjelett, tilstedeværelse av skoliose, tilstedeværelse av perimortem sår, Y-kromosom og mtDNA frekvens data kan bli funnet i den Supplerende Metoder. For å oppsummere resultater: radiocarbon data ga en likelihood-ratio på 1.,84 representerer begrenset støtte for H1. Alder og kjønn data gitt en sannsynlighet rasjon av 5.25, igjen representerer begrenset støtte for H1. Tilstedeværelsen av en skulder høyere enn den andre, rapportert i løpet av Richard levetid, som kunne tilskrives skoliose (Skjelett 1 hadde alvorlig idiopatisk ungdom-utbruddet skoliose) eller to andre kjente forhold, Erb ‘ s Parese og Sprengel er misdannelse, som begge er svært sjeldne. Under H1, ovennevnte priser gi en estimert sannsynlighet for 0.,90 observere skoliose gitt beskrivelse av Richard III er fysisk utseende (=den skoliose rate dividert med summen av de tre priser), som vi multiplisert med 0.95 å tillate muligheten for at den registrerte beskrivelse var feil. Dette fører til en LR 212, gir moderat sterk støtte for H1. Tilstedeværelsen av perimortem skader ga en LR 42, og så moderat støtte for H1. Y-kromosomet av Skjelettet 1 samsvarer ikke at genealogically bestemt patrilineal slektninger av Richard III., Dette kan forklares med et falskt farskap hendelse i ett eller flere av de 19 antatte far–sønn forholdet mellom Richard III og Henry Somerset, femte Hertugen av Beaufort. Y-kromosomet resultatene viser også en ytterligere false-farskap hendelse mellom Henry Somerset og hans fem moderne, antatte patrilinear etterkommere. For å være konservative, vi valgte en publisert falske farskap pris som var (1) lavere enn noen andre offentliggjorte prisen vi considered17,47 og (2) basert på genealogiske data18., Til dette legger vi den falske-farskap hendelse i 19 antatte far–sønn-koblinger mellom Henry Somerset og fem moderne mannlige Somersets. Dette gir en sannsynlighet på minst ett falskt farskap hendelse i 19 antatte far–sønn forholdet mellom Richard III og Henry Somerset av 0.16. Gitt at en forfalskning-farskap hendelsen må ha skjedd under H1, befolkningen hyppigheten av Skjelett-1 Y-haplotype er den samme under H1 og H2 og går ut i LR beregning. Dermed LR er 0.16, som representerer begrenset bevis mot H1.,
mtDNA sekvenser av Skjelettet 1 og den antatte 19-meiose matrilinear slektning av Richard III, Michael Ibsen, matchet helt. En 21-meiose relative også matchet med unntak av på en base (8994). Sistnevnte observasjon er like sannsynlige under H1 og H2 gitt den observerte sekvens av Michael Ibsen, og så går ut i LR. Dermed trenger vi bare likelihoods for observasjon av den sekvensen som er delt av Michael Ibsen og Skjelett 1.
for Å få tak sannsynligheten under H1, krever vi mtDNA mutasjon pris, og i dette tilfellet høye estimatene er konservative. Parsons et al.,28 rapport 10 kontroll regionen mutasjoner i 327 generasjoner med genealogiske data. Fordi dette tyder på en høyere rente enn andre publiserte estimater, og er basert på genealogiske data, har vi brukt det til å utlede en sannsynlighet på 0.52 for ingen mutasjon i 19 meioses.
For sannsynligheten under H2, krever vi at befolkningen brøkdel av Skjelettet 1 haplotype. Selv om vi fikk fullføre mtDNA genome sequence fra Skjelettet 1, oppdaget vi litt publisert hel-genom sammenligningen av data fra England., Dermed for statistisk analyse, vi brukte bare mtDNA kontroll regioner mellom posisjoner 16,093 og 16,320 og mellom 00073 og 00188, for som vi innhentet egnet engelsk sammenligningen av data fra en oppdatering av Röhl et al.30, supplert med mtDNA sekvenser som følger av Røtter for Real (Genetiske Forfedre Ltd. Clare, Suffolk, UK). Bruker bare disse korte deler av kontrollområdet under H2 er konservativ, siden befolkningen brøkdel av de observerte kontroll regionen sekvenser kan ikke være mindre enn full mtDNA genom., Relevant referanse befolkningen som er over 500 år i det siste, men på grunn av den store befolkningen størrelse i løpet av perioden som betraktes, forventer vi at befolkningen frekvenser til å ha endret seg lite over de siste fem århundrer. Vi fant at hyppigheten av Skjelett 1 haplotype til å være 0, blant 1823 i databasen, der vi legge til en forekomst observert i Michael Ibsen. Denne tilnærmingen er, igjen, konservative som Michael var samplet på grunn av hans kjente genealogiske forhold til Richard III. Dette fører til en LR av 478 representerer moderat sterke bevis for H1.,
Vi har også bemerket at det ikke var noen kamper i en database med 26,127 Europeiske mitokondrie-kontroll-regionen haplotypes (www.empop.org)29. Vi må ikke stole på denne databasen fordi det er Europa-omfattende snarere enn spesifikke for England og på grunn av ascertainment problemer, men det tyder på at Skjelettet 1 haplotype kan være mye sjeldnere enn det som kan utledes fra våre mindre engelsk database. Vi ser også at kvinnelige mobilitet blant de Europeiske adelen er trolig vært mye høyere enn for befolkningen generelt, på grunn av ekteskap praksis knyttet til politisk allianse-formasjonen., En slik praksis ville gi noen begrunnelse for å bruke den Europeiske mt-dna database, og så vurderer haplotype som finnes i Skjelettet 1 og Michael Ibsen til å være svært sjelden. I Supplerende Tabell 10 viser vi noen illustrerende resultat ved hjelp av den Europeiske databasen for å demonstrere betydningen av å etablere at Skjelettet 1 haplotype er like sjeldne som foreslått av at databasen.
Writers for ulike kombinasjoner av bevis, og to bakre sannsynligheter, er vist i Supplerende Tabell 10., Ved hjelp av alle bevisene, støtte for H1 er ekstremt sterk med en LR på 6,7 millioner kroner, slik at våre skeptiker ville bli kjørt til den konklusjon at sannsynligheten for at Skjelettet 1 er ikke Richard III er mindre enn 1 i 100 000 dollar, mens for de som tar en 1 i 2 startposisjon at sannsynligheten er mye mindre enn 1 i en million. Å ta hensyn til den konservative forutsetninger underliggende vår beregning er beskrevet ovenfor, anser vi dette som å etablere sannheten av H1 utover rimelig tvil.