Bakterielle stammer og plasmider

følgende E. coli stammer som ble brukt i denne studien: DH5a, BL21(DE3) (Novagen), CLM24, og Origami2(DE3) gmd::håkan ΔwaaL. DH5a ble brukt for plasmider kloning og rensing., BL21(DE3) ble brukt for uttrykk og rensing av scFv13-R4DQNAT akseptor protein som ble brukt i alle in vitro glycosylation reaksjoner. CLM24 er en glyco-optimalisert derivat av W3110 som bærer en sletting i genkode de WaaL ligase, og dermed legge til rette for akkumulering av ferdigmonterte glycans på Und-PP36. CLM24 ble brukt for rensing av CjOST enzym, organisk løsemiddel-basert utvinning av alle LLO sbearing bakteriell glycans, og kilden belastning for utarbeidelse av ekstrakter med og uten selektivt beriket glycosylation komponenter., Origami2(DE3) gmd::håkan ΔwaaL ble brukt for å produsere Man3GlcNAc2 rentebærende LLOs og ble generert ved sekvensiell mutasjon med P1vir phage transduksjon ved hjelp av de respektive stammer fra Keio collection62 som givere, som ble innhentet fra Coli Genetisk Lager Center (CGSC). I korte trekk, donor lysate ble generert fra stamme JW3597-1 (ΔrfaL734::håkan) og den resulterende phage ble brukt til å infisere Origami2(DE3) målceller., Etter plating transformants på LB plater som inneholder kanamycin (Kan), vellykket transductants ble valgt, og deres motstand Kan kassetter ble fjernet ved å omforme med temperatur-sensitive plasmider pCP2063. Den resulterende belastning, Origami2(DE3) ΔwaaL, ble deretter brukt for påfølgende sletting av gmd gen i henhold til en identisk strategi, men ved hjelp av donor belastning JW2038-1 (Δgmd751::håkan).

Alle plasmider som brukes i studiet er oppført i Supplerende Tabell 2. Plasmider ble bygget i denne studien ble utført ved bruk av standard kloning protokoller og bekreftet ved DNA-sekvensering., Disse omfattet følgende. Plasmider pJL1-scFv13-R4DQNAT ble generert ved først PCR-amplifisering genkode scFv13-R4DQNAT fra pET28a-scFv13-R4(N34L, N77L)DQNAT, hvor N34L og N77L mutasjoner ble innført for å eliminere mulige interne glycosylation nettsteder i scFv13-R452. Den resulterende PCR-produktet ble deretter ligated mellom NcoI og SalI begrensning nettsteder i plasmider pJL1, en pET-baserte vector brukes for CFPS49. Plasmider pJL1-sfGFP217-DQNAT ble generert av ligating et kommersielt fremstilt DNA-fragment koding sfGFP217-DQNAT (Integrert DNA-Teknologi) i pJL1., Denne versjonen av sfGFP inneholder en ekstra GT innsetting etter K214, som strekker seg denne fleksible loop før den siste beta sheet64. I denne fleksible loop, umiddelbart etter T216, vi podet en 21-aminosyre-sekvensen som inneholder C. jejuni AcrA N123 glycosylation site34, men med en optimal DQNAT sequon i stedet for den opprinnelige AcrA sequon. Lignende prosedyrer ble brukt til å generere plasmider pJL1-sfGFP217-AQNAT, pJL1-hEPO22-DQNAT-26, pJL1-hEPO36-DQNAT-40, og pJL1-hEPO81-DQNAT-85., I tilfelle av pJL1-hEPO22-DQNAT-26, genet for modne menneske EPO ble utformet slik at de innfødte sequon på N24 ble endret fra 22-AENIT-26 til en optimal bakteriell sequon, DQNAT. Identiske kloning strategier ble gjennomført separat innføre optimale DQNAT motiver i stedet for den opprinnelige hEPO sequons 36-NENIT-40 og 81-LVNSS-85. Rekombinant uttrykk for E. coli O9 primer-adapter glycan (Man3GlcNAc) på Und-PP ble oppnådd ved kloning av gener koding av WbdB og WbdC mannosyltransferase enzymer utvunnet fra E., coli ATCC31616 for montering glycan, og RfbK og RfbM, også hentet fra E. coli ATCC31616 for å øke utvalget av tilgjengelige BNP-mannose, i E. coli MG1655. Plasmider pConYCGmCB ble bygget av isotermisk Gibson montering og blir en kunstig operon består av: (i) gjær glycosyltransferases Alg13, Alg14, Alg1, og Alg2 for Man3GlcNAc2 glycan biosynthesis12 og (ii) E. coli enzymer phosphomannomutase (ManB) og mannose-1-fosfat guanylyltransferase (ManC), som sammen øke tilgjengeligheten av BNP-mannose underlag for Alg1 og Alg2 enzymer.,

Protein uttrykk og rensing

Rensing av CjPglB ble utført i henhold til en tidligere beskrevet protocol34. Kort, en enkelt koloni av E. coli CLM24 bærer plasmider pSN1865 var vokst over natten ved 37 °C i 50 mL av Luria-Bertani (LB; 10 g L−1 tryptone, 5 g L−1 gjær ekstrakt, 5 g L−1 NaCl, pH 7.2) supplert med ampicillin (Amp) og 0,2% (w/v%) d-glukose. Over natten celler ble subcultured inn 1 L fersk kjempefint buljong (TB; 12 g L−1 tryptone, 24 g L−1 gjær ekstrakt, 0.4% (v/v%) glyserol, 10% (v/v%) 0.17 M KH2PO4/0.,72 M K2HPO4 fosfat buffer), supplert med Forsterker og vokst til absorbansen ved 600 nm (Abs600) nådde en verdi på ~0.7. Den inkubasjonstemperatur ble justert til 16 °C, etter som protein uttrykk ble indusert ved tillegg av l-arabinose til en endelig konsentrasjon på 0,02% (w/v -%). Protein uttrykk fikk lov til å gå videre for 20 timer ved 16 °C. Cellene ble høstet ved sentrifugering og så forstyrret ved hjelp av en homogenizer (Avestin C5 EmulsiFlex). Den lysate var sentrifugerte å fjerne celle rusk og supernatanten ble ultracentrifuged (100,000×g) for 2 h ved 4 °C., Den resulterende pellets som inneholder membranen brøkdel var fullt resuspendert med en Potter-Elvehjem vev homogenizer i buffer som inneholder 50 mM HEPES, 250 mM NaCl, 10% (v/v%) glyserol, og 1% (w/v%) n-dodecyl-β-d-maltoside (DDM) ved pH 7.5. Suspensjonen ble inkubert ved romtemperatur i 1 h for å legge til rette vaskemiddel solubilization av CjPglB fra native E. coli lipider, som ble fjernet med påfølgende ultracentrifugation (100,000×g) for 1 t ved 4 °C., Supernatanten inneholder DDM-solubilisert CjPglB ble renset ved hjelp av Ni-NTA harpiks (Termo) i henhold til produsentens spesifikasjoner med unntak av at alle buffere ble supplert med 1% (v/v%) DDM. Den elution brøkdel fra Ni-NTA rensing ble deretter utsatt til størrelse utelukkelse kromatografi (SEK) ved hjelp av en ÄKTA Explorer FPLC system (GE Healthcare) med Superdex 200 10/300 GL-kolonnen. Renset protein som var lagret på en endelig konsentrasjon på 1-2 mg mL−1 i OST lagring buffer (50 mM HEPES, 100 mM NaCl, 5% (v/v%) glyserol, 0.01% (w/v%) DDM, pH 7.5) ved 4 °C., Glyserol konsentrasjon i prøven ble justert til 20% (v/v%) for langsiktig lagring ved -80 °C.

Rensing av akseptor protein scFv13-R4DQNAT ble utført som beskrevet previously52. Kort, E. coli stamme BL21(DE3) balanseført plasmider pET28a-scFv13-R4(N34L, N77L)DQNAT ble dyrket i 1 L av TB som følger med kanamycin. Kulturen ble inkubert ved 37 °C til Abs600 nådd ~0.7, på hvilket tidspunkt protein uttrykk ble indusert ved tillegg av isopropyl-β-d-1-thiogalactopyranoside (IPTG) til en endelig konsentrasjon på 0,1 mM. Protein uttrykk fikk lov til å gå videre for 20 timer ved 25 °C., Cellene ble høstet og forstyrret identisk som beskrevet ovenfor. Den scFv13-R4DQNAT protein ble renset ved hjelp av Ni-NTA harpiks etterfulgt av SEK i henhold til produsentens protokoller. Protein ble lagret på en endelig konsentrasjon på 1-2 mg mL−1 lagring i buffer (50 mM HEPES, 250 mM NaCl, 1 mM EDTA, pH 7.5) ved 4 °C.

Utvinning av LLOs

protokollen for organiske løsemidler utvinning av LLOs fra E. coli membraner ble tilpasset fra et tidligere beskrevet protocol34,66., I de fleste tilfeller, en enkelt koloni av belastning CLM24 bærer en plasmider for mål-glycan biosyntese (Supplerende Tabell 2) ble dyrket over natten i LB media. De unntak var LLOs bærer W. succinogenes N-glycan (WsLLOs), som ble produsert ved hjelp av DH5a celler som bærer pEpiFOS-5pgl5 fosmid (bes oppgitt ved Dr. Markus Aebi), og LLO sbearing Man3GlcNAc2, som ble produsert ved hjelp av Origami2(DE3) gmd::håkan ΔwaaL cellene bærer plasmider pConYCGmCB. Over natten celler ble subcultured inn 1 L av TB supplert med en passende antibiotika og vokst til Abs600 nådd ~0.7., Den inkubasjonstemperatur ble justert 30 °C for biosyntese av alle glycans bortsett fra Man3GlcNAc2, som var justert til 16 °C. For plasmider pMW07-pglΔB, protein uttrykk ble indusert med l-arabinose på en endelig konsentrasjon på 0,2% (w/v%), mens for fosmid pEpiFOS-5pgl5 induksjon var med isopropyl-β-d-1-thiogalactopyranoside (IPTG) til en endelig konsentrasjon på 1 mM. Alle andre plasmider involvert konstituerende arrangører, og dermed ikke krever kjemiske indusere. Etter 16 h, cellene ble høstet ved sentrifugering og celle pellets var lyofiliserte å fullføre tørr ved -70 °C., For utvinning av CjLLOs, naturlig og konstruert ClLLOs, E. coli O9 primer-adapter LLOs, og WsLLOs, den lyophilisates ble suspendert i 10:20:3 volumetriske forhold av CHCl3:CH3OH:H2O løsning og inkubert ved romtemperatur i 15 min til rette for utvinning av LLOs. For utvinning av LLO sbearing Man3GlcNAc2 glycan, lyophilisate var suksessivt suspendert i 10:20 (v/v%) CHCl3:CH3OH løsning, vann, 10:20:3 CHCl3:CH3OH:H2O løsning med 15 min inkubasjon ved romtemperatur mellom hvert trinn., I hvert fall, de siste suspensjon var sentrifugerte (4000×g) i 15 min, etter som den organiske layer (nedre lag) ble samlet inn og tørket med et vakuum konsentrator etterfulgt av lyophilization. Lyophilisates inneholder aktive LLOs ble resuspendert i celle-gratis glycosylation buffer (10 mM HEPES, pH 7,5 og 10 mM MnCl2, og 0,1% (w/v%) DDM) og lagret ved 4 °C.

Utarbeidelse av råolje S30 ekstrakter

CLM24 kilde stammer som ble dyrket i 2×YTPG (10 g L−1 gjær ekstrakt, 16 g L−1 tryptone, 5 g L−1 NaCl, 7 g L−1 K2HPO4, 3 g L−1 KH2PO4, 18 g L−1 glukose, pH 7.2) til Abs600 nådd ~3., For å generere OST-beriket ekstrakt, CLM24 bærer plasmider pSF-CjPglB, pSF-CcPglB, pSF-DdPglB, pSF-DgPglB, eller pSF-DvPglB52 ble brukt som kilde belastning. For å generere LLO-beriket ekstrakt, CLM24 bærer plasmider pMW07-pglΔB ble brukt som kilde belastning. For å generere en-potten ekstrakt som inneholder både OST og LLOs, CLM24 bærer pMW07-pglΔB og pSF-CjOST ble brukt som kilde belastning. Som nødvendig, uttrykk for glycosylation komponenter ble indusert med l-arabinose på endelig konsentrasjon av 0.02% (w/v -%)., Etter induksjon, protein uttrykk fikk lov til å fortsette på 30 °C til en tetthet av OD600 ~3, da cellene ble høstet ved sentrifugering (5000 x g ved 4 °C i 15 min. Alle etterfølgende trinn ble gjennomført ved 4 °C, med mindre annet er angitt. Pelletert cellene ble vasket tre ganger i S30-buffer (10 mM tris acetat, 14 mM magnesium acetat, 60 mM kalium acetat, pH 8.2). Etter siste vask, celler ble pelletert på 7000×g i 10 min og flash-fryst på flytende nitrogen. For å gjøre lysate, celler ble tint og resuspendert til homogenitet i 1 mL av S30-buffer per 1 g våt cellemassen., Cellene ble forstyrret ved hjelp av en Avestin EmulsiFlex-B15 høyt trykk homogenizer på 20 000–25 000 chips psi med en enkelt passering. Den lysate var så sentrifugerte to ganger på over 30 000×g i 30 min for å fjerne celle rusk. Supernatanten ble overført til en ny båt og inkubert med 250 rpm risting ved 37 °C i 60 min til å forringe endogene mRNA transkripter og forstyrre eksisterende polysome komplekser i lysate. Etter sentrifugering (mer enn 15 000×g) i 15 min ved 4 °C. supernatanten ble samlet inn, alikvotert, flash-frosset i flytende nitrogen, og lagret ved -80 °C., S30 ekstrakt var aktiv i ca tre fryse-tine sykluser og inneholdt ~40 g L−1 total protein målt ved Bradford-analysen.

Celle-gratis glykoprotein syntese

For in vitro glycosylation av renset akseptor protein, reaksjoner er blitt gjennomført i en 50 µL volum som inneholder 3 µg av scFv13-R4DQNAT, 2 µg renset CjPglB, og 5 µg hentet LLOs (i tilfelle av Man3GlcNAc2 LLOs, 20 µg ble brukt) i in vitro glycosylation buffer (10 mM HEPES, pH 7,5 og 10 mM MnCl2, og 0,1% (w/v%) DDM). Reaksjonsblandingen ble inkubert ved 30 ° C i 16 h., For råolje ekstrakt-basert uttrykk for glycoproteins, en to-fase ordningen ble innført. I den første fasen, protein syntese ble gjennomført med en modifisert PANOx-SP system67. Spesielt, 1,5 mL mikrosentrifuge rørene ble belastet med 15-µL reaksjoner som inneholder 200 ng plasmider DNA, 30% (v/v%) S30-ekstrakt og følgende: 12 mM magnesium glutamat, 10 mM ammonium glutamat, 130 mM kalium glutamat, 1,2 mM adenosin trifosfat (ATP), 0.85 mM guanosine trifosfat (GTP), 0.85 mM uridine trifosfat (UTP), 0.85 mM cytidine trifosfat (CTP), 0.034 mg mL−1 folinic syre, 0.,171 mg mL−1 E. coli tRNA (Roche), 2 mM hver av 20 aminosyrer, 30 mM phosphoenolpyruvate (PEP, Roche), 0.4 mM nikotinamid adenine dinucleotide (NAD), 0.27 mM koenzym-A (CoA), 4 mM oksalsyre, 1 mM putrescine, 1,5 mM spermidine, og 57 mM HEPES. For scFv13-R4DQNAT, hEPO22-DQNAT-26, hEPO36-DQNAT-40, og hEPO81-DQNAT85 denne fasen ble gjennomført ved 30 °C i 4 h under oksiderende forhold mens for sfGFP217-DQNAT og sfGFP217-AQNAT denne fasen ble gjennomført ved 30 °C i 5 min under reduserende forhold., For oksiderende forhold, trekke ut var pre-rom med 750 µM iodoacetamide i mørke ved romtemperatur i 30 min og reaksjonsblanding ble levert med 200 mM glutation på en 3:1-forhold mellom oksidert og redusert former. Den aktive sfGFP avkastning fra celle-gratis reaksjoner ble kvantifisert ved måling av fluorescens in-lysate og konvertere til konsentrasjon ved hjelp av en standard kurve som tidligere described39. I den andre fasen, protein glycosylation ble initiert av tillegg av MnCl2 og DDM på en endelig konsentrasjon på 10 mM og 0.,1% (w/v%), henholdsvis, og lov til å fortsette på 30 °C for 16 h. Etter behov, reaksjoner ble supplert med 2 µg renset CjPglB (dvs., for CFGpS med LLO-beriket ekstrakter) eller 5 µg solvent-hentet CjLLOs (dvs., for CFGpS med OST-beriket ekstrakter). Alle reaksjoner ble stoppet ved å legge til Laemmli eksempel buffer som inneholder 5% ßME, etter som prøver ble kokt på 100 °C i 15 min og analysert ved SDS-PAGE og western blotting.

Western blot analyse

Prøvene inneholder 0,5 µg av akseptor protein ble lagt inn i SDS-PAGE gel., Følgende elektroforetiske separasjon, proteiner ble overført fra gels på Immobilon-P polyvinylidene difluoride (PVDF) – membraner (0.45 µm) i henhold til produsentens protokollen. Membraner ble vasket to ganger med TBS buffer (80 g L−1 NaCl, 20 g L−1 KCl, og 30 g L−1 Tris-base -) etterfulgt av inkubasjon for 1 h i blokkere løsning (50 g L−1 for ikke-fett melk i TBST (TBS leveres med trinn på 0,05% (v/v%) Tween-20)). Etter å blokkere, membraner ble vasket 4 ganger med TBST med 10 min inkubasjon mellom hver vask., En første membranen ble analysert med 6xHis-polyklonale antistoffer (Abcam, ab137839, 1:7500) som spesifikt gjenkjenner hexahistidine epitope koder, mens andre replikere membranen ble analysert med ett av følgende: hR6 (1:10 000 i) serum fra kanin som gjenkjenner native C. jejuni og C. lari glycan samt konstruert C. lari glycan eller ConA-HRP (Sigma, L6397, 1:2500), som gjenkjenner Man3GlcNac og Man3GlcNAc2. Sondering av membraner ble utført for minst 1 h med risting i romtemperatur, etter som membraner ble vasket med TBST på samme måte som beskrevet ovenfor., For utvikling, membraner ble inkubert en kort stund i romtemperatur med Western ECL substrat (BioRad) og avbildes ved hjelp av en ChemiDocTM XRS+System. OST enzymer beriket i ekstrakter ble oppdaget av et identisk med SDS-PAGE prosedyre etterfulgt av Western-blot analyse med en polyklonale antistoffer som er spesifikke for FLAGGET epitope tag (Abcam, ab49763, 1:7500). Den glycan del av LLOs beriket i ekstrakter ble oppdaget ved direkte spotting 10 µL av ekstrakter på nitrocellulose membraner etterfulgt av gjenkjenning med hR6 serum. Ubeskårne immunoblot bilder er vist i Supplerende Fig. 8.,

MS analyse

Omtrent 2 µg av scFv13-R4DQNAT protein i løsningen ble denaturert med 6 M urea, redusert med 10 mM DTT, inkubert ved 34 °C for 1 h, deretter alkylerte med 58 mM iodoacetamide for 45 min i mørke ved romtemperatur og slukket ved siste 36 mM DTT. Løsningen ble så fortynnet med 50 mM ammonium bicarbonate (pH 8,0) til en endelig buffer konsentrasjon av 1 M urea før trypsin fordøyelsen. Prøven ble tatt opp med 0,2 µg av trypsin for 18 timer ved 37 °C. fordøyelsen ble stoppet ved tillegg av TFA til en endelig pH-2.2–2.5., Prøvene ble deretter avsaltet med SOLA HRP SPE Tonerkassetten (ThermoFisher Vitenskapelige). Blekkpatronene var utstyrt med 1 × 0,5 mL 90% metanol, 0.1% trifluoroacetic syre (TFA) og likevekt med 2 × 0,5 mL 0.1% (v/v%) TFA. Prøvene ble fortynnet 1:1 med 0,2% (v/v%) TFA og kjøre sakte gjennom blekkpatronene. Etter å ha vasket med 2 × 0,5 mL av equilibration løsning, peptider var eluted med 1 × 0,5 mL 50% (v/v%) acetonitrile (ACN), 0.1% (v/v%) TFA og tørket i en hastighet vakuum-sentrifuger.,

nanoLC–MS/MS analyse ble utført ved hjelp av UltiMate3000 RSLCnano (Dionex) koplet til en Orbitrap Fusion (ThermoFisher Vitenskapelige) masse spektrometer utstyrt med en nanospray Flex-Ion-Kilde. Hver prøve ble rekonstituert i 22 µL av 0.5% (w/v%) AKTIVA og 10 µL ble lastet på en Anerkjennelse PepMap 100 C18 felle kolonne (5 mikrometer, 100 µm × 20 mm, 100➀, ThermoFisher Vitenskapelige) med nanoViper Beslag på 20 µL min−1 0,5% FA for on-line desalting., Etter 2 min ventil slått for å tillate peptider å være adskilt på en Anerkjennelse PepMap C18 nano kolonne (3 µm, 75 µm × 25 cm, ThermoFisher Vitenskapelig), i en 90 min gradient av 5-23% til 35% B på 300 nL min−1 (3 til 73 til 93 min., henholdsvis), etterfulgt av en 9-min øke til 90% B, en 9-min holder på 90%, B og rask bytte til 5% B i 1 min. Kolonnen ble re-likevekt med 5% B for 20 min før neste løp. Den Orbitrap Fusion var i drift i positive ion-modus med nanospray spenning satt på 1,7 kV og kilde temperatur på 275 °C., Ekstern kalibrering for FT, og quadrupole masse analysatorer ble utført før analyse. Den Orbitrap full MS undersøkelsen scan (m/z 400-1800) ble etterfulgt av Topp 3 s data-avhengige Høyere Kollisjon dissosiasjon produktet ion utløst ETD (HCD-pd-ETD) MS/MS skanner for forløper peptider med 2-7 kostnader over en terskel ion teller 50 000 med normalisert kollisjon energi på 32%., MS undersøkelsen skanninger ble kjøpt på en oppløsningsevne på 120,000 (FWHM på m/z 200), med Automatisk Gin Control (AGC) = 2e5 og maksimal injeksjon tid (Maks IT) = 50 ms, og HCD MS/MS skanner med en oppløsning på 30 000 med AGC = 5e4, Maks ant. DET = 60 ms og med Q isolert vindu (m/z) på 3 for masse utvalg m/z 105-2000. Dynamisk utelukkelse parametre ble satt til 1 i løpet av 60 s utelukkelse varighet med ±10 ppm utelukkelse masse bredde. Produktet Ion-trigger-listen besto av toppene på 204.0867 Da (HexNAc oxonium ion), 138.0545 Da (HexNAc fragment), og 366.1396 Da (HexHexNAc oxonium ioner)., Hvis en av HCD produktet ioner i listen ble oppdaget, to kostnad-avhengige ETD MS/MS skanner (EThcD) med HCD supplerende aktivering (SA) på samme forløper ion ble utløst og samlet i en lineær ion-fellen. For dobbelt belastet forløpere, de ETD reaksjonstid som ligger 150 ms og SA energi ble satt til 30%, mens de samme parameterne på 125 ms og 20%, henholdsvis, ble brukt for høyere belastet forløpere. For både ion utløst skanner, fluoranten ETD reagens målet ble satt på 2e5, AGC mål på 1e4, Maks ant. DET på 105 ms og isolasjon vindu på 3. Alle data ble anskaffet ved hjelp av Xcalibur 3.,0 drift-programvare-og Orbitrap Fusion Tune Programmet v. 2.1 (ThermoFisher Vitenskapelige).

Alle MS og MS/MS raw-spektra fra hver prøve ble søkt ved hjelp av Byonics v. 2.8.2 (Protein Beregninger) ved hjelp av E coli protein database med ekstra scFv13-R4DQNAT protein målsekvensen. Peptid søk parametere var som følger: to ubesvarte spalting for full trypsin fordøyelsen med fast carbamidomethyl endring av cystein, variabel endringer av metionin oksidasjon, og deamidation på asparagine/glutamin rester., Peptid masse toleranse var 10 ppm og fragment masse toleranse verdier for HCD og EThcD spektra ble 0,05 og 0.6 Da, henholdsvis. Både det maksimale antallet av vanlige og sjeldne endringer ble satt til to. Den glycan søk ble utført mot en liste av 309 mammalske N-linket glycans i Byonic programvare. Identifisert peptider ble filtrert for maksimalt 2% FDR. Programvaren eksporterte resultatene av søket til et regneark.

GFP fluorescens aktivitet

aktiviteten av celle-gratis-avledet sfGFP ble fastsatt ved hjelp av en lysate fluorescens analyse som beskrevet previously39., Kort, 2 µL av celle-gratis syntetisert glycosylated sfGFP reaksjon ble fortynnet i 48 µL av nanopure vann. Løsningen ble deretter plassert i en Costar 96-brønns svart analysen plate (Corning). Eksitasjon og utslipp bølgelengder for sfGFP fluorescens var 485 og 528 nm, henholdsvis.

enzymkoblet immunsorbent analyse (ELISA)

Costar 96-brønns ELISA-plater (Corning) var dekket over natten ved 4 °C med 50 µl av 1 mg mL−1 E. coli β-gal (Sigma-Aldrich) i trinn på 0,05 M natriumkarbonat buffer (pH 9.6)., Etter å blokkere med 5% (w/v%) bovint serum albumin (BSA) i PBS for 3 timer i romtemperatur, platene ble vasket fire ganger med PBST buffer (PBS, er 0,05% (v/v%) Tween-20, 0.3% (w/v%) BSA) og inkubert med serielt utvannet renset scFv13-R4 prøver eller løselig fraksjoner av CFGpS lysates for 1 time ved romtemperatur. Prøvene ble kvantifisert ved Bradford analysen, og et tilsvarende beløp av total protein ble brukt til plate. Etter vask fire ganger med samme buffer, anti-6×-Hans-HRP-konjugert polyklonalt kanin antistoff (Abcam) i 3% PBST ble lagt til hver brønn for 1 h., Platene ble vasket og utviklet ved bruk av standard protokoller.

In vitro-celleproliferasjon analysen

Menneskelige erythroleukemia TF-1-celler (Sigma) som krever granulocytte–macrophage koloni-stimulerende faktor (GM-CSF), interleukin 3 (IL-3), eller hEPO for vekst og overlevelse ble brukt. Cellene ble opprettholdt i RPMI-1640 media supplert med 10% FBS, 50 U mL−1 penicillin, 50 mg og mL−1 streptomycin, 2 mM glutamin, og 2 ng mL−1 GM-CSF ved 37 °C i en humidified atmosfære som inneholder 5% CO2., Etter 16 timers inkubering i RPMI-1640 media uten GM-CSF, celler ble regnet, slaktet, og resuspendert i nye medier. 5 × 103 TF-1 celler per brønn ble seedet i en 96-brønns analysen plate, og EPO standarder eller prøver ble lagt til finalen ønsket konsentrasjoner til hver brønn. Cellene ble inkubert med for 6 h i fuktige inkubator før du legger alamarBlue®. Etter 12 h, fluorescens signalet ble målt på 560 nm/590 nm eksitasjon/utslipp bølgelengde.,

Data

Alle data som er generert i løpet av studiet er inkludert i denne artikkelen og dens utfyllende informasjon om filer, og er tilgjengelig fra forfatterne ved rimelig anmodning.