研究室の場所

現代の親戚を含むすべてのDNA研究は、レスター大学で行われた。 男性系親族はPromega PowerPlex Y23を使用して型付けされ、レスターの主要なヨーロッパのY-ハプログループを定義するSnpのために、タイピングのサブセットはポール-サバティエ大学で確認されている。 レスター大学でミトコンドリアゲノム全体に対して女性系親戚が配列決定された。, DNAはヨーク大学とトゥールーズのポール-サバティエ大学で古代の歯と骨から抽出されました。 図書館の準備とターゲット濃縮はヨーク大学で行われました。 シングルエンド100bpシーケンシングは、Hiseq2000（Illumina、CA、USA）を使用して、コペンハーゲンシーケンシング施設で行われました。 現代および古代DNAの両方の標的配列決定は、genomic technical platform PlaGe（Genopole、Toulouse、France）およびLeicester大学の蛋白質核酸化学研究所でも行われました。 以下では、使用される方法の凝縮されたバージョンを提供します。, 各ステップについて、完全な情報は補足方法で見つけることができます。 このプロジェクトのために行われた広範な系図研究に関する詳細は、補足注2に記載されています。

サンプルコレクション

DNAは、リチャード三世の現代の親戚の唾液サンプルから抽出され、すべての参加者は、レスター大学研究倫理委員会によるプロジェクトレビュー後にインフォームドコンセントで募集されました。

骨格1が発掘され、清潔な条件下でサンプルが採取された37。, グレイ-フライアーズ-サイト、レスターのクリーン-ラボラトリー、そしてラボラトリーとラボラトリーに関わった人たちは、ミトコンドリアを持ち、男性の場合はY染色体がタイプされていました。 唾液サンプルからDNAを抽出し、すべての参加者をインフォームドコンセントで募集した。

古代サンプルのDNA抽出

歯および骨（大腿骨）サンプルからDNAを抽出した。 すべての手順は、適切な汚染予防策を講じた状態で、ヨーク大学とトゥールーズ大学ポール-サバティエの専用の古代DNA研究所で行われました。, 二つの抽出ブランクを含め、プロセス全体を通して抽出されたかのように正確に処理しました。 PCRs図書館の実験も含まれてさらに空白ます。

セックスタイピングアッセイスケルトン1で行わ

UTXとUTY相同領域とSRYフラグメントの共増幅のためのPCRプライマーからなる新たに設計されたセック このアッセイは、sry、UTXおよびUTYの比較的小さなサイズの断片を、分解されたDNA10を含む可能性が高いサンプルから共増幅することを可能にするように,

骨格1のミトコンドリア制御領域分析

mtDNA制御領域の超可変セグメント（HV1、HV2およびHV3）の分析は、153から250bpのサイズ（http://forensic.yonsei.ac.kr/protocol/mtDNA-midi-mini.pdf）22 選択したアンプリコンを、Ｔｕｌｏｕｓｅの研究室でＰＣＲ産物をクローニングするために使用した。 シーケンシングは、ビッグ色素ターミネータV3を用いて行われた。,1サイクルシーケンシングキット（Applied Biosystems）およびABI Prism3730遺伝子分析装置（Applied Biosystems）上のキャピラリー電気泳動により、レスター大学のタンパク質核酸化学研究所またはゲノム技術プラットフォームPlaGe（Genopole）

ミトコンドリアゲノム/Y-SNP/HIrisplexタイピングスケルトン1

ライブラリは、鈍端修復とアダプター結紮の間の最初のろ過ステップが酵素38、39の熱不活性化によって置き換えられたことを除いて、マイヤーとKircher16に続いて構築された。, Ｍｔｄｎａ濃縮のための二つのマイクロアレイと核ＳＮＰ濃縮のための二つのマイクロアレイを設計した。 DNA濃縮は、Agilent244k DNA SureSelectマイクロアレイ（Agilent、Böblingen、Germany）を用いたハイブリダイゼーション捕獲によって行った。 核捕獲のために、Y染色体プローブは、主要なヨーロッパのlineages14に関連するSnpをカバーするように設計されました。 さらにプローブは、HIrisplex31マーカーに関連するSnpをカバーするように設計されました。 プローブ（ミトコンドリアとSnp）のこれら二つのセットは、1×244K形式の二つの異なるマイクロアレイの設計を埋めるために別々に使用されました。, 各マイクロアレイについて、捕捉プロトコルは、Ｈｏｄｇｅｓ ｅｔ ａｌ．15Zhangらによって提案された修正を伴う。40そして、フォルテスとPaijmans38. ライブラリは等モル量でプールされ、デンマークのコペンハーゲン大学のシーケンシング施設でIllumina HiSeq2000プラットフォームの100SEモードの二つのレーンで配列された。

rawを読み込みから各大学図書館にソートされた基の塩基配列インデックス中の図書館が準備中です。 さらなる分析のために、索引と100％一致する読み取りのみが選択されました。, を読み込みよりも短い25ヌクレオチドから切り捨てられたが，それからます。 トリミングされた読み取りは、ヒト参照ゲノムビルド37（GRCh37）からの常染色体および性染色体およびrCRS（NC_012920.1）にbwa0.7.5a-r405を用いてマッピングされた（ref. 41). 各アライメントでは、出力bamファイルはSAMtools0.1.19を使用してマージされました(ref. 41)およびPCR重複は、その後削除されました。 マッピングされた読み取りは、マッピング品質>29および参照シーケンスに沿った一意の位置へのアライメントに基づいてフィルタ,多形位置は、SAMtools(SAMtools0.1.19)およびbcftoolsを使用して同定した。 最後に、vcfutils.pl Phredスケーリングされた遺伝子型事後確率品質>20および10より高い読み取り深さに従って変異体のリストをフィルタリングする 古代のDNA分子の脱アミノ化パターンのために誤ったコールを避けるために、vcf出力ファイルで報告されたすべての多形位置を目でチェックしました。, ミトコンドリアゲノムの場合、参照へのアセンブリはTablet42で視覚化され、Snpを含むリードの参照染色体へのアライメントはIGV43を用いて視覚化された。

PCRによるSNPタイピング

キャプチャアプローチは、すべてのHIrisPlexとY染色体Snpのための不十分なカバレッジをもたらしたため、プライマーは、さらにY染色体ハプログループG：M285（G1）とP287（G2）を定義するこれらのSnpだけでなく、二つのSnpを含むアンプリコンを生成するように設計された。 14). これらは、Römpler et al.,44またはシングルプレックス反応（40サイクルを使用し、二次増幅なし）およびIon PGM200Xpress Template KitおよびPGM200Sequencing Kitを使用してライブラリ調製後のIon Torrentで配列決定。 カバレッジを高めるために、シングルプレックスPCRおよび一つのマーカー（rs28777）のシーケンシングをBinladenらに従って行った。45

Snpを定義するハプログループG（M201、M285およびP287）のタイピングを、シングルプレックスPcrを用いてトゥールーズで繰り返した。 これらのPCR産物のシーケンシングは、Big-Dye Terminator V3を用いて行った。,1サイクルシーケンシングキット(Applied Biosystems)ゲノム技術プラットフォームPlaGe(Genopole)のABI Prism3730遺伝子分析装置(Applied Biosystems)上のキャピラリー電気泳動によって分析されました。

Y染色体ハプロタイプ解析

古代および現代のサンプルのY染色体ハプロタイプは、PowerPlex Y23システム（Promega）を用いて得られ、genomic technical platform PlaGe（Genopole）のABI Prism3730Genetic Analyser（Applied Biosystems）およびLeicester大学のABI Prism3130xl Genetic Analyser（Applied Biosystems）でキャピラリー電気泳動によって分析された。, スケルトン1については、これは二つの異なる古代DNA研究所（ヨークとトゥールーズ）で三つの別々の抽出物（RM2、LM1とLM3）について行われました。 現代の親戚のために、これは二つの異なる近代的な研究所（レスターとトゥールーズ）で二つの異なる抽出物に対して行われました。

現代のサンプルのY染色体SNP分析

現代の男性系サンプルのYハプロタイプの決定に続いて、予測されたハプログループは、ホワイトアテイのハプログループ予測因子（http://www.hprg.com/hapest5/hapest5a/hapest5.htm?order=num）を用いて決定された。, これらおよび関連系統をカバーするバイナリマーカーは、スナップショットミニシークエンシング手順（Applied Biosystems）とAbi3130xl遺伝子アナライザ（Applied Biosystems）によって二つの多重 サマセット3はHg I(M170+M223−,M253−)14由来であることが決定され、トゥールーズの研究室によってさらに確認された。 サマーセット1,2,4および5は、R1b-U152について導出されることが決定された。 サマーセット1,2,4および5は、このクラード13（Z56、M126、Z36、Z192、M160およびL2）を細分するSnpについて、両方のラボでSangerシーケンシングを用いて試験した。,

現代のmtDNA分析

両方のサンプルは二度複製されました。

サンプルはOragene DNAコレクションキット（DNA Genotek）を使用して採取し、QIACUBE Blood and Body Fluid protocol（200μl、200μl溶出）およびOragene protocolを使用してDNA抽出しました。 制御領域を分析するために、サンプルは、ビッグ色素ターミネーターv3.1（Applied Biosystems）を使用して二つの重複プライマーセット（15973-296と16524-614）を使用して順方向と逆方向の両方 反復間またはサンプル間に差は見られなかった。,Ｍｅｙｅｒらに続く両方の抽出から完全なミトコンドリアゲノムについて試料を増幅した。26PCRアンプリコンは、Ion314チップ上のイオン急流PGMシーケンサ上でシーケンスされました。 ライブラリーはIon Xpress Plus gDNA Fragment Library Preparation kitを用いて調製し、鋳型調製および配列決定はそれぞれIon PGM200Xpress Template KitおよびIon PGM200Sequencing Kitを用いて行った。 Raw読み取りは、Ion Alignment plugin3.2.1（Torrent Suite Software3.2）に含まれているTMAPソフトウェアを使用してrCRS（NC_012920.1）にマッピングされました。,1)Ion Torrentサーバー上で。 重複読み取りの削除とバリアント呼び出しは、SAMtools0.1.19を使用して実行されました(ref. 41)およびゲノム解析ツールキット46を用いて局所再調整を行った。 バリアントサイトは、ベース品質20、マッピング品質50とカバレッジの深さ30 33多型サイトが保持された次のためにフィルタリング これらの場所はすべて両方の方向のSangerの配列によって手動で点検され、確認され、二度複製されました。,

汚染制御と定量

古代遺跡の現代のDNA汚染は、以下の方法によって制御された：

  1. 1

    掘削はクリーンな条件下で行われた補足法を参照

  2. 2

    サンプルはクリーンなラボに保管され、古代のDNA作業は専用の古代DNA施設でのみ行われた。

  3. 3

    結果を複製するために、別々の古代のサンプルを別々の研究室で処理しました。,

  4. 4

    すべての研究室メンバーと発掘参加者は、mtDNAタイピングを持っていたし、Y染色体タイピングは、関係するすべての男性に行われました。 一致するｍｔｄｎａまたはＹ染色体型はなかった。

有意な汚染に対する証拠として、骨格1のDNA分析は、ML1との完全なmtDNA一致およびML2との単一塩基差を示す。 また、二つの別々のラボで生成され、テストされた抽出物の数を使用して複製されている明確なY-STRハプロタイプを示しています。, 最後に、readsの置換パターンの検査（補足方法を参照）もこれをサポートしています。

統計分析

各ステップで保守的なアプローチをとると、仮説1(H1):スケルトン1はリチャードIIIであり、仮説2(H2):スケルトン1はリチャードIIIではないという二つの対立仮説のそれぞれの下で観察された証拠の各項目の尤度を計算した。,

すべての異なる証拠線が独立していると仮定することは合理的であったため、すべての証拠の共同尤度は、各仮説の下で個々の尤度の乗算によっ 尤度比（LR）と呼ばれるH1の証拠の重みは、H1の下の尤度とH2の下の尤度の比によって与えられました。 我々は、それがLRを減少させるならば、仮定は”保守的”であると言う。

LRは、事前確率が与えられると、H1が真である確率に変換することができます。, 私たちは、スケルトン1が最初に観察され、人間の骨格として認識された瞬間を出発点としましたが、年齢、性別、健康状態、死因の評価が行われる前 その時点で、レスター-グレイの聖歌隊の場所であったと考えられているものから発見された骨格はリチャード三世のものである可能性があるという実質的な証拠があり、骨格1が出土した時点で入手可能な情報はすべて、その正確な位置と墓の性質を含む、この分析のために事前確率を知らせることができる背景情報とみなされた。, その情報に基づいて、我々は懐疑的な観察者が合理的に1で40未満の事前確率を割り当てることができなかったと信じています。 この値は、懐疑的な評価であると判断したものに基づいて、以前の分析（http://rationalgareth.com/）で提案されました。 事前の証拠によって正当化される可能性のある最も高い確率は、1in2である可能性があります。

可能な限り、関連する利用可能なデータを使用しています。 必然的に主観的な判断、例えば、関連する参照母集団および報告された事実における誤りの確率について必要とされる。, 可能かつ合理的に見える限り、我々は、例えば、擬似数法を使用してLRを中立値1にバイアスし、低い観測周波数からの偽の大きな値を避ける傾向があるなど、私たちのアプローチでは保守的であるように努力しました。 放射性炭素データ、骨格の年齢および性別、脊柱側弯症の存在、死期創傷の存在、Y染色体およびmtDNA頻度データの統計分析に使用されるデータおよび方法の詳細は、補足的な方法で見つけることができる。 結果を要約すると、放射性炭素データは尤度比1をもたらしました。,84H1の限られたサポートを表します。 年齢と性別のデータは、再びH1のための限られたサポートを表す、5.25の尤度配給をもたらしました。 リチャードの生前に報告された片方の肩の存在は、脊柱側弯症（スケルトン1は重度の特発性青年発症脊柱側弯症を有していた）または他の二つの既知の状態、Erbの麻痺およびSprengelの変形に起因する可能性があり、どちらも非常にまれである。 H1の下では、上記のレートは0の推定確率を与えます。,リチャード三世の身体的外観（=脊柱側弯症率を三つの割合の合計で割ったもの）の記述を考えると、脊柱側弯症を観察する90は、記録された記述が間違っ これは212のLRにつながり、H1に適度に強力なサポートを提供します。 死期外傷の存在は42のLRを与え、H1のためのそう適当なサポート。 スケルトン1のY染色体は、リチャード三世の系図的に決定された父系親族のものと一致しなかった。, これは、リチャード三世とヘンリー-サマセット、第五ボーフォート公爵の間の19推定父子のリンクの一つまたは複数の偽父親イベントによって説明することができます。 Y染色体の結果はまた、ヘンリー-サマセットと彼の五つの現代的な、推定される父系の子孫との間のさらなる偽父親イベントを示している。 保守的であるために、我々は（1）我々が考慮した他の公開率よりも低い17、47と（2）系図データに基づいて18公表された偽の父性率を選択しました。, これには、ヘンリー-サマセットと現代の男性のサマセットの間の19の推定父子のリンクに偽父親イベントを追加します。 これにより、リチャード三世とヘンリー–サマセットの間の19の推定父子リンクにおける少なくとも一つの偽父親事象の確率は0.16である。 偽父親イベントがH1の下で発生している必要があることを考えると、スケルトン1のYハプロタイプの母集団頻度はH1とH2の下で同じであり、LRの計算でキャンセルされます。 したがって、LRは0.16であり、H1に対する限られた証拠を表しています。,

骨格1のmtDNA配列とリチャード三世、マイケル-イプセンの推定される19減数分裂の母系親族は完全に一致した。 21減数分裂の相対も一つの塩基（8994）を除いて一致しました。 後者の観測は、Michael Ibsenの観測されたシーケンスを与えられたH1とH2の下でも同様に可能性が高いため、LRでキャンセルされます。 したがって、マイケル-イプセンとスケルトン1が共有するシーケンスの観察のための尤度のみが必要である。

H1の下で尤度を得るためには、mtDNA変異率が必要であり、この場合、高い推定値は保守的である。 Ｐａｒｓｏｎｓ ｅｔ ａｌ．,28報告10系図データを用いた327世代における制御領域変異。 これは他の公表された推定値よりも高い割合を示唆しており、系図データに基づいているため、0.52meiosesに突然変異がない確率を19に導くために使用し

H2の下の尤度については、骨格1ハプロタイプの母集団の割合が必要です。 我々はスケルトン1から完全なmtDNAゲノム配列を得たが、我々はイギリスから少し公開された全ゲノム比較データを同定した。, したがって、統計分析のために、位置16,093と16,320の間および00073と00188の間のmtDNA制御領域のみを使用し、Röhl et alの更新から適切な英語比較データを得た。30、実の根によって供給されるmtDNA配列を補充した（Genetic Ancestor Ltd.、クレア、サフォーク、イギリス）。 観察された制御領域配列の集団画分は、完全なmtDNAゲノムのそれよりも小さくすることはできませんので、H2の下で制御領域のこれらの短いセクショ, 関連する参照人口は過去500年以上ですが、考えられる期間にわたって人口サイズが大きいため、人口頻度は過去五世紀にわたってほとんど変わっていないと考えられています。 私たちは、骨格1ハプロタイプの頻度が0であることをデータベース内の1823のうち、Michael Ibsenで観察された一つのインスタンスを追加することを発見しました。 このアプローチは、マイケルがリチャード三世に彼の知られている系図的関係のためにサンプリングされたように、再び、保守的であり、これは478のLRをH1の適度に強い証拠を表,

我々はまた、26,127ヨーロッパのミトコンドリア制御領域ハプロタイプのデータベースに一致がなかったことに留意しました（www.empop.org)29.このデータベースはイギリス固有のものではなく、ヨーロッパ全体であり、確認の問題のためにこのデータベースに依存していませんが、骨格1ハプロタイプは、私たちの小さな英語データベースから推測できるよりもはるかに稀であることを示唆しています。 また、ヨーロッパの貴族の間の女性の移動性は、政治的同盟形成に関連する結婚慣行のために、一般人口よりもはるかに高かった可能性が高いことに, このような慣行は、ヨーロッパのmtDNAデータベースを使用するためのいくつかの正当化を提供し、スケルトン1とマイケル-イプセンに見つかったハプロタイプ 補足表10では、ヨーロッパのデータベースを使用して、骨格1ハプロタイプがそのデータベースによって示唆されているほどまれであることを確立することの

証拠の異なる組み合わせに対するLRs、および二つの事後確率を補足表10に示す。, すべての証拠を使用して、H1のサポートは6.7百万のLRで非常に強く、私たちの懐疑的な人は、スケルトン1がリチャードIIIではない確率は1で100,000未満であるという結論に追い込まれるでしょうが、1で2の開始位置を取っている人の場合、確率は百万で1よりはるかに小さいという結論に追い込まれます。 上記の計算の基礎となる保守的な仮定を考慮に入れて、我々はこれを合理的な疑いを超えてH1の真実を確立するものとみなす。