細菌株およびプラスミド

以下の大腸菌株を本研究で使用した:DH5a、BL21(DE3)(Novagen)、CLM24、およびOrigami2(DE3)gmd::kan ΔwaaL。 DH5aをプラスミドクローニングと精製に使用した。, BL21（DE3）は、すべてのin vitroグリコシル化反応で使用されたscFv13-R4DQNAT受容体タンパク質の発現および精製のために使用された。 CLM24はw3110のグリコ最適化された誘導体であり、WaaLリガーゼをコードする遺伝子の欠失を伴い、Und-PP36上の予め組み立てられた糖鎖の蓄積を促進する。 CLM24CjOST酵素の精製、すべてのLLO sbearing細菌糖鎖の有機溶剤ベースの抽出、および選択的に濃縮されたグリコシル化成分の有無にかかわらず抽出物を調製するためのソース株に使用された。, Origami2(DE3)gmd::kan ΔwaaLは、Man3GlcNAc2ベアリングLLOsを生産するために使用され、P1virファージ形質導入による逐次変異によって生成されたドナーとしてKeio collection62からのそれぞれの株を用いて、Coli遺伝ストックセンター（CGSC）から得られた。 簡単に言えば、ドナー溶解物をJW3597-1株（ΔrfaL734::kan）から生成し、得られたファージをOrigami2（DE3）標的細胞に感染させるために使用した。, カナマイシン（Kan）を含むLBプレート上の形質転換体をメッキした後、成功した形質転換体を選択し、そのKan抵抗カセットは、温度感受性プラスミドpCP2063で変換 次いで、得られた株Origami2(DE3)ΔwaaLを、同一の戦略に従ってgmd遺伝子のその後の欠失のために使用したが、ドナー株JW2038-1(Δgmd751::kan)を使用した。

研究で使用されたすべてのプラスミドを補足表2に記載する。 プラスミドの構築本研究において標準のクローニングプロトコル確認によるDNAの順序付けなどを利用できます。, これらには以下が含まれる。 プラスミドpJL1-scFv13-R4DQNATは、scfv13-R4DQNATをコードする遺伝子をpET28a-scFv13-R4（N34L、N77L）DQNATから増幅する最初のPCRによって生成され、n34lおよびN77L変異がscFv13-R452の推定内部グリコシル化部位を排除するために導入された。 次いで、得られたPCR産物を、プラスミドpJL1、CFPS49に使用されるpETベースのベクターにおけるNcoIおよびSalI制限部位の間で連結した。 プラスミドpJL1-sfGFP217-DQNATは、sfgfp217-DQNAT（統合DNA技術）をコードする商業的に合成されたDNA断片をpJL1に連結することによって生成された。, SfGFPのこのバージョンは、最終的なベータsheet64の前にこの柔軟なループを拡張するk214の後に追加のGT挿入が含まれています。 この柔軟なループに、すぐにT216の後、我々は21アミノ酸配列C.jejuni AcrA N123グリコシル化site34を含むが、ネイティブAcrAセコンの代わりに最適なDQNATセコンでグラ 同様の手順を用いて、プラスミドpJL1-sfGFP217-AQNAT、pJL1-hEPO22-DQNAT-26、pJL1-hEPO36-DQNAT-40、およびpJL1-hEPO81-DQNAT-85を生成した。, PJL1-hEPO22-DQNAT-26の場合、成熟したヒトEPOの遺伝子は、N24のネイティブセコンが22-AENIT-26から最適な細菌セコン、DQNATに変更されるように設計されました。 同一のクローニング戦略は、別々にネイティブhEPOセコン36-NENIT-40と81-LVNSS-85の代わりに最適なDQNATモチーフを導入するために行われました。 Und-PP上の大腸菌O9プライマーアダプターグリカン（Man3GlcNAc）の組換え発現は、Eに由来するWbdBおよびWbdCマンノシルトランスフェラーゼ酵素をコードする遺伝子をクローニングすることによって達成された。, グリカンを組み立てるための大腸菌ATCC31616、およびRfbKおよびRfbMは、利用可能なGDP-マンノースのプールを増加させるための大腸菌ATCC31616にも由来し、大腸菌MG1655 プラスミドpConYCGmCBは等温ギブソンアセンブリによって構築され、（i）酵母糖転移酵素Alg13、Alg14、Alg1、およびAlg2Man3GlcNAc2糖鎖生合成12と（ii）大腸菌の酵素ホスホマンノムターゼ（ManB）とマンノース-1-リン酸グアニルトランスフェラーゼ（ManC）で構成される人工オペロンをエンコードし、Alg1およびAlg2酵素のGDP-マンノース基質の可用性を高める。,

タンパク質発現および精製

CjPglBの精製は、前述のプロトコル34に従って行った。 簡単に言えば、大腸菌CLM24を運ぶプラスミドpSN1865の単一のコロニーは、37℃で50mLのLuria-Bertani（LB;10g L−1トリプトン、5g L−1酵母抽出物、5g L−1NaCl、pH7.2）アンピシリン（Amp）および0.2％（w/v％）d-グルコースを添加して一晩成長させた。 一晩細胞を1Lの新鮮な素晴らしいブロス（TB;12g L−1トリプトン、24g L−1酵母抽出物、0.4％（v/v％）グリセロール、10％（v/v％）0.17M KH2PO4/0に継代培養した。,72M K2HPO4リン酸緩衝液）、Ampを補充し、600nm（Abs600）での吸光度が-0.7の値に達するまで成長させた。 インキュベーション温度を16℃に調整し、その後、l-アラビノースを0.02％（w/v％）の最終濃度に添加することによってタンパク質発現が誘導された。 タンパク質発現を20時間16℃で進行させ、遠心分離によって細胞を採取し、次いでホモジナイザー（Avestin C5Emulslex）を用いて破壊した。 ライセートを遠心分離して細胞破片を除去し、上清を超遠心(100,000×g)して2時間、4℃で行った。, 膜画分を含む得られたペレットは、50mM HEPES、250mM NaCl、10％（v/v％）グリセロール、および1％（w/v％）n-ドデシル-β-d-マルトシド（DDM）をpH7.5で含むバッファー中のPotter-Elvehjem組織ホモジナイザーで完全に再懸 懸濁液を室温で1時間インキュベートし、天然大腸菌脂質からCjPglBの洗剤可溶化を促進し、その後の超遠心分離（100,000×g）によって1時間4℃で除去した。, DDM可溶化CjPglBを含む上清を、製造業者の仕様に従ってNi-NTA樹脂（Thermo）を用いて精製したが、すべての緩衝液に1％（w/v％）DDMが補充されたことは例外である。 次いで、Ni-NTA精製からの溶出画分を、ÄKTA Explorer FPLCシステム（Ge Healthcare）とSuperdex200 10/300GLカラムを用いてサイズ排除クロマトグラフィー（SEC）に供した。 精製されたタンパク質を1−2mg mL-1の最終濃度でOST貯蔵緩衝液（50mM HEPES、100mM NaCl、5％（v/v％）グリセロール、0.01％（w/v％）DDM、pH7.5）に4℃で保存した。, 試料中のグリセロール濃度を20％（v/v％）に調整し、-80℃での長期保存のために

受容体タンパク質scFv13-R4DQNATの精製を前に記載したように行った52。 簡単に言えば、大腸菌ひずみBL21(DE3)プラスミドpET28a-scFv13-R4(N34L、N77L)DQNATを運ぶカナマイシンを供給TBの1Lで成長しました。 培養を37℃でAbs600が-0.7に達するまでインキュベートし、その時点でイソプロピルβ-d-1-チオガラクトピラノシド(IPTG)を最終濃度0.1mmに添加することによってタンパク質発現を誘導し、タンパク質発現を20時間25℃で進行させた。, 細胞を回収し、上記と同じように破壊した。 ScFv13-R4DQNATタンパク質は、製造業者のプロトコルに従ってSECに続いてNi-NTA樹脂を使用して精製された。 タンパク質を1−2mg mL-1の最終濃度で貯蔵緩衝液（50mM HEPES、250mM NaCl、1mM EDTA、pH7.5）で4℃で保存した。

LLOsの抽出

大腸菌膜からLLOsのorganic媒抽出のためのプロトコルは、以前に記載されたprotocol34,66から適応された。, ほとんどの場合、標的糖鎖生合成のためのプラスミドを運ぶ株CLM24の単一のコロニー（補足表2）は、LB培地中で一晩成長した。 特筆すべき例外は、pEpiFOS-5pgl5fosmidを持つDH5a細胞を用いて産生されたW.succinogenes N-glycan(WsLLOs)を有するLLOsと、プラスミドpConYCGmCBを持つOrigami2(DE3)gmd::kan ΔwaaL細胞を用いて産生されたLLO sbearing Man3GlcNAc2であった。 一晩細胞を適切な抗生物質を補充した1LのTBに継代培養し、Abs600が-0.7に達するまで増殖させた。, インキュベーション温度は30℃に調整されたMan3GlcNAc2を除くすべての糖鎖の生合成のために、16℃に調整されたプラスミドpMW07-pglΔBのために、タンパク質発現は0.2％（w/v％）の最終濃度でl-アラビノースで誘導されたが、fosmid pEpiFOS-5pgl5誘導のためにイソプロピルβ-d-1-チオガラクトピラノシド（IPTG）1mMの最終濃度で誘導された。化学インデューサーが必要です。 16時間後、細胞を遠心分離によって回収し、細胞ペレットを凍結乾燥して、-70℃で乾燥を完了させた。, CjLLOs、ネイティブおよび設計ClLLOs、大腸菌O9プライマーアダプターllos、およびWsLLOsの抽出のために、凍結乾燥物は10:20:3CHCl3:CH3OH:H2O溶液の体積比で懸濁し、LLOsの抽出を容易にするために15分間室温でインキュベートした。 LLO sbearing Man3GlcNAc2グリカンの抽出のために、凍結乾燥物を連続して10:20(v/v%)CHCl3:CH3OH溶液、水、および10:20:3CHCl3:CH3OH:H2O溶液に懸濁し、各ステップの間に室温で15分のインキュベーションを行った。, それぞれの場合において、最終懸濁液を（4000×g）15分間遠心分離し、その後、有機層（底層）を回収し、真空濃縮器で乾燥し、その後凍結乾燥した。 活性LLOsを含む凍結乾燥物を無細胞グリコシル化バッファー（10mM HEPES、pH7.5、10mM MnCl2、および0.1％（w/v％）DDM）に再懸濁し、4℃で保存した

粗S30抽出物の調製

CLM24源株を2×YTPG（10g L-1酵母抽出物、16g L−1トリプトン、5g L−1NaCl、7g L−1k2hpo4,3G L−1kh2po4,18g l−1グルコース,ph7.2)abs600が−3に達するまで。, OST濃縮抽出物を生成するために、CLM24担持プラスミドpSF-CjPglB、pSF-CcPglB、pSF-DdPglB、pSF-DgPglB、またはpSF-DvPglB52をソース株として使用した。 LLO濃縮抽出物を生成するために、CLM24キャリングプラスミドpMW07-pglΔBは、ソース株として使用されました。 OSTとLLOsの両方を含むワンポット抽出物を生成するために、CLM24pmw07-pglΔBとpSF-CjOSTを運ぶソース株として使用されました。 必要に応じて、グリコシル化成分の発現は0.02％（w/v％）の最終濃度でl-アラビノースで誘導された。, 誘導後、タンパク質発現を30°CでOD600-3の密度に進行させ、その時点で細胞を遠心分離（5000×g）により4°Cで15分間収harvestedした。 その後のすべての工程は、特に記載のない限り4℃で行った。 ペレット化された細胞をS30緩衝液中で三回洗浄した（10mMトリス酢酸、14mM酢酸マグネシウム、60mM酢酸カリウム、pH8.2）。 最後の洗浄の後、細胞を7000×gで10分間ペレット化し、液体窒素上で急速凍結した。 ライセートを作製するために、細胞を解凍し、湿った細胞塊1gあたりS30緩衝液1mL中で均質性に再懸濁した。, 細胞は、単一の通路を持つ20,000-25,000psiでアベスチン乳化B15高圧ホモジナイザーを使用して破壊した。 次いで、溶解物を30,000×gで30分間二回遠心分離して、細胞破片を除去した。 上清を新しい容器に移し、250rpmで37℃で60分間振とうしてインキュベートし、内因性mRNA転写産物を分解し、溶解物中の既存のポリソーム複合体を破壊した。 15,000×gを15分間遠心分離した後、4℃で上清を回収し、アリコートし、液体窒素中でフラッシュ凍結し、-80℃で保存した。, S30抽出した次の繰り返し凍結融解作用を受けが含まれて~40g L−1の合計タンパク質によって測定して、ブラッドフォードの活性を測定した。

無細胞糖タンパク質合成

精製されたアクセプタータンパク質のin vitroグリコシル化のために、反応は50μl容量3μgのscFv13-R4DQNAT、2μgの精製CjPglB、5μgの抽出LLOs（Man3GlcNAc2LLOsの場合、20μgを使用）in vitroグリコシル化バッファー（10mM HEPES、pH7.5、10mM MnCl2、0.1%（w/v%）ddm）。 反応混mixtureを30℃で16時間インキュベートした。, 粗抽出物に基づく糖蛋白質の発現のために，二相スキームを実施した。 第一段階では、タンパク質合成は、修飾PANOx-SP system67を用いて行われた。 具体的には、1.5mLのマイクロセントリフュージンチューブ15-μl反応200ngプラスミドDNA、30%(v/v%)S30抽出物と以下を含む:12mMグルタミン酸マグネシウム、10mMグルタミン酸アンモニウム、130mMグルタミン酸カリウム、1.2mMアデノシン三リン酸(ATP)、0.85mMグアノシン三リン酸(GTP)、0.85mMウリジン三リン酸(UTP)、0.85mMシチジン三リン酸(CTP)、0.034mg mL−1フォリン酸、0。,171mg mL-1大腸菌tRNA(Roche)、2mMそれぞれ20アミノ酸、30mMホスホエノールピルビン酸(PEP,Roche)、0.4mMニコチンアミドアデニンジヌクレオチド(NAD)、0.27mM補酵素-A(CoA)、4mMシュウ酸、1mMプトレシン、1.5mMスペルミジン、57mM HEPES。 ScFv13-R4DQNAT、hEPO22-DQNAT-26、hEPO36-DQNAT-40、およびhEPO81-DQNAT85では、この相を酸化条件下で30℃で4時間行い、sfGFP217-DQNATおよびsfGFP217-AQNATでは30℃で5分間還元条件下で行った。, 酸化条件のために、抽出物は、室温で暗所で750μmのヨードアセトアミドで30分間予備調整し、反応ミックスは200mMのグルタチオンを酸化および還元形態の間の3:1の比率で供給した。 無細胞反応からの活性sfGFP収率は、溶解物中の蛍光を測定し、以前に記載された標準曲線を用いて濃度に変換することによって定量した39。 第二段階では、タンパク質のグリコシル化はMnCl2とDDM10mMと0の最終濃度での添加によって開始されました。,それぞれ1％（w/v％）、および30℃で16時間進行させた。必要に応じて、反応に2μgの精製CjPglB（すなわち、LLO濃縮抽出物を含むCFGpSの場合）または5μgの溶媒抽出CjLLOs（すなわち、OST濃縮抽出物を含むCFGpSの場合）を補充した。 すべての反応を5%μmeを含むLaemmli試料緩衝液を添加することによって停止し、その後試料を100℃で15分間沸騰させ、SDS-PAGEおよびウェスタンブロッティング

ウェスタンブロット分析

0.5μgのアクセプタータンパク質を含むサンプルをSDS-PAGEゲルにロードした。, 電気泳動分離に続いて、タンパク質は、メーカーのプロトコルに従ってImmobilon-Pポリビニリデン二フッ化（PVDF）膜（0.45μm）上にゲルから転送されました。 膜をtbsバッファー（80g L−1NaCl、20g L−1KCl、および30g L−1トリス塩基）で二回洗浄し、続いてブロッキング溶液中で1時間（50g L-1非脂肪乳TBST（tbsは0.05％（v/v％）Tween−20） ブロッキング後、膜をTBSTで4回洗浄し、各洗浄の間に10分インキュベーションを行った。, 最初の膜は、ヘキサヒスチジンエピトープタグを特異的に認識する6xHis-ポリクローナル抗体（Abcam、ab137839、1：7500）でプローブされ、第二の複製膜は、次のいずれかでプローブされた：hR6（1：10,000）ネイティブC.jejuniとC.lariグリカンだけでなく、設計されたC.lariグリカンまたはConA-HRP（Sigma、L6397、1：2500）Man3GlcNacとMan3GlcNAc2を認識するウサギからの血清。 膜のプロービングを室温で振とうしながら少なくとも1時間行い、その後、膜を上記と同様にしてTBSTで洗浄した。, 開発のために、膜をウェスタンECL基板（BioRad）と室温で簡単にインキュベートし、ChemiDocTM XRS+システムを使用してイメージングしました。 抽出物中に濃縮OST酵素は、フラグエピトープタグ（Abcam、ab49763、1：7500）に特異的なポリクローナル抗体とウェスタンブロット分析に続いて同一のSDS-PAGE手順によって検出 抽出物に濃縮LLOsの糖鎖成分は、直接ニトロセルロース膜上に抽出物の10μlをスポッティングすることによって検出され、続いてhR6血清で検出された。 未切除免疫ブロット画像を補足図に示す。 8.,

MS分析

溶液中の約2μgのscFv13-R4DQNATタンパク質を6M尿素で変性させ、10mM DTTで還元し、34℃で1時間インキュベートし、58mMヨードアセトアミドで45分間室温で暗闇の中でアルキル化し、最終的な36mM DTTによって急冷した。 次いで、溶液を50mM重炭酸アンモニウム（pH8.0）で希釈し、トリプシン消化の前に1M尿素の最終緩衝濃度にした。 サンプルを0.2μgのトリプシンで18時間37℃で消化した。tfaを最終pH2.2–2.5に添加することによって消化を停止した。, 次いで、試料をＳＯＬＡ ＨＲＰ ＳＰＥカートリッジ（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で脱塩した。 カートリッジを1×0.5mL90％メタノール、0.1％トリフルオロ酢酸（TFA）で調整し、2×0.5mL0.1％（v/v％）TFAで平衡させた。 サンプルを1:1で0.2%(v/v%)TFAで希釈し、カートリッジをゆっくりと流しました。 2×0.5mLの平衡溶液で洗浄した後、ペプチドを1×0.5mLの50％（v/v％）アセトニトリル（ACN）、0.1％（v/v％）TFAによって溶出し、速度真空遠心分離機中で乾燥した。,

nanoLC-MS/MS分析は、ナノスプレーフレックスイオン源を備えたOrbitrap核融合（ThermoFisher Scientific）質量分析計に結合されたUltiMate3000RSLCnano（Dionex）を使用して行われました。 各サンプルを22μlの0.5%(w/v%)FAで再構成し、10μlをAcclaim PepMap100C18トラップカラム(5µm、100µm×20mm、100Å、ThermoFisher Scientific)にナノバイパーフィッティングを20μl min−1の0.5%FAでオンライン脱塩するためにロードした。, 2分後、バルブはAcclaim PepMap C18ナノカラム（3μm、75μm×25cm、ThermoFisher Scientific）でペプチドを分離できるように切り替え、90分勾配で5−23％-35％Bを300nL min-1（それぞれ3-73-93分）、9分ランピングで90％B、9分ホールドで90％B、5％Bにクイックスイッチで1分で切り替えた。 カラムは、次の実行の前に5％Bで20分間再平衡された。 Orbitrap核融合は、ナノスプレー電圧を1.7kv、ソース温度を275℃に設定した正イオンモードで動作していました。, ＦＴ、ＩＴおよび四重極質量分析装置のための外部較正を分析の前に行った。 OrbitrapフルMSサーベイスキャン（m/z400-1800）トップ3sデータ依存高衝突解離生成物イオントリガETD（HCD-pd-ETD）MS/MSスキャン前駆体ペプチド2-7電荷しきい値イオン数50,000 32％の正規化された衝突エネルギーを超えるに続いていた。, MSサーベイスキャンは120,000（FWHM at m/z200）の分解能で取得され、自動ジン制御（AGC）=2e5、最大射出時間（Max IT）=50ms、hcd MS/MSスキャンは30,000の分解能でAGC=5e4、最大IT=60ms、Q分離ウィンドウ（m/z）は3で質量範囲m/z105-2000で取得された。 動的排除パラメータは、1で60秒の排除持続時間±10ppmの排除質量幅で設定されました。 製品イオントリガーリストは、204.0867Da（HexNAcオキソニウムイオン）、138.0545Da（HexNAcフラグメント）、および366.1396Da（HexHexNAcオキソニウムイオン）のピークで構成されていました。, リスト中のＨＣＤ生成物イオンの一つが検出された場合、同じ前駆体イオン上のＨＣＤ補足活性化（ＳＡ）を有する二つの電荷依存性ＥＴＤ ＭＳ／ＭＳスキャン（EThcD）がトリガされ、線形イオントラップ中に集められた。 二重荷電前駆体の場合、ETD反応時間は150msとSAエネルギーとして30％に設定され、125msと20％で同じパラメータは、それぞれ、より高い荷電前駆体に使用された。 両方のイオントリガースキャンのために、フルオランテンETD試薬ターゲットは2e5、1E4でAGCターゲット、105msで最大それと3で分離ウィンドウに設定され すべてのデータはXcalibur3を使用して取得した。,0操作ソフトウェアおよびOrbitrap融合チューンアプリケーションv.2.1(ThermoFisher Scientific).

各サンプルからのすべてのMSおよびMS/MS rawスペクトルは、Byonics v.2.8.2（タンパク質メトリック）を使用して、scFv13-R4DQNATタンパク質標的配列を追加した大腸菌タンパク質データベースを使用して検索しました。 ペプチド探索パラメータは，システインの固定カルバミドメチル修飾による完全トリプシン消化のための二つの開裂を逃した，メチオニン酸化の可変修飾，およびアスパラギン／グルタミン残基の脱アミド化であった。, ペプチドの質量許容差は10ppmおよびフラグメントの質量許容差値HCDとEThcDスペクトル0.05 0.6Daます。 共通および珍しい変更の最大数は両方とも二つに設定されました。 糖鎖検索は、Byonicソフトウェアにおける309の哺乳動物のN結合型糖鎖のリストに対して行われた。 同定されたペプチドは、最大2％FDRのために濾過した。 のソフトウェアを輸出結果の検索、表計算ソフトを起動します。

GFP蛍光活性

無細胞由来sfGFPの活性は、前に記載したように溶解物内蛍光分析を用いて決定した39。, 簡単に言えば、無細胞合成グリコシル化sfGFP反応の2μlを48μlのナノ純粋な水に希釈した。 次いで、溶液をCostar96ウェル黒色検定プレート（Corning）に入れた。 SfGFP蛍光の励起および発光波長は、それぞれ485および528nmであった。

酵素結合免疫吸着分析（ELISA）

Costar96ウェルELISAプレート（Corning）を4℃で一晩50μlの1mg mL−1大腸菌β-gal（Sigma-Aldrich）0.05M炭酸ナトリウムバッファー（pH9.6）中でコーティングした。, 5％（w/v％）ウシ血清アルブミン（BSA）pbsで3時間室温でブロックした後、プレートはPBSTバッファー（PBS、0.05％（v/v％）Tween-20、0.3％（w/v％）BSA）で四回洗浄し、連続希釈精製scFv13-R4サンプルまたはCFGpSライセートの可 試料をＢｒａｄｆｏｒｄアッセイによって定量し、等価量の全蛋白質をプレートに適用した。 同じ緩衝液で四回洗浄した後、抗6×-His-HRP共役ウサギポリクローナル抗体（Abcam）を3％PBSTで各ウェルに1時間添加した。, 版は標準プロトコルを使用して洗浄され、開発された。

in vitro細胞増殖アッセイ

顆粒球-マクロファージコロニー刺激因子（GM–CSF）、インターロイキン3（IL-3）、または成長と生存のためのhEPOを必要とするヒト赤白血 細胞はRPMI-1640メディア10％FBS、50U mL−1ペニシリン、50mg mL−1ストレプトマイシン、2mMグルタミン、および2ng mL−1GM-CSF37℃で5％CO2を含む加湿atmosphere囲気中で補った。, GM-CSFを含まないRPMI-1640培地で16時間インキュベーションした後、細胞を計数し、収穫し、新鮮な培地に再懸濁した。 ウェルあたり5×103TF-1細胞を96ウェルアッセイプレートに播種し、EPO標準品またはサンプルを各ウェルに最終所望濃度に添加した。 細胞は、alamarBlue®を添加する前に、湿ったインキュベーターで6時間インキュベートした。 12時間後、560nm/590nmの励起/発光波長で蛍光シグナルを測定した。,

データの可用性

研究中に生成されたすべてのデータは、この記事およびその補足情報ファイルに含まれており、合理的な要求に応じて著者から