Laboratorio paikkoja
Kaikki DNA-työn, jossa moderni sukulaiset toteutettiin University of Leicester. Mies-line sukulaiset olivat kirjoitetaan käyttäen Promega PowerPlex Y23 ja SNPs määritellään tärkeimmät Euroopan Y-haplogroups Leicester kanssa osajoukko kirjoittaminen on vahvistanut, Université Paul Sabatier. Naissukulaiset sekvensoitiin Leicesterin yliopiston koko mitokondrioiden genomille., DNA: ta louhittiin vanhoista hampaista ja luusta Yorkin yliopistossa ja Toulousen Université Paul Sabatierissa. Kirjastovalmistelu ja maalinrikastus tehtiin Yorkin yliopistossa. Kööpenhaminan Sekvensointilaitoksessa suoritettiin 100-bp: n sekvensointi käyttäen HiSeq 2000: aa (Illumina, CA, USA). Kohdennettu sekvensointi sekä modernia ja vanhaa DNA: ta oli myös suorittaa genomista teknisen alustan PlaGe (Genopole, Toulouse, Ranska) ja Proteiini-nukleiinihappo Kemia Laboratorio, University of Leicester. Alla on tiivistetty versio käytetyistä menetelmistä., Kunkin vaiheen osalta Täydelliset tiedot löytyvät täydentävistä menetelmistä. Lisätietoja hankkeelle tehdystä laajasta sukututkimuksesta on Oheisliitteessä 2.
Näytteen otto
DNA uutettiin sylki näytteet moderni sukulaiset Richard III, ja kaikki osallistujat rekrytoitiin kanssa tietoisen suostumuksen seuraavat projektin arvostelu yrityksestä the University of Leicester Tutkimuksen Eettinen Komitea.
luuranko 1 kaivettiin esiin ja näytteet otettiin puhtaissa oloissa37., Jokainen, joka osallistuu kaivanto Harmaa Friars sivuston, puhdas laboratorio Leicester ja osallistuvien laboratorioiden ja labran tulokset olivat oli niiden mitokondrioiden ja miehillä, Y-kromosomien kirjoitetaan. Sylkinäytteistä otettiin DNA: ta ja kaikki osallistujat rekrytoitiin tietoisella suostumuksella.
muinaisten näytteiden DNA-uutto
DNA otettiin hampaista ja luu – (reisinäytteistä). Kaikki menettelyjä tehtiin omistettu antiikin DNA-laboratorioissa, University of York ja Université Paul Sabatier, Toulouse asianmukaiset saastuminen varotoimet paikallaan., Kaksi uutto-aihiota otettiin mukaan ja käsiteltiin täsmälleen kuin ne olisivat otteita koko prosessin ajan. Pcr ja kirjasto kokeiluja myös edelleen tyhjä valvontaa.
Seksi-kirjoittamalla määritys suoritetaan Luuranko 1
vasta suunniteltu sukupuoli-kirjoittamalla määrityksen, joka koostuu PCR-alukkeet co-vahvistuksen SRY fragmentti UTX-ja UTY homologisia alueita oli käytetty. Tämä määritys on suunniteltu, jotta suhteellisen pieni kokoinen palasia SRY, UTX ja UTY olla co-monistettu näytteet sisältävät todennäköisesti hajonnut DNA10.,
Mitokondrioiden valvonta-alueen analyysi Luuranko 1
Analyysi hypervariaabelit segmentit (HV1, HV2 ja HV3) ja mtDNA valvonta-alueella toteutettiin vahvistamalla ja suoraan sekvensointi useita päällekkäisiä palasia vaihtelevat 153 250 bp koko (http://forensic.yonsei.ac.kr/protocol/mtDNA-midi-mini.pdf)22. Useita ampliconeja käytettiin PCR-tuotteiden kloonaukseen Toulousen laboratoriossa. Sekvensointi toteutettiin käyttäen Big-Dye Terminator V3: ta.,1 cycle sequencing kit (Applied Biosystems) ja kapillaarielektroforeesilla on ABI Prism 3730 Geneettinen Analysaattori (Applied Biosystems) Proteiini-nukleiinihappo Kemia Laboratorio, University of Leicester, tai genomista teknisen alustan PlaGe (Genopole).
Mitokondrioiden genomin/Y-SNP/HIrisplex kirjoittamalla Skeleton 1
Kirjastot olivat rakennettu seuraavat Meyer ja Kircher16, lukuun ottamatta sitä, että ensimmäisessä suodatusvaiheessa välillä tylppä pää korjaus ja sovitin sitomiseen oli korvattu lämpöä inaktivointi enzymes38,39., Kaksi mikropiiriä suunniteltiin, toinen mtDNA: n rikastukseen ja toinen ydinalan SNP: n rikastukseen. DNA rikastus suoritettiin hybridisaatio kaapata käyttäen Agilent 244k DNA SureSelect microarray (Agilent, Böblingen, Saksa). Ydinvoima-talteenotto -, Y-kromosomi koettimet oli suunniteltu kattamaan SNPs kannalta merkittävä Euroopan lineages14. Edelleen koettimet oli suunniteltu kattamaan SNPs merkitystä HIrisplex31 markkereita. Nämä kaksi sarjaa mittapäät (mitokondrioiden ja SNPs) käytettiin erikseen täyttää kaksi eri microarray malleja 1 × 244K muodossa., Jokaista mikroarray, kaappausprotokolla suoritettiin jälkeen Hodges et al.15 kanssa muutoksia ehdottanut Zhang et al.40 ja Fortes ja Paijmans38. Kirjastot yhdistettiin vuonna ekvimolaariset määrät ja sekvensoitiin kaksi kaistaa Illumina HiSeq 2000 alusta 100 SE-tilassa sekvensointi laitos, Kööpenhaminan Yliopisto, Tanska.
jokaisen kirjaston raakalukemat lajiteltiin kirjastovalmistelussa käytetyn kuuden nukleotidin indeksin perusteella. Tarkempiin analyyseihin valittiin vain 100%: n lukemat, jotka vastaavat indeksiä., Alle 25 nukleotidia hylättiin jatkoanalyysin jälkeen. Leikattu lukee oli kartoitettu autosomes ja sukupuoli kromosomit ihmisen viite genomin rakentaa 37 (GRCh37) ja rCRS (NC_012920.1) käyttää bwa-0.7.5 a-r405 (ref. 41). Jokaisessa linjauksessa tuotos bam-tiedostot yhdistettiin SAMtools 0.1.19: llä (ref. 41) ja PCR-kaksoiskappaleet poistettiin myöhemmin. Kartoitettu lukee suodatetaan perustuu kartoitus laatu >29 ja niiden yhdenmukaistamista ainutlaatuinen kantoja pitkin viittaus järjestyksessä.,
polymorfiset asemat tunnistettiin Samtooleilla (Samtoolit 0.1.19) ja bcftooleilla. Lopuksi vcfutils.pl käytettiin suodattaa luettelon vaihtoehdot mukaan Phred-skaalattu genotyyppi posterior todennäköisyys laatu >20 ja lukea syvyys on suurempi kuin 10. Välttää miscalling koska deaminaatio kuvio antiikin DNA-molekyylejä, kaikki polymorfinen kantoja raportoitu lähtö vcf-tiedosto tarkastettiin silmämääräisesti., Jos mitokondrioiden genomin kokoonpano viittaus oli visualisoida Tablet42, kun linjaus lukee sisältävät SNPs viite-kromosomit oli visualisoidaan IGV43.
SNP kirjoittamalla PCR: llä
capture lähestymistapa tuotti riittämätön kattavuus kaikki HIrisPlex ja Y-kromosomi SNPs ja siksi alukkeet oli suunniteltu tuottamaan amplicons sisältävät näitä SNPs sekä kaksi SNPs, joka edelleen määrittää Y-kromosomi haplogroup G: M285 (G1) ja P287 (G2) (ref. 14). Näitä monistettiin osana Römplerin ym. aiheuttamia multiplex-reaktioita.,44 tai singleplex reaktioita (käyttäen 40 sykliä ja joilla ei ole toisen asteen vahvistus) ja sekvensoitiin on Ion Torrent seuraavat kirjaston valmistamiseksi käyttäen Ion PGM Xpress 200-Mallin Pakki ja PGM 200 Sekvensointi Kit. Kattavuuden lisäämiseksi yhden merkkiaineen (rs28777) singleplex PCR ja sekvensointi toteutettiin Binladen et al.45
Kirjoittaminen of haplogroup G määritellään SNPs (M201, M285 ja P287) toistettiin Toulouse käyttäen singleplex Pcr. Näiden PCR-tuotteiden sekvensointi toteutettiin Big-Dye Terminator V3: lla.,1 cycle sequencing kit (Applied Biosystems) analysoitiin kapillaarielektroforeesilla on ABI Prism 3730 Geneettinen Analysaattori (Applied Biosystems) klo genomista teknisen alustan PlaGe (Genopole).
Y-kromosomin haplotyyppi analyysi
Antiikin ja modernin näytteitä Y-kromosomi-haplotyypit on saatu käyttämällä PowerPlex Y23 System (Promega) ja analysoidaan kapillaarielektroforeesilla on ABI Prism 3730 Geneettinen Analysaattori (Applied Biosystems) klo genomista teknisen alustan PlaGe (Genopole) ja ABI Prism 3130xl Genetic Analysaattori (Applied Biosystems), University of Leicester., Luuranko 1, tämä tehtiin kolme erillistä uutteet (RM2, LM1 ja LM3) kahdessa eri antiikin DNA-laboratorioiden (York ja Toulouse). Moderni sukulaisten, tämä toteutettiin kahdella eri otteita kahdessa eri moderni laboratorioiden (Leicester ja Toulouse).
Y-kromosomi SNP-analyysi modernin näytteitä
Seuraavat määrittäminen Y-haplotyyppi moderni mies-line näytteitä, ennusti haplogroup oli päättänyt käyttää Whit Ane on haplogroup ennustaja (http://www.hprg.com/hapest5/hapest5a/hapest5.htm?order=num)., Binary markkereita, jotka kattavat nämä ja niihin liittyvät suvusta oli kirjoitettu kaksi kanavanippua, jonka Tilannekuvan minisequencing menettely (Applied Biosystems) ja ABI3130xl Genetic Analyzer (Applied Biosystems), jota seuraa vahvistus käyttäen Sanger-sekvensointi. Somerset 3 oli päättänyt olla Hg-I (M170+ M223−, M253−)14 johdettu edelleen vahvistanut laboratoriossa Toulousessa. Somersets 1,2,4 ja 5 olivat päättäneet olla johdettu R1b-U152. Somersets 1,2,4 ja 5 testattiin SNPs jakamalla tämä clade13 (Z56, M126, Z36, Z192, M160 ja L2) käyttäen Sanger sekvensointi sekä labs.,
Moderni mtDNA-analyysi
Molemmat näytteet toistettiin kahdesti.
Näytteet olivat otettu käyttäen Oragene DNA Kokoelma sarjat (DNA Genotek), ja DNA uutetaan käyttämällä kahta eri menetelmää: Qiacube Veren ja Kehon Neste-protokolla (200 µl 200 µl eluointi) ja Oragene pöytäkirjan. Analysoida valvonta-alue, näytteet sekvensoitiin kahdesti sekä eteen-ja taaksepäin käyttämällä kahta päällekkäistä pohjamaali sarjaa (15973-296 ja 16524-614) käyttäen Iso-Dye Terminator V 3.1 (Applied Biosystems). Replikaattien ja näytteiden välillä ei havaittu eroja.,
Näytteet monistettiin täydellinen mitokondrioiden genomin sekä mekaaninen seuraavat Meyer et al.26 PCR-ampliconia sekvensoitiin ioni Torrent PGM-sekvensserillä Ion314-sirulla. Kirjastot olivat valmiita käyttää Ion Xpress Plus gDNA Fragmentti Library Preparation kit, kun taas mallin valmistelu ja sekvensointi suoritettiin käyttäen Ion PGM Xpress 200-Mallin Pakki ja Ion PGM 200 Sekvensointi Kit, vastaavasti. Raw reads kartoitettiin Takaisin rCRS (NC_012920.1) käyttäen Tmap-ohjelmistoa, joka sisältyy ionien Kohdistusliitännäiseen 3.2.1 (Torrent Suite Software 3.2.,1) Ion Torrent-palvelimella. Duplicate reads poisto ja variant calling suoritettiin käyttäen SAMtools 0.1.19 (ref. 41) ja paikallinen realisointi toteutettiin Genomianalyysityökalulla Kit46. Variantti sivustoja suodatettiin peruslaatu 20, kartoitus laatu 50 ja syvyys kattavuus 30 jonka jälkeen 33 polymorfisia sivustoja säilytettiin. Kaikki nämä sivustot on käsin tarkastettu ja vahvistettu Sanger sekvensointi molempiin suuntiin ja toistaa kahdesti.,
Saastumisen valvonta ja kvantifiointi
Moderni DNA-kontaminaation muinaisjäännöksiä oli ohjata seuraavilla tavoilla:
- 1
Kaivaus toteutettiin alla puhdas ehtoja (ks. Täydentävät Menetelmät)
- 2
Näytteet säilytettiin puhdas labs ja muinaisen DNA: n työstä vain omistettu muinaisen DNA: n palveluita.
- 3
Erillinen antiikin näytteet käsiteltiin erillisissä labs jäljitellä tuloksia.,
- 4
kaikilla laboratorion jäsenillä ja kaivajilla oli mtDNA-tyypitys ja Y-kromosomin kirjoittaminen tehtiin kaikille mukana olleille miehille. Yhdelläkään ei ollut vastaavaa mtDNA-tai Y-kromosomin tyyppiä.
todisteena merkittävä saastuminen, DNA-analyysi Luuranko 1 osoittaa, täydellinen mtDNA ottelu ML1 ja yhden emäksen ero ML2. Siinä on myös selkeä Y-STR haplotyyppi, joka on monistettu käyttämällä useita otteita, jotka on tuotettu ja testattu kahdessa erillisessä laboratoriossa., Lopuksi, tarkastelu (KS.täydentäviä menetelmiä) korvaaminen kuvio meidän lukee tukee myös tätä.
Tilastollinen analyysi
Ottaen konservatiivinen lähestymistapa kussakin vaiheessa, me laskea todennäköisyys kunkin kohteen havaittu todisteita kuhunkin kaksi vastakkaista hypoteeseja: Hypoteesi 1 (H1): Luuranko 1 on Richard III, ja Hypoteesi 2 (H2): Luuranko 1 ei ole Richard III.,
Koska se oli kohtuullista olettaa, että kaikki eri linjat todisteet olivat riippumattomia, yhteinen todennäköisyyttä, että kaikki todisteet on saatu kertomalla yksittäiset todennäköisyydet kunkin hypoteesin. H1: tä koskevan näytön paino, jota kutsutaan todennäköisyyssuhteeksi (LR), annettiin H1: n ja H2: n mukaisen todennäköisyyden suhteena. Sanomme, että oletus on ”konservatiivinen”, jos se vähentää LR.
LR voidaan muuntaa todennäköisyys, että H1 on totta, koska ennen todennäköisyydellä., Otimme lähtökohdaksi hetkellä, että Luuranko 1 oli ensin havaittu ja tunnistettu ihmisen luuranko, mutta ennen mitään arvioita ikä, sukupuoli, terveydentila ja kuolinsyy oli tehty. Siinä vaiheessa ei ollut merkittävää näyttöä siitä, että luuranko löytyy mitä uskotaan olleen sijainti Leicester Harmaa Friars kuoro voisi olla, että Richard III. Kaikki tiedot saatavilla, kun se Luuranko 1 paljastui, mukaan lukien sen tarkka sijainti ja luonne vakava, pidettiin tämän analyysin taustaksi tietoa, joka voi ilmoittaa ennen todennäköisyys., Perusteella, että tietoja, uskomme, että skeptinen tarkkailija ei ole voinut kohtuudella määritetty ennen todennäköisyys alle 1: 40. Tämä arvo oli ehdottanut edellisessä analyysissä (http://rationalgareth.com/), sen perusteella, mitä me arvioimme olla skeptisiä arvioita. Suurin todennäköisyys, joka voidaan perustella aiemmilla todisteilla, voi olla 1 / 2.
olemme käyttäneet asiaankuuluvia, saatavilla olevia tietoja mahdollisuuksien mukaan. Väistämättä subjektiivisia tarvitaan esimerkiksi, kyseinen viittaus väestön ja noin todennäköisyydet virhe raportoi tosiasiat., Niin pitkälle kuin oli mahdollista ja järkevää, meidän on pyrkinyt olemaan konservatiivinen lähestymistapa, esimerkiksi käyttämällä pseudocount menetelmä bias LR kohti neutraali arvo on 1, näin yritetään välttää vääriä suuria arvoja alhainen havaitut frekvenssit. Yksityiskohtaiset tiedot ja menetelmät, joita käytetään tilastollisen analyysin radiohiili tiedot, ikä ja sukupuoli luuranko, läsnäolo skolioosi, läsnäolo kuoleman haavat, Y-kromosomi ja mtDNA taajuuden tiedot löytyvät Täydentäviä Menetelmiä. Tulosten tiivistämiseksi: radiohiilidatan todennäköisyyssuhde oli 1.,84 edustaa vähäistä tukea H1: lle. Ikä-ja sukupuolitiedot tuottivat todennäköisyysannoksen 5,25, mikä taas edusti H1: n vähäistä kannatusta. Läsnäolo yksi lapa korkeampi kuin muilla, raportoitu Richard on elinaikana, voi johtua skolioosi (Luuranko 1 oli vaikean idiopaattisen nuorten-onset skolioosi) tai kaksi tiedossa muita ehtoja, Erb Pareesi ja Sprengel on epämuodostuma, jotka molemmat ovat hyvin harvinaisia. Alle H1, edellä mainitut määrät antavat arvioitu todennäköisyys 0.,90 tarkkailla skolioosi annettu kuvaus Richard III: n fyysinen ulkonäkö (=skolioosi korko summa jaettuna kolmesta hinnat), joka kerrottuna 0.95 sallia mahdollisuus, että kirjataan kuvaus oli virheellinen. Tämä johtaa LR 212, joka tarjoaa kohtalaisen vahvan tuen H1. Kuoleman aikaisten vammojen vuoksi LR oli 42, ja H1: lle annettiin niin maltillista tukea. Luuranko 1: n Y-kromosomi ei vastannut Rikhard III: n genealogisesti määritettyjä patrilineaalisia sukulaisia., Tämä voisi selittyä sillä, väärä isyys tapahtuma yksi tai useampi 19 otaksuttu isä–poika-yhteyksiä Richard III ja Henry Somerset, viides Herttua Beaufort. Y-kromosomin tulokset osoittavat myös yhden väärän isyystapahtuman Henry Somersetin ja hänen viiden nykyaikaisen, oletetun patrilineaarisen jälkeläisensä välillä. Konservatiivinen, valitsimme julkaistu väärä isyys-korko, joka oli (1) alempi kuin mikään muu julkaistu korko, että meillä considered17,47 ja (2) perustuu sukututkimuksen data18., Tähän lisäämme vääriä isyys-tapahtuma 19 otaksuttu isä–poika-yhteyksiä Henry Somerset ja viisi nykyaikainen mies Somersets. Tämä antaa todennäköisyydellä ainakin yksi väärä isyys-tapahtuma 19 otaksuttu isä–poika-yhteyksiä Richard III ja Henry Somerset 0.16. Kun otetaan huomioon, että väärä isyys tapahtuma on tapahtunut alle H1, väestön tiheys Luuranko 1: n Y-haplotyyppi on sama nojalla H1 ja H2 ja peruuttaa ulos LR-laskenta. Näin ollen LR on 0,16, mikä edustaa vähäistä näyttöä H1: tä vastaan.,
mtDNA sekvenssit Luuranko 1 ja oletetaan, 19-meioosin matrilinear suhteessa Richard III, Michael Ibsen, hyväksytty täysin. Myös 21-meioosin sukulainen sopi yhteen lukuun ottamatta yhtä emästä (8994). Jälkimmäinen havainto on yhtä todennäköinen H1: n ja H2: n kohdalla, kun otetaan huomioon Michael Ibsenin havaittu sekvenssi, joten se peruutetaan LR: ssä. Näin ollen tarvitsemme vain samankaltaisuuksia Michael Ibsenin ja Skeleton 1: n jakaman sekvenssin havainnointiin.
saada todennäköisyys alle H1, vaadimme mtDNA mutaatio, ja tässä tapauksessa korkeat arviot ovat konservatiivisia. Parsons ym.,28 raportoi 10 verrokkialueen mutaatiota 327 sukupolvessa käyttäen sukututkimustietoja. Koska tämä viittaa siihen, korkeampi kuin muiden julkaistujen arvioiden ja perustuu sukututkimuksen tiedot, me käytetään se johtaa todennäköisyydellä 0,52 ilman mutaatio 19 meioses.
alle H2-todennäköisyydellä tarvitaan luurangon 1 haplotyypin populaatiofraktio. Vaikka me on saatu koko mtDNA-genomin sekvenssin Luuranko 1, tunnistimme vähän julkaisi koko-genomin vertailu tiedot Englannista., Näin ollen tilastollinen analyysi, käytimme vain mtDNA valvonta-alueiden välillä kantoja 16,093 ja 16,320 ja välillä 00073 ja 00188, jonka me saatu sopivia englanti vertailu tietojen päivitys Röhl et al.30, täydennettynä mtDNA-sekvensseillä, joita Roots for Real toimittaa (Genetic esi-isä Ltd., Clare, Suffolk, Iso-Britannia). Käyttämällä vain näitä lyhyitä jaksoja valvonta-alueen alle H2 on konservatiivinen, koska väestö murto havaittu valvonta-alueella sekvenssejä voi olla pienempi kuin koko mtDNA-genomin., Kyseinen viittaus väestöstä on yli 500 vuotta aikaisemmin, mutta koska suuri väestö koko tarkastelujakson aikana, odotamme väestön taajuuksia on muuttunut vain vähän viimeisten viiden vuosisadan ajan. Löysimme 1 haplotyypin luurangon esiintymistiheyden olevan 0 tietokannasta 1823, johon lisäämme yhden Michael Ibsenissä havaitun tapauksen. Tämä lähestymistapa on, jälleen, konservatiivinen kuin Michael oli otokseen, koska hänen tiedetään sukututkimuksen suhteessa Richard III. Tämä johtaa LR 478 edustavat kohtalaisen vahvaa näyttöä siitä, että H1.,
– Meillä on myös huomata, että siellä oli ei vastaa tietokantaan 26,127 Euroopan mitokondrioiden valvonta-alue haplotyypit (www.empop.org)29. Emme ole riippuvaisia tätä tietokantaa, koska se on Euroopan laajuinen sijaan nimenomaan Englannissa ja koska toteamista kysymyksiä, mutta se viittaa siihen, että Luuranko 1 haplotyyppi voi olla paljon harvinaisempia kuin voidaan päätellä pienemmät englanti tietokantaan. Toteamme myös, että naisten liikkuvuus on yksi Euroopan aatelisto on todennäköisesti ollut paljon suurempi kuin väestössä, koska avioliitto käytäntöjä, jotka liittyvät poliittisen allianssin muodostumista., Tällaisia käytäntöjä olisi tarjota joitakin perusteita käyttää Euroopan mtDNA-tietokanta, ja niin ottaen huomioon haplotyyppi löytyy Luuranko 1 ja Michael Ibsen olla erittäin harvinaisia. Täydentävä Taulukko 10, näytämme joitakin kuvaavia tuloksia käyttämällä Euroopan tietokantaan osoittaa vaikutuksista todetaan, että Luuranko 1 haplotyyppi on yhtä harvinainen ehdottivat, että tietokantaan.
LRs eri yhdistelmiä todisteita, ja kaksi posterior todennäköisyydet, on esitetty Täydentävä Taulukossa 10., Käyttää kaikkia todisteita, tuki H1 on erittäin vahva LR 6,7 miljoonaa, niin että skeptikko olisi ajettu siihen tulokseen, että todennäköisyys, että Luuranko 1 ei ole Richard III on vähemmän kuin 1: 100000, kun taas niille, ottaen 1 2 alkuasentoon, että todennäköisyys on paljon vähemmän kuin 1 miljoonaa euroa. Ottaen huomioon konservatiivinen oletuksia, meidän laskelma on kuvattu edellä, me pitävät tätä annetun totuuden H1 epäilystä.