bakteerikannat ja plasmidit

seuraavat E. coli-kannat olivat tässä tutkimuksessa käytetty: DH5a, BL21(DE3) (Novagen), CLM24, ja Origami2(DE3) gmd::kan ΔwaaL. DH5a: ta käytettiin plasmidien kloonaukseen ja puhdistamiseen., BL21(DE3) käytettiin ilmaisua ja puhdistus scFv13-R4DQNAT tunnustaja proteiinia, jota käytettiin kaikissa in vitro-glykosylaatio reaktioita. CLM24 on glyco-optimoitu johdannainen W3110, joka kuljettaa poistetaan geeni, joka koodaa WaaL ligase, mikä helpottaa kertyminen valmiiksi kootun glycans päälle Und-PP36. CLM24 käytettiin puhdistus CjOST entsyymi, orgaaniset liuotin-pohjainen louhinta kaikki LLO sbearing bakteeri glycans, ja lähde rasitusta valmistelu otteet kanssa ja ilman valikoivasti rikastettu glykosylaatio osia., Origami2(DE3) gmd::kan ΔwaaL oli tuottaa Man3GlcNAc2-laakeri LLOs ja oli tuottama juokseva mutaatio kanssa P1vir faagin transduktio käyttäen vastaavaa kannat Keio collection62 kuin luovuttajien, joka saatiin Coli perintötekijöiden Center (CGSC). Lyhyesti, luovuttajan lysate oli luotu kanta JW3597-1 (ΔrfaL734::kan) ja tuloksena faagin oli käyttää tartuttaa Origami2(DE3) kohdesoluihin., Pinnoituksen jälkeen transformants on LB-levyt, jotka sisältävät kanamysiini (Kan), onnistunut transductants oli valittu ja heidän Kan vastus kasetit poistettiin muuttamalla lämpötila-herkkä plasmidi pCP2063. Tuloksena kanta, Origami2(DE3) ΔwaaL, oli sitten käytetään myöhemmin poistetaan gmd-geenin mukaan identtinen strategia mutta käyttäen luovuttajan kanta JW2038-1 (Δgmd751::kan).

kaikki tutkimuksessa käytetyt plasmidit on lueteltu Lisätaulukossa 2. Tässä tutkimuksessa rakennetut plasmidit tehtiin tavallisilla kloonausprotokollilla ja vahvistettiin DNA-sekvensoinnilla., Näitä olivat muun muassa seuraavat Plasmidi pJL1-scFv13-R4DQNAT kertyi ensimmäisen PCR-monistetaan geeni, joka koodaa scFv13-R4DQNAT alkaen pET28a-scFv13-R4(N34L, N77L)DQNAT, jossa N34L ja N77L mutaatiot olivat käyttöön ja poistaa oletetun sisäisen glykosylaatio sivustoja scFv13-R452. Saatu PCR-tuote oli sitten liitettiin välillä NcoI ja SalI rajoitus sivustoja plasmidi pJL1, lemmikki-pohjainen vektori käytetään CFPS49. Plasmidi pJL1-sfGFP217-DQNAT oli tuotettu ligaatio-kaupallisesti-syntetisoitu DNA-fragmentti, joka koodaa sfGFP217-DQNAT (Integroitu DNA Teknologian avulla) osaksi pJL1., Tämä versio sfGFP sisältää ylimääräisen GT lisäys sen jälkeen, kun K214, joka ulottuu tämä joustava silmukka ennen lopullista beta sheet64. Osaksi tämä joustava silmukka, välittömästi sen jälkeen, kun T216, me vartetut 21-aminohapon sekvenssi, joka sisältää C. jejuni AcrA N123 glykosylaatio site34, mutta optimaalinen DQNAT sequon sijasta native AcrA sequon. Vastaavia menettelyjä käytettiin tuottaa plasmidit pJL1-sfGFP217-AQNAT, pJL1-hEPO22-DQNAT-26, pJL1-hEPO36-DQNAT-40, ja pJL1-hEPO81-DQNAT-85., Jos pJL1-hEPO22-DQNAT-26, geenin kypsä ihmisen EPO oli suunniteltu niin, että natiivi sequon klo N24 oli muuttunut alkaen 22-AENIT-26 optimaalinen bakteerien sequon, DQNAT. Samanlaisia kloonaus strategioita tehtiin erikseen esitellä optimaalinen DQNAT motiiveja paikka natiivi hEPO sequons 36-NENIT-40 ja 81-LVNSS-85. Yhdistelmä-ilmaus E. coli O9 primer-sovitin glycan (Man3GlcNAc) on Und-S oli saavuttaa kloonaus geenien, koodaus WbdB ja WbdC mannosyltransferase entsyymejä, jotka on johdettu E., coli ATCC31616 kokoamiseksi glycan, ja RfbK ja RfbM, myös peräisin E. coli ATCC31616 lisätä uima-allas käytettävissä olevien BKT-mannoosi, E. coli MG1655. Plasmidi pConYCGmCB oli rakennettu isoterminen Gibson kokoonpano ja koodaa keinotekoinen operon koostuu: (i) hiiva glycosyltransferases Alg13, Alg14, Alg1, ja Alg2 varten Man3GlcNAc2 glycan biosynthesis12 ja (ii) E. coli-entsyymien phosphomannomutase (ManB) ja glukoosi-1-fosfaatti guanylyltransferase (Näy), jotka yhdessä lisäävät saatavuus BKT-mannoosi-substraatteja varten Alg1 ja Alg2 entsyymejä.,

Proteiini ilmentyminen ja puhdistus

Puhdistus CjPglB suoritettiin aiemmin kuvattu protocol34. Lyhyesti, yhden siirtomaa E. coli CLM24 kuljettaa plasmidi pSN1865 kasvatettiin yön yli 37 °C 50 mL: ssa Luria-Bertani (LB; 10 g L−1 tryptone 5 g L−1 hiivauute, 5 g L−1 NaCl, pH 7.2) täydennettynä ampisilliini (Amp) ja 0,2% (w/v,%) d-glukoosi. Yön aikana solut olivat subcultured 1 L tuoreita loistava liemi (TB; 12 g L−1 tryptone, 24 g L−1 hiiva-uute, joka on 0,4% (v/v%) glyserolia, 10% (v/v%) 0.17 M KH2PO4/0.,72 M K2HPO4-fosfaattipuskuri), jota täydennetään vahvistimella ja kasvatetaan, kunnes absorbanssi 600 nm: ssä (Abs600) saavutti arvon ~0,7. Inkubaatiolämpötila säädettiin 16 °C: een, minkä jälkeen proteiiniekspressio indusoitiin lisäämällä l-arabinoosi lopulliseen pitoisuuteen 0,02% (w/v%). Proteiinin ilmentyminen oli sallittu edetä 20 h, 16 °C. Solut kerättiin sentrifugoimalla ja sitten häiritsi käyttäen homogenizer (Avestin C5 EmulsiFlex). Lysaatti sentrifugoitiin kennojätteiden poistamiseksi ja supernatantti ultrakentrifugoitiin (100 000×g) 2 tunnin ajan 4 °C: ssa., Saatu pelletti, joka sisältää murto-kalvo oli täysin uudelleen suspendoidun kanssa Potter-Elvehjem kudoksen homogenizer puskurissa, jossa on 50 mM HEPES, 250 mM NaCl, 10% (v/v%) glyserolia, ja 1% (w/v%) n-dodecyl-β-d-maltoside (DDM), pH 7.5. Suspensiota inkuboitiin huoneenlämmössä 1 h helpottaa pesuaineen solubilization ja CjPglB natiivi E. coli lipidejä, jotka poistettiin myöhemmin ultrasentrifugointi (100,000 x g) 1 h 4 °C., Supernatantti, joka sisältää DDM-liukoiseksi CjPglB puhdistettiin käyttäen Ni-NTA hartsi (Thermo) valmistajan eritelmien mukaisesti lukuun ottamatta sitä, että kaikki puskurit olivat täydennetty 1% (w/v%) DDM. Eluoituvat murto päässä Ni-NTA puhdistus oli sitten kohdistuu koko syrjäytymisen kromatografia (SEC) käyttäen ÄKTA Explorer FPLC-järjestelmä (GE Healthcare) kanssa Superdex 200 10/300 GL-sarakkeessa. Tehokkaasti puhdistettu proteiini, joka on tallennettu lopullinen pitoisuus 1-2 mg mL−1 OST varastointi-puskuri (50 mM HEPES, 100 mM NaCl, 5% (v/v%) glyserolia, 0.01% (w/v%) DDM, pH 7.5) 4 °C., Glyseroli pitoisuus näytteessä oli säädetty 20% (v/v%) pitkäaikainen säilytys -80 °C.

Puhdistus tunnustaja proteiinia scFv13-R4DQNAT toteutettiin kuvattu previously52. Lyhyesti sanottuna plasmidia pET28a-scFv13-R4(N34L, N77L) sisältävää E. coli-kantaa BL21(DE3)kasvatettiin 1 litrassa kanamysiinin mukana toimitettua tuberkuloosia. Kulttuuri oli inkuboidaan 37 °C: ssa, kunnes Abs600 saavuttanut ~0.7, jolloin proteiinin ilmentyminen oli aiheuttama lisäksi isopropyyli-β-d-1-thiogalactopyranoside (IPTH) lopulliseen pitoisuuteen 0,1 mM. Proteiinin ilmentyminen oli sallittu edetä 20 h 25 °C: ssa., Soluja korjattiin ja häirittiin identtisesti edellä kuvatulla tavalla. ScFv13-R4DQNAT-proteiini puhdistettiin ni-NTA-hartsilla ja sen jälkeen SEC: llä valmistajan protokollien mukaisesti. Proteiinia oli tallennettu lopullinen pitoisuus 1-2 mg mL−1-varastointi-puskuri (50 mM HEPES, 250 mM NaCl, 1 mM EDTA, pH 7.5) 4 °C.

Louhinta LLOs

pöytäkirja orgaaninen liuotin uuton LLOs E. coli-kalvoja oli muokattu aiemmin kuvatulla protocol34,66., Useimmissa tapauksissa yksi siirtomaa kanta CLM24 kuljettaa plasmidi kohde glycan biosynteesi (Täydentävä Taulukko 2) oli kasvanut yön yli LB media. Merkittäviä poikkeuksia olivat LLOs laakeri W. succinogenes N-glycan (WsLLOs), jotka on tuotettu käyttämällä DH5a-soluja kuljettaa pEpiFOS-5pgl5 fosmid (ystävällisesti Tohtori Markus Aebi), ja LLO sbearing Man3GlcNAc2, jotka on tuotettu käyttämällä Origami2(DE3) gmd::kan ΔwaaL solut kuljettavat plasmidi pConYCGmCB. Yön yli soluissa oli 1 L tuberkuloosia, jota täydennettiin sopivalla antibiootilla ja jota kasvatettiin kunnes Abs600 saavutti ~0,7., Inkubaation lämpötila oli säädetty 30 °C biosynteesiä kaikki glycans lukuun ottamatta Man3GlcNAc2, joka oli säädetty 16 °C. plasmidi pMW07-pglΔB, proteiinin ilmentyminen oli aiheuttama l-arabinoosia lopullinen pitoisuus 0,2% (w/v%) kun taas fosmid pEpiFOS-5pgl5 induktio oli isopropyyli-β-d-1-thiogalactopyranoside (IPTH) lopullinen pitoisuus on 1 mM. Kaikki muut plasmidit mukana perustava vetäjät ja näin ollen ei vaadi kemiallisten aineiden vaikutuksesta. Jälkeen 16 s, solut kerättiin sentrifugoimalla ja solujen pelletit olivat kylmäkuivattu loppuun kuivaksi -70 °C: seen., Louhinta CjLLOs, syntyperäinen ja suunniteltu ClLLOs, E. coli O9 primer-sovitin LLOs, ja WsLLOs, että lyophilisates keskeytettiin 10:20:3: n suhde CHCl3:CH3OH:H2O-liuosta ja inkuboitiin huoneenlämmössä 15 min helpottamiseksi louhinta LLOs. Louhinta LLO sbearing Man3GlcNAc2 glycan injektiokuiva-aine, kylmäkuivattu oli sittemmin keskeytetty 10:20 (v/v%) CHCl3:CH3OH ratkaisu -, vesi -, ja 10:20:3 CHCl3:CH3OH:H2O-liuos, jossa 15 min inkubointi huoneenlämmössä välillä kunkin vaiheen., Kussakin tapauksessa, lopullinen suspensio sentrifugoidaan (4000×g) 15 min, jonka jälkeen orgaaninen kerros (alin kerros) kerättiin ja kuivattiin tyhjiössä rikastamo seuraa kylmäkuivaamalla. Lyophilisates sisältävät aktiivisia LLOs olivat sekoitettava uudelleen solu-ilmainen glykosylaatio puskuria (10 mM HEPES, pH 7.5, 10 mM MnCl2, ja 0,1% (w/v%) DDM) ja säilytettiin 4 °C: ssa.

Valmistautuminen raakaöljyn S30 otteita

CLM24 lähde kantoja kasvatettiin 2×YTPG (10 g L−1 hiivauute, 16 g L−1 tryptone 5 g L−1 NaCl, 7 g L−1 k2hpo4-pitoisuudet, 3 g L−1 KH2PO4, 18 g L−1 glukoosi, pH 7.2), kunnes Abs600 saavuttanut ~3., Tuottaa OST-rikastettu uute, CLM24 kuljettaa plasmidi pSF-CjPglB, pSF-CcPglB, pSF-DdPglB, pSF-DgPglB, tai pSF-DvPglB52 käytettiin lähteenä rasitusta. Tuottaa LLO-rikastettu uute, CLM24 kuljettaa plasmidi pMW07-pglΔB käytettiin lähteenä rasitusta. Tuottaa yhden potin ote sisältää sekä OST ja LLOs, CLM24 kuljettaa pMW07-pglΔB ja pSF-CjOST käytettiin lähteenä rasitusta. Tarvittaessa ilmaus glykosylaatio osia oli aiheuttama l-arabinoosia klo lopullinen pitoisuus 0,02% (w/v%)., Induktion jälkeen, proteiinin ilmentyminen oli sallittu edetä 30 °C lämpötilassa tiheys OD600 ~3, jolloin solut kerättiin sentrifugoimalla (5000×g) 4 °C: ssa 15 min. Kaikki myöhemmät vaiheet suoritettiin 4 ° C: ssa, ellei toisin mainita. Pelletoitiin solut pestiin kolme kertaa S30-puskuria (10 mM tris-asetaatti, 14 mM magnesium asetaatti, 60 mM, kaliumasetaatti, pH 8.2). Viimeisen pesun jälkeen soluja pelletoitiin 7 000×g 10 minuutin ajan ja ne jäädytettiin nestemäisellä typellä. Lysaatin valmistamiseksi solut sulatettiin ja sekoittuivat tasalaatuisiksi 1 mL: ssa S30-puskuria 1 grammassa märkäsolumassaa., Solut hajotettiin käyttämällä Avestin EmulsiFlex-B15 korkea-paine homogenizer 20,000–25,000 psi yhdellä kulkua. Tämän jälkeen lysaatti sentrifugoitiin kahdesti 30 000×g: n lämpötilassa 30 minuutin ajan kennojätteiden poistamiseksi. Supernatantti siirrettiin uuteen astiaan ja inkuboitiin kanssa ravistelu 250 rpm 37 °C: ssa 60 min hajota endogeenisen mRNA selostukset ja häiritä olemassa olevia polysome komplekseja lysate. Sentrifugoinnin jälkeen (15 000×g) 15 minuutin ajan 4 °C: ssa kerättiin supernatanttia, noteerattiin, jäädytettiin nestemäisessä typessä ja varastoitiin -80 °C: ssa., S30-uute oli aktiivinen noin kolmen jäätymisjakson ajan ja sisälsi ~40 g L-1−kokonaisproteiinia Bradford-määrityksellä mitattuna.

Cell-free-glykoproteiinin synteesi

in vitro-glykosylaatio puhdistettua tunnustaja proteiinia, reaktiot tehtiin 50 µL: n tilavuutta, joka sisältää 3 µg scFv13-R4DQNAT, 2 µg puhdistettua CjPglB, ja 5 µg uutettu LLOs (jos Man3GlcNAc2 LLOs, 20 µg käytettiin) in vitro-glykosylaatio puskuria (10 mM HEPES, pH 7.5, 10 mM MnCl2, ja 0,1% (w/v%) DDM). Reaktioseosta inkuboitiin 30 ° C: ssa 16 tunnin ajan., Glykoproteiinien raakauutteeseen perustuvan ilmentymisen osalta toteutettiin kaksivaiheinen järjestelmä. Ensimmäisessä vaiheessa proteiinisynteesi toteutettiin modifioidulla PANOx-SP-järjestelmällä67. Erityisesti, 1.5 mL microcentrifuge putket syytettiin 15-µL reaktioita, jotka sisältävät 200 ng plasmidi-DNA: ta, 30% (v/v%) S30 pura ja seuraavat: 12 mM magnesiumia glutamaatti, 10 mM ammonium-glutamaatti, 130 mM kalium-glutamaatti, 1.2 mM adenosiinitrifosfaatista (ATP), 0.85 mM guanosiini trifosfaatti (GTP), 0.85 mM uridiini trifosfaatiksi (UTP), 0.85 mM sytidiinin trifosfaatiksi (CTP), 0.034 mg mL−1 foliinihappo, 0.,171 mg mL−1 E. coli-tRNA (Roche), 2 mM jokaista 20 aminohappoa, 30 mM phosphoenolpyruvate (PEP, Roche), 0,4 mM nikotiiniamidiadeniinidinukleotidi (NAD), 0,27 mM koentsyymi A (CoA), 4 mM oksaalihappoa, 1 mM putreskiini, 1,5 mM spermidine, ja 57 mM HEPES. Sillä scFv13-R4DQNAT, hEPO22-DQNAT-26, hEPO36-DQNAT-40, ja hEPO81-DQNAT85, tämä vaihe suoritettiin 30 °C: ssa 4 h alle hapettavissa olosuhteissa kun taas sfGFP217-DQNAT ja sfGFP217-AQNAT tämä vaihe suoritettiin 30 °C: ssa 5 min pelkistävissä olosuhteissa., Sillä hapettavat olosuhteet, ote oli pre-ilmastointi 750 µM iodoacetamide pimeässä huoneenlämmössä 30 min ja reaktio sekoitus oli mukana 200 mM glutationi 3:1 suhde hapettunut ja vähentää muotoja. Aktiivinen sfGFP tuotot alkaen solu-ilmainen reaktiot olivat määrällisesti mittaamalla fluoresenssi in-lysate ja muuntamalla pitoisuus tavallisella käyrä kuten aiemmin described39. Toisessa vaiheessa, proteiinien glykosylaatio aloitettiin lisäämällä MnCl2 ja DDM lopullinen pitoisuus 10 mM ja 0.,1% (w/v%), vastaavasti, ja saa edetä 30 °C 16 h. Tarvittaessa, reaktiot olivat täydennetty 2 µg puhdistettua CjPglB (eli CFGpS kanssa LLO-rikastettu otteita) tai 5 µg liuotinuutettu CjLLOs (eli CFGpS OST-rikastettu otteita). Kaikki reaktiot pysäytettiin lisäämällä Laemmli sample buffer, joka sisältää 5% ßME, minkä jälkeen näytteitä keitettiin 100 °C: ssa 15 min ja analysoitiin SDS-PAGE ja western blotting.

Western blot-analyysi

sisältävät Näytteet 0.5 µg tunnustaja proteiinia oli ladattu SDS-PAGE-geelit., Seuraavat elektroforeettinen erottaminen, proteiinit siirrettiin geelit päälle Immobilon-P polyvinylideenifluoridia difluoride (PVDF) kalvot (0,45 µm) valmistajan protokollan. Kalvot pestiin kaksi kertaa TBS-puskuria (80 g L−1 NaCl, 20 g L−1 KCl, ja 30 g L−1 Tris-base), jonka jälkeen itämisaika 1 h esto-liuosta (50 g L−1 rasvatonta maitoa TBST (TBS mukana 0.05% (v/v%) Tween-20)). Kun esto, kalvot pestiin 4 kertaa TBST 10 min inkubaatio välissä pestä., Ensimmäinen kalvo oli skannattu kanssa 6xHis-polyklonaalista vasta-ainetta (Abcam, ab137839, 1:7500), että nimenomaan tunnistaa hexahistidine epitope luokka, kun taas toinen jäljitellä kalvo oli skannattu yksi seuraavista: hR6 (1:10,000) seerumin kani, joka tunnistaa kotoisin C. jejuni ja C. lari glycan sekä suunniteltu C. lari glycan tai ConA-HRP (Sigma, L6397, 1:2500), joka tunnistaa Man3GlcNac ja Man3GlcNAc2. Hyvää kalvoja oli esiintynyt vähintään 1 h ravistellen huoneenlämmössä, minkä jälkeen kalvot pestiin TBST samalla tavalla kuin edellä on kuvattu., Kalvoja inkuboitiin lyhyesti huoneenlämmössä läntisen ECL-substraatin (BioRad) kanssa ja imagoitiin ChemiDocTM XRS + – järjestelmän avulla. OST entsyymejä, rikastettu otteita havaittiin identtinen SDS-PAGE-menettelyn jälkeen Western blot-analyysi, jossa polyklonaalista vasta-ainetta tiettyyn LIPPU-epitope tag (Abcam, ab49763, 1:7500). Se glycan osa LLOs rikastettu otteita oli havaita suoraan tiputtelua 10 µL otteita päälle nitroselluloosa kalvot seuraa havaitseminen hR6 seerumin. Poistamattomat immunoblot-kuvat on esitetty täydentävässä Kuvassa. 8.,

MS-analyysi

Noin 2 µg scFv13-R4DQNAT proteiinia ratkaisu oli denaturoitu 6 M urea, vähentää 10 mM DTT, inkuboidaan 34 °C: ssa 1 s, sitten alkyloidut 58 mM iodoacetamide 45 min pimeässä huoneenlämmössä ja sammutettiin viimeisen 36 mM DTT. Ratkaisu oli sitten laimennettiin 50 mM ammoniumbikarbonaattia (pH 8.0) lopullinen puskuri pitoisuus 1 M urea ennen trypsiini ruoansulatusta. Näyte oli pilkottu 0,2 µg trypsiini 18 h 37 °C. ruoansulatusta pysäytettiin lisäämällä TFA lopullinen pH 2.2–2.5., Tämän jälkeen näytteet suolattiin SOLA HRP SPE-patruunalla (ThermoFisher Scientific). Patruunat olivat ilmastoitu 1 × 0,5 mL: 90% metanolia, 0.1% trifluorietikkahappoa (TFA) ja tasapainotettu, jossa on 2 × 0.5 mL 0,1% (v/v%) TFA. Näytteet laimennettiin 1:1 0,2%: lla (v/v%) TFA: ta ja ajettiin hitaasti sylinteriampullien läpi. Pesun jälkeen 2 × 0.5 mL tasapainotilan ratkaisu, peptidit olivat eluoitiin 1 × 0,5 mL: n, 50% (v/v%) asetonitriili (ACN), joka on 0,1% (v/v%) TFA ja kuivataan nopeus tyhjiö linko.,

nanoLC–MS/MS analyysi suoritettiin käyttäen UltiMate3000 RSLCnano (Dionex) yhdistettynä on Orbitrap Fusion (ThermoFisher Scientific) massa spektrometri, joka on varustettu nanospray Flex-Ion Lähde. Jokainen näyte oli rekonstruoitu 22 µL 0,5% (w/v%) FA ja 10 µL oli lastaamista Suosiota PepMap 100 C18 ansa sarakkeessa (5 µm, 100 µm × 20 mm, 100 Å, ThermoFisher Scientific) kanssa nanoViper Varusteet 20 µL min−1 0,5% FA on-line suolan poisto., Kun pelattu 2 min, venttiili kytkeä, jotta peptidejä voidaan erottaa siitä Suosiota PepMap C18 nano-sarakkeessa (3 µm ja 75 µm × 25 cm, ThermoFisher Scientific), 90 min. kaltevuus 5 23% 35% B 300 nL min−1 (3 73 93 min, vastaavasti), jota seuraa 9-min riehua 90% B-9-min pitää vähintään 90% B ja nopea kytkin 5% B 1 min. Pylväs palautettiin 5% B: llä 20 minuuttia ennen seuraavaa juoksua. Orbitrap-fuusio toimi positiivisessa ionitilassa nanospray-jännitteen ollessa 1,7 kV ja lähdelämpötilan ollessa 275 °C., Ft -, IT-ja quadrupole mass-analysaattoreiden ulkoinen kalibrointi suoritettiin ennen analyysia. Se Orbitrap koko MS-tutkimus scan (m/z 400-1800) seurasi Top 3 s data-riippuvainen Korkeampi Törmäyksen dissosiaatio tuotteen ion laukaisi ETD (HCD-pd-ETD) MS/MS-skannaa esiaste peptidejä, joilla 2-7 maksut ylittävät raja-ion laskea 50 000 normalisoitu törmäyksen energia 32%., MS-tutkimus skannaa hankittu klo erotuskyky 120000 (FWHM m/z-200), jossa on Automaattinen Gin Control (AGC) = 2e5 ja suurin injektio-aika (Max) = 50 ms, ja HCD-MS/MS-skannaa resoluutio 30000 kanssa AGC = 5e4, Max = 60 ms ja K eristäminen ikkuna (m/z) klo 3 massa-alueella m/z 105-2000. Dynaaminen syrjäytymisen parametrit asetettiin 1 60 s syrjäytymisen kesto ±10 ppm syrjäytymisen massa leveys. Tuotteen Ion laukaista lista koostui huiput 204.0867 Da (HexNAc oxonium ion), 138.0545 Da (HexNAc fragmentti), ja 366.1396 Da (HexHexNAc oxonium ioneja)., Jos yksi HCD tuote-ioneja luettelossa oli havaita, kaksi charge-riippuvainen ETD-MS/MS-skannaa (EThcD) kanssa HCD täydentävää aktivointi (SA) samalla esiaste ioni olivat laukeaa ja kerätään lineaarinen ioniloukku. Saat kaksin verroin veloitetaan esiasteita, ETD reaktioaika on asetettu 150 ms ja SA energia oli asetettu 30%, kun taas samat parametrit 125 ms ja 20%, vastaavasti, käytettiin korkeampi veloitetaan esiasteita. Sekä ion laukaisi skannaa, fluoranteenia ETD reagenssin tavoite oli asetettu 2e5, AGC tavoite 1e4, Max 105 ms ja eristäminen ikkuna klo 3. Kaikki tiedot hankittiin Xcalibur-Valmisteella 3.,0 operation software ja Orbitrap Fusion Tune sovellus v. 2.1 (ThermoFisher Tieteellinen).

Kaikki MS-ja MS/MS-raaka-spektri kustakin näytteestä tutkittiin käyttäen Byonics v. 2.8.2 (Proteiini Metrics) avulla e. coli-proteiini-tietokanta, johon on lisätty scFv13-R4DQNAT proteiinia kohdesekvenssin. Peptidi haku parametrit olivat seuraavat: kaksi jäi pilkkominen täyden trypsiini ruoansulatusta kiinteä carbamidomethyl muuttaminen kysteiini, muuttujan muutoksia, metioniini hapettumista, ja deamidation siitä, asparagiini/glutamiini jäämiä., Peptidi massa toleranssi oli 10 ppm ja fragmentti massa suvaitsevaisuuden arvoja HCD-ja EThcD spektrit olivat 0,05 ja 0,6 Da, vastaavasti. Sekä yleisten että harvinaisten muutosten enimmäismäärä asetettiin kahteen. Glykaanihaku tehtiin 309 nisäkkään N-linkittyneen glykaanin listaa vastaan Byoniohjelmistossa. Tunnistettuja peptidejä suodatettiin enintään 2%: n FDR-arvosta. Ohjelmisto vei haun tulokset laskentataulukkoon.

GFP fluoresenssi toiminta

toiminnan solu-vapaa-johdettu sfGFP määritettiin käyttämällä in-lysate fluoresenssi analyysi on kuvattu previously39., Lyhyesti 2 µL solutonta syntetisoitua glykosyloitua sfGFP-reaktiota laimennettiin 48 µL: aan nanopurevettä. Tämän jälkeen ratkaisu laitettiin Costar 96-well black assay-levyyn (Corning). Magnetointi ja sfGFP-fluoresenssin emissioaallonpituudet olivat vastaavasti 485 nm ja 528 nm.

Entsyymi-immunologinen analyysi (ELISA)

Vastanäyttelijä 96-sekä ELISA-levyt (Corning) olivat päällystetty yön yli 4 °C 50 µl 1 mg mL−1 E. coli-β-gal (Sigma-Aldrich) 0,05 M natriumkarbonaattia puskuri (pH 9,6)., Jälkeen estää 5% (w/v%) naudan seerumin albumiini (BSA) PBS: 3 h huoneenlämmössä, levyt pestiin neljä kertaa pbst: llä puskuriin (PBS, on 0,05% (v/v%) Tween-20, 0.3% (w/v%) BSA) ja inkuboitiin kanssa sarjaan laimennettu, puhdistettu scFv13-R4 näytteitä tai liukenevat jakeet CFGpS lysaatit 1 h huoneenlämmössä. Näytteet kvantifioitiin Bradford-menetelmällä ja lautaselle levitettiin vastaava määrä kokonaisproteiinia. Pesun jälkeen neljä kertaa sama puskuri, anti-6×-Hänen-HRP-konjugoitu kanin polyklonaalista vasta-ainetta (Abcam) 3% pbst: llä on lisätty kunkin no 1 s., Levyt pestiin ja kehitettiin standardiprotokollia käyttäen.

In vitro solujen lisääntymisen määritys

Ihmisen èritromielozom TF-1-solut (Sigma), jotka vaativat granulosyytti–makrofagi pesäkkeitä stimuloivaa tekijää (GM-CSF), interleukiini 3 (IL-3), tai hEPO kasvua ja selviytymistä oli käytetty. Solut olivat voimassa RPMI-1640 media täydennetty 10% FBS, 50 U mL−1 penisilliini, 50 mg mL−1 streptomysiini, 2 mM glutamiinia, ja 2 ng mL−1 GM-CSF 37 °C kostutetussa ilmapiiri, jossa 5% CO2., Jälkeen 16 h inkuboinnin vuonna RPMI-1640 media ilman GM-CSF, solut laskettiin, korjattu ja uudelleen suspendoidun tuoretta media. 5 × 103 TF-1-solua kaivoa kohti kylvettiin 96-poraustestilevyssä, ja EPO-standardit tai-näytteet lisättiin lopullisiin haluttuihin pitoisuuksiin kuhunkin kaivoon. Soluja inkuboitiin 6 tunnin ajan kosteassa hautomossa ennen alamarBlue® – valmisteen lisäämistä. 12 tunnin kuluttua fluoresenssisignaali mitattiin 560 nm/590 nm magnetointi/emissiopituusaallonpituudella.,

Tietojen saatavuus

Kaikki kertyneet tiedot tutkimuksen aikana ovat mukana tässä artikkelissa ja sen lisätietojen tiedostoja, ja ne ovat saatavilla alkaen kirjoittajat kohtuullisen pyynnön.