bakteriestammer og plasmider

følgende E. coli stammer, der blev anvendt i denne undersøgelse: DH5a, BL21(DE3) (Novagen), CLM24, og Origami2(DE3) gmd::kan ΔwaaL. DH5a blev anvendt til kloning og rensning af plasmid., BL21(DE3) blev brugt til ekspression og oprensning af scFv13-R4DQNAT acceptor-protein, der blev anvendt i alle in vitro-glykosylering reaktioner. CLM24 er et glycooptimeret derivat af Und3110, der bærer en deletion i genet, der koder for Waaal-ligasen, hvilket letter akkumuleringen af forudmonterede glycaner på Und-pp36. CLM24 blev brugt til rensning af CjOST enzym, organisk opløsningsmiddel-baseret udtræk af alle LLO sbearing bakteriel glycans, og kilden stamme for fremstilling af ekstrakter med og uden selektivt beriget glykosylering komponenter., Origami2(DE3) gmd::kan ΔwaaL blev brugt til at producere Man3GlcNAc2-bærende LLOs og var genereret af sekventielle mutation med P1vir fag transduktion ved hjælp af de respektive stammer fra Keio collection62 som donorer, som blev indhentet fra den Coli Genetiske Lager Center (CGSC). Kort sagt blev donorlysat genereret fra stamme J .3597-1 (krfal734::kan), og den resulterende fag blev brugt til at inficere Origami2(DE3) målceller., Efter plettering af transformanter på LB-plader indeholdende kanamycin (Kan) blev vellykkede transduktanter valgt, og deres Kan-resistenskassetter blev fjernet ved omdannelse med temperaturfølsomt plasmid pcp2063. Den resulterende stamme, Origami2 (DE3) δ .aal, blev derefter brugt til efterfølgende deletion af gmd-genet ifølge en identisk strategi, men ved anvendelse af donorstamme J .2038-1 (kgmd751::kan).

alle plasmider, der anvendes i undersøgelsen, er anført i supplerende tabel 2. Plasmider konstrueret i denne undersøgelse blev lavet ved hjælp af standardkloningsprotokoller og bekræftet ved DNA-sekventering., Disse omfattede følgende. Plasmid pJL1-scFv13-R4DQNAT blev genereret af første PCR at forstærke den genetiske kodning scFv13-R4DQNAT fra pET28a-scFv13-R4(N34L, N77L)DQNAT, hvor N34L og N77L mutationer blev indført for at fjerne formodede indre glykosylering steder i scFv13-R452. Det resulterende PCR-produkt blev derefter ligeret mellem ncoi-og Sali-restriktionssteder i plasmid pJL1, en pET-baseret vektor anvendt til CFPS49. Plasmid pJL1-sfGFP217-d .nat blev genereret ved at ligere et kommercielt syntetiseret DNA-fragment, der koder sfGFP217-d .nat (Integrated DNA Technologies) i pJL1., Denne version af sfGFP indeholder en yderligere GT indsættelse efter K214, som udvider denne fleksible loop, før den endelige beta sheet64. Ind i denne fleksible løkke, umiddelbart efter T216, podede vi en 21-aminosyresekvens indeholdende C. jejuni AcrA N123 glycosylering site34, men med en optimal D .nat seonuon i stedet for den native AcrA se .uon. Lignende procedurer, der blev anvendt til at generere plasmider pJL1-sfGFP217-AQNAT, pJL1-hEPO22-DQNAT-26, pJL1-hEPO36-DQNAT-40, og pJL1-hEPO81-DQNAT-85., I tilfælde af pJL1-hEPO22-DQNAT-26, genet for gamle menneskers EPO blev designet sådan, at de indfødte sequon på N24 blev ændret fra 22-AENIT-26 til en optimal bakteriel sequon, DQNAT. Identiske kloningsstrategier blev udført for separat at introducere optimale d .nat-motiver i stedet for de native hEPO-se .uons 36-NENIT-40 og 81-lvnss-85. Rekombinant ekspression i E. coli O9 primer-adapter glycan (Man3GlcNAc) på Und-PP blev opnået ved kloning af gener, der koder for de WbdB og WbdC mannosyltransferase enzymer, der stammer fra E., coli ATCC31616 for at samle glycan, og RfbK og RfbM, også stammer fra E. coli ATCC31616 for at øge puljen af tilgængelige BNP-mannose, i E. coli MG1655. Plasmid pConYCGmCB blev bygget af isoterm Gibson forsamling og koder en kunstig operonen, bestående af: (i) gær glycosyltransferases Alg13, Alg14, Alg1, og Alg2 for Man3GlcNAc2 glycan biosynthesis12 og (ii) E. coli enzymer phosphomannomutase (ManB) og mannose-1-fosfat guanylyltransferase (ManC), som sammen øger tilgængeligheden af BNP-mannose substrater for Alg1 og Alg2 enzymer.,

proteinekspression og oprensning

oprensning af CjPglB blev udført ifølge en tidligere beskrevet protokol 34. Kort fortalt, en enkelt koloni af E. coli CLM24 regnskabsmæssige plasmid pSN1865 var vokset natten over ved 37 °C i 50 mL af Luria-Bertani (LB; 10 g L−1 trypton, 5 g L−1, gær ekstrakt, 5 g L−1 NaCl, pH 7,2) suppleret med ampicillin (Amp) og 0,2% (w/v%) d-glucose. Natten celler var subcultured i 1 L frisk fantastisk bouillon (TB; 12 g L−1 trypton, 24 g L−1, gær ekstrakt, 0,4% (v/v%) glycerol, 10% (v/v%) 0.17 M KH2PO4/0.,72 M K2HPO4 phosphatbuffer), suppleret med Amp og dyrket, indtil absorbansen ved 600 nm (Abs600) nåede en værdi på ~0,7. Inkubationstemperaturen blev indstillet til 16 C C, hvorefter proteinekspression blev induceret ved tilsætning af l-arabinose til en slutkoncentration på 0,02% (w/v%). Proteinekspression fik lov til at fortsætte i 20 timer ved 16 C. C. celler blev høstet ved centrifugering og derefter afbrudt under anvendelse af en homogenisator (Avestin C5 Emulgfle.). Lysatet blev centrifugeret for at fjerne celleaffald, og supernatanten blev ultracentrifugeret (100.000 g g) i 2 timer ved 4 C. C., Den resulterende pellet, der indeholder membranen fraktion blev helt resuspenderet med en Potter-Elvehjem væv homogenizer i buffer indeholdende 50 mM HEPES, 250 mM NaCl, 10% (v/v%) glycerol, og 1% (w/v%) n-dodecyl-β-d-maltoside (DDM) ved pH 7.5. Suspensionen blev inkuberet ved stuetemperatur i 1 time for at lette rengøringsmiddel solubilization af CjPglB fra native E. coli lipider, som blev fjernet ved den efterfølgende ultracentrifugation (100,000×g) for 1 h ved 4 °C., Supernatanten indeholder DDM-oplost CjPglB blev renset ved hjælp af Ni-NTA harpiks (Thermo) i henhold til fabrikantens specifikationer med den undtagelse, at alle buffere blev suppleret med 1% (w/v%) DDM. Elueringsfraktionen fra ni-NTA-oprensning blev derefter underkastet størrelseskromatografi (SEC) ved hjælp af et FKTA e .plorer fplc-system (GE Healthcare) med superde.200 10/300 GL-kolonne. Oprenset protein var gemt i en endelig koncentration på 1-2 mg mL−1 i OST opbevaring buffer (50 mM HEPES, 100 mM NaCl, 5% (v/v%) glycerol, 0.01% (w/v%) DDM, pH 7,5) ved 4 °C., Glycerol-koncentrationen i den prøve, der var justeret til 20% (v/v%) for lang tids opbevaring ved -80 °C.

Rensning af acceptor-protein scFv13-R4DQNAT blev gennemført som beskrevet previously52. Kort, E. coli stamme, BL21(DE3) regnskabsmæssig plasmid pET28a-scFv13-R4(N34L, N77L)DQNAT blev dyrket i 1 L TB leveres med kanamycin. Kulturen blev inkuberet ved 37 °C, indtil Abs600 nået ~0.7, på hvilket tidspunkt protein udtryk blev induceret ved tilsætning af isopropyl-β-d-1-thiogalactopyranoside (IPTG) til en endelig koncentration på 0,1 mM. Protein udtryk fik lov til at fortsætte i 20 timer ved 25 °C., Celler blev høstet og forstyrret identisk som beskrevet ovenfor. ScFv13-R4D .nat-proteinet blev oprenset under anvendelse af Ni-NTA-harpiks efterfulgt af SEC i henhold til producentens protokoller. Protein blev gemt i en endelig koncentration på 1-2 mg mL−1 på lager buffer (50 mM HEPES, 250 mM NaCl, 1 mM EDTA, pH 7,5) ved 4 °C.

Udvinding af LLOs

Den protokol til organiske opløsningsmidler på LLOs fra E. coli, membraner blev tilpasset fra en tidligere beskrevne protocol34,66., I de fleste tilfælde blev en enkelt koloni af stamme CLM24, der bærer et plasmid til målglycanbiosyntese (supplerende tabel 2) dyrket natten over i LB-medier. Det bemærkelsesværdige undtagelser var LLOs bærer W. succinogenes N-glycan (WsLLOs), som blev produceret ved hjælp af DH5a celler, der transporterer pEpiFOS-5pgl5 fosmid (venligst stillet til rådighed af Dr. Markus Aebi), og LLO sbearing Man3GlcNAc2, som blev produceret ved hjælp af Origami2(DE3) gmd::kan ΔwaaL celler, der transporterer plasmid pConYCGmCB. Celler natten over blev subkultureret til 1 L TB suppleret med et passende antibiotikum og dyrket, indtil Abs600 nåede ~0.7., Den inkubationstemperatur blev justeret til 30 °C i biosyntesen af alle glycans bortset fra Man3GlcNAc2, der var justeret til 16 °C. For plasmid pMW07-pglΔB, protein udtryk blev induceret med l-arabinose i en endelig koncentration på 0,2% (w/v%), mens for fosmid pEpiFOS-5pgl5 induktion var med isopropyl-β-d-1-thiogalactopyranoside (IPTG) i en endelig koncentration på 1 mM. Alle andre plasmider, der er involveret konstituerende initiativtagere og dermed ikke kræver kemiske inducere. Efter 16 timer blev celler høstet ved centrifugering, og cellepellets blev lyofiliseret for at fuldføre tørhed ved -70 C. C., For udvinding af CjLLOs, indfødte og manipuleret ClLLOs, E. coli O9 primer-adapter LLOs, og WsLLOs, den lyophilisates blev suspenderet i 10:20:3 volumen-forholdet af CHCl3: (CH3OH): H2O løsning og inkuberes ved stuetemperatur i 15 min for at lette udvinding af LLOs. For udvinding af LLO sbearing Man3GlcNAc2 glycan, lyophilisate blev successivt suspenderet i 10:20 (v/v%) CHCl3:CH3OH løsning, vand, og 10:20:3 CHCl3: (CH3OH): H2O løsning med 15 min inkubation ved stuetemperatur mellem hvert trin., I hvert tilfælde blev den endelige suspension centrifugeret (4000 g g) i 15 minutter, hvorefter det organiske lag (bundlag) blev opsamlet og tørret med en vakuumkoncentrator efterfulgt af lyofilisering. Lyophilisates indeholder aktive LLOs blev resuspenderet i celle-gratis glykosylering buffer (10 mM HEPES, pH 7,5, 10 mM MnCl2, og 0,1% (w/v%) DDM) og opbevaret ved 4 °C.

Forberedelse af rå S30 ekstrakter

CLM24 kilde stammer blev dyrket i 2×YTPG (10 g L−1, gær ekstrakt, 16 g L−1 trypton, 5 g L−1 NaCl, 7 g L−1 K2HPO4, 3 g L−1 KH2PO4, 18 g L−1 med glukose, pH 7,2), indtil den Abs600 nået ~3., Til at generere OST beriget med ekstrakt, CLM24 regnskabsmæssige plasmid pSF-CjPglB, pSF-CcPglB, pSF-DdPglB, pSF-DgPglB, eller pSF-DvPglB52 blev brugt som kilde stamme. Til generering af LLO-beriget ekstrakt blev CLM24 med plasmid pm .07-pglbb anvendt som kildestammen. At generere en-pot ekstrakt indeholdende både OST og LLOs, CLM24 transporterer pm .07-PGL .b og pSF-CjOST blev brugt som kilde stamme. Efter behov blev ekspressionen af glycosyleringskomponenter induceret med l-arabinose ved endelig koncentration på 0, 02% (w/v%)., Efter induktion, protein udtryk fik lov til at fortsætte ved 30 °C, til en tæthed af OD600 ~3, på hvilket tidspunkt celler blev høstet ved centrifugering (5000×g) ved 4 °C i 15 min. Alle efterfølgende trin blev udført ved 4 C C, medmindre andet er angivet. Pelleteret celler blev vasket tre gange i S30 buffer (10 mM tris-acetat, 14 mM magnesium-acetat, 60 mM kaliumacetat, pH 8.2). Efter den sidste vask blev cellerne pelleteret ved 7000 g g i 10 minutter og flashfrosset på flydende nitrogen. Til fremstilling af lysat blev cellerne optøet og resuspenderet til homogenitet i 1 mL S30-buffer pr. 1 g vådcellemasse., Celler blev forstyrret under anvendelse af en Avestin Emulgfle.-B15 højtrykshomogenisator ved 20,000–25,000 psi med en enkelt passage. Lysatet blev derefter centrifugeret to gange ved 30.000 g g i 30 minutter for at fjerne celleaffald. Supernatant blev overført til et nyt fartøj og inkuberet med 250 o / min omrystning ved 37.C i 60 minutter for at nedbryde endogene mRNA-transkripter og forstyrre eksisterende polysomkomplekser i lysatet. Efter centrifugering (15.000 g g) i 15 minutter ved 4 C C blev supernatanten opsamlet, aliiquuoted, flashfrosset i flydende nitrogen og opbevaret ved -80 C. C., S30 ekstrakt var aktiv i omkring tre fryse-tø cykler og indeholdt ~40 g l−1 total protein målt ved Bradford assay.

Cell-gratis glycoprotein syntese

Til in vitro-glykosylering af renset acceptor-protein, reaktioner, som blev gennemført på en 50 µL volumen, som indeholder 3 μg af scFv13-R4DQNAT, 2 µg renset CjPglB, og 5 µg udvundet LLOs (i tilfælde af Man3GlcNAc2 LLOs, 20 µg blev brugt) i in vitro-glykosylering buffer (10 mM HEPES, pH 7,5, 10 mM MnCl2, og 0,1% (w/v%) DDM). Reaktionsblandingen inkuberes ved 30 C C i 16 timer., For rå ekstraktbaseret ekspression af glycoproteiner blev der implementeret en tofaseskema. I den første fase blev proteinsyntese udført med et modificeret Pano.-SP-system67. Specifikt, 1,5 mL mikrocentrifuge rør blev sigtet for 15-µL reaktioner, der indeholder 200 ng plasmid DNA, 30% (v/v%) S30-ekstrakt, og det følgende: 12 mM magnesium glutamat, 10 mM ammonium glutamat, 130 mM kalium glutamat, 1.2 mM adenosin trifosfat (ATP), 0.85 mM guanosin trifosfat (GTP), 0.85 mM uridine trifosfat (UTP), 0.85 mM cytidin trifosfat (CTP), 0.034 mg mL−1 folinic syre, 0.,171 mg mL−1 E. coli-tRNA (Roche), 2 mM i hver af de 20 aminosyrer, 30 mM phosphoenolpyruvate (PEP, Roche), 0,4 mM nicotinamid adenin dinucleotide (NAD), 0.27 mM coenzym-A (CoA), 4 mM oxalsyre, 1 mM, putrescine, 1,5 mM spermidine, og 57 mM HEPES. For scFv13-R4DQNAT, hEPO22-DQNAT-26, hEPO36-DQNAT-40, og hEPO81-DQNAT85, denne fase blev gennemført ved 30 °C i 4 timer under oxiderende betingelser, mens det for sfGFP217-DQNAT og sfGFP217-AQNAT denne fase blev gennemført ved 30 °C i 5 min under reducerende forhold., For oxiderende betingelser, ekstrakt var pre-condition med 750 µM iodoacetamide i mørke ved stuetemperatur i 30 minutter og reaktionsblandingen blev leveret med 200 mM glutathion på et 3:1 forhold mellem oxiderede og reducerede former. Den aktive sfGFP udbytter fra celle-gratis reaktioner blev kvantificeret ved måling af fluorescens-in-prøve og konvertering til koncentration ved hjælp af en standardkurve som tidligere described39. I den anden fase blev proteinglycosylering initieret ved tilsætning af mncl2 og DDM i en slutkoncentration på 10 mM og 0.,1% (w/v%), henholdsvis, og lov til at fortsætte ved 30 °C i 16 timer. Efter behov, reaktioner, som blev suppleret med 2 µg renset CjPglB (dvs, for CFGpS med LLO-beriget med ekstrakter) eller 5 µg ekstraheret CjLLOs (dvs, for CFGpS med OST beriget med ekstrakter). Alle reaktioner blev stoppet ved tilsætning af laemmli prøvebuffer indeholdende 5% ßME, hvorefter prøverne blev kogt ved 100 C C i 15 minutter og analyseret ved SDS-Page og westernestern blotting.

Westernestern blot-analyse

prøver indeholdende 0, 5 µg acceptorprotein blev indlæst i SDS-side geler., Efter elektroforese adskillelse, proteiner, der blev overført fra geler på Immobilon-P polyvinylidene difluoride (PVDF) membraner (0,45 µm) i henhold til producentens protokol. Membraner blev vasket to gange med TBS buffer (80 g L−1 NaCl, 20 g L−1 KCl, og 30 g L−1, Tris-base) efterfulgt af inkubation i 1 time i blokering løsning (50 g L−1 fedtfri mælk i TBST (TBS leveres med 0,05% (v/v%) Tween-20)). Efter blokering blev membraner vasket 4 gange med TBST med 10 min inkubation mellem hver vask., En første membranen blev undersøgt med 6xHis-polyklonale antistof (Abcam, ab137839, 1:7500), der specifikt genkender hexahistidine epitopen tags, mens en anden kopiere membran, der blev analyseret med en af følgende: hR6 (1:10,000) serum fra kanin, der anerkender den indfødte C. jejuni og C. lari glycan samt manipuleret C. lari glycan eller ConA-HRP (Sigma L6397, 1:2500), der anerkender Man3GlcNac og Man3GlcNAc2. Sondering af membraner blev udført i mindst 1 time med omrystning ved stuetemperatur, hvorefter membraner blev vasket med TBST på samme måde som beskrevet ovenfor., Til udvikling blev membraner inkuberet kort ved stuetemperatur med det vestlige ECL-substrat (BioRad) og afbildet under anvendelse af et ChemiDocTM .rs+ – System. OST-en .ymer beriget i ekstrakter blev påvist ved en identisk SDS-side-procedure efterfulgt af analysisestern blot-analyse med et polyklonalt antistof, der er specifikt for FLAGEPITOPMÆRKET (Abcam, ab49763, 1:7500). Glycankomponenten af LLOs beriget i ekstrakter blev påvist ved direkte at spotte 10 µL ekstrakter på nitrocellulosemembraner efterfulgt af detektion med HR6 serum. Uncropped immunoblot billeder er vist i supplerende Fig. 8.,

MS-analyse

Omkring 2 µg for scFv13-R4DQNAT protein i opløsning blev denatureret med 6 M urinstof, reduceret med 10 mM DTT, inkuberes ved 34 °C i 1 time, derefter alkylerede med 58 mM iodoacetamide for 45 min i mørke ved stuetemperatur og slukkes af endelige 36 mM DTT. Opløsningen blev derefter fortyndet med 50 mM ammoniumbicarbonat (pH 8,0) til en endelig bufferkoncentration på 1 M urinstof før trypsinfordøjelsen. Prøven blev fordøjet med 0,2 µg trypsin i 18 timer ved 37 C. C. fordøjelsen blev stoppet ved tilsætning af TFA til en endelig pH 2,2–2,5., Prøverne blev derefter afsaltet med SOLA HRP SPE-Patron (ThermoFisher Scientific). Patronerne var betinget med 1 × 0,5 mL 90% methanol, 0.1% trifluoroacetic syre (TFA) og bringes i ligevægt med 2 × 0.5 mL 0,1% (v/v%) TFA. Prøverne blev fortyndet 1: 1 med 0,2% (v/v%) TFA og løber langsomt gennem patronerne. Efter vask med 2 x 0,5 mL ligevægt løsning, peptider, blev elueret med 1 × 0,5 mL 50% (v/v%) acetonitril (ACN), 0.1% (v/v%) TFA og tørret i en fart vakuum centrifuge.,

nanoLC–MS/MS-analyse blev udført med UltiMate3000 RSLCnano (Dionex) er koblet til et Orbitrap Fusion (ThermoFisher Scientific) mass spectrometer udstyret med en nanospray Flex-Ion Kilde. Hver prøve blev rekonstrueret i 22 µL af 0.5% (w/v%) FA og 10 µL blev læsset på en Anerkendelse PepMap 100 C18 fælde kolonne (5 µm og 100 µm × 20 mm, 100 Å, ThermoFisher Scientific) med nanoViper Beslag på 20 µL min−1 0,5% FA for on-line desalting., Efter 2 min, ventilen skiftes til at tillade peptider at være adskilt på en Anerkendelse PepMap C18 nano kolonne (3 µm, 75 µm × 25 cm, ThermoFisher Scientific), i en 90 min gradient af 5 til 23% til 35% B ved 300 nL min−1 (3 73 93 min, henholdsvis), efterfulgt af en 9-min rampe til 90% B, en 9-min hold på 90% B og hurtig skifte til 5% B i 1 min. Søjlen blev re-ækvilibreret med 5% B i 20 min før næste kørsel. Orbitrap Fusion fungerede i positiv ion-tilstand med nanospray-spænding indstillet til 1.7 kV og kildetemperatur ved 275 C. C., Ekstern kalibrering for FT -, IT-og quaduadrupol-masseanalysatorer blev udført før analysen. Den Orbitrap fuld MS survey scan (m/z 400-1800) blev efterfulgt af Top 3 s data-afhængig Højere Kollision dissociation produkt ion udløst ETD (HCD-pd-ETD) MS/MS scanninger forløber for peptider med 2-7 afgifter over en tærskel ion tæller 50.000 med normaliseret kollision energi på 32%., MS survey scanninger blev erhvervet på en opløsningsevne på 120.000 (FWHM på m/z-200), med Automatisk Gin Control (AGC) = 2e5 og maksimal indsprøjtning tid (DET Antal) = 50 ms, og HCD MS/MS-scanner med en opløsning på 30.000 med AGC = 5e4, Max antal IT = 60 ms og med Q isolation vindue (m/z) på 3 for det brede sortiment m/z 105-2000. Dynamiske ekskluderingsparametre blev sat til 1 inden for 60 s ekskluderingsvarighed med 10 10 ppm eksklusionsmassebredde. Produkt Ion udløse liste bestod af toppe på 204.0867 Da (HexNAc oxonium-ion), 138.0545 Da (HexNAc fragment), og 366.1396 Da (HexHexNAc oxonium-ioner)., Hvis en af HCD-produktionerne i listen blev detekteret, blev to ladningsafhængige ETD MS/MS-scanninger (EThcD) med HCD supplerende aktivering (SA) på den samme precursorion udløst og opsamlet i en lineær ionfælde. For dobbeltladede forstadier blev ETD-reaktionstiden som indstillet 150 ms og SA-energien sat til 30%, mens de samme parametre til henholdsvis 125 ms og 20% blev anvendt til højere ladede forstadier. For begge ion-udløste scanninger blev fluoranthen-ETD-reagensmål sat til 2e5, AGC-mål ved 1e4, ma.det ved 105 ms og isoleringsvindue ved 3. Alle data blev erhvervet ved hjælp af 3calibur 3.,0 drift software og Orbitrap Fusion Tune Ansøgning v. 2.1 (ThermoFisher Scientific).

Alle MS og MS/MS rå spektre fra hver prøve blev søgt hjælp Byonics v. 2.8.2 (Protein Målinger) ved hjælp af E-coli protein database med tilføjet scFv13-R4DQNAT protein target sekvens. Den peptid søg parametre var som følger: to ubesvarede spaltning til fuld trypsin fordøjelse med fast carbamidomethyl ændring af cystein, variabel ændringer af methionin, oxidation, og deamidation på asparagin/glutamin rester., Peptidmassetolerancen var 10 ppm og fragment massetoleranceværdier for HCD og EThcD spektre var henholdsvis 0,05 og 0,6 Da. Både det maksimale antal almindelige og sjældne modifikationer blev sat til to. Glycan-søgningen blev udført mod en liste over 309 pattedyrs n-bundne glycaner i Byonisk soft .are. Identificerede peptider blev filtreret for maksimalt 2% FDR. Soft .aren eksporterede resultaterne af søgningen til et regneark.

GFP-fluorescensaktivitet

aktiviteten af cellefri afledt sfGFP blev bestemt ved anvendelse af en in-lysat-fluorescensanalyse som tidligere beskrevet 39., Kort fortalt blev 2 µL cellefri syntetiseret glycosyleret sfGFP-reaktion fortyndet til 48 µL nanopurvand. Opløsningen blev derefter anbragt i en costar 96-brønds sort assayplade (Corning). E .citations-og emissionsbølgelængder for sfGFP-fluorescens var henholdsvis 485 og 528 nm.

Enzyme-linked immunosorbent analyse (ELISA)

Costar 96-brønds ELISA-plader (Corning) var belagt natten over ved 4 °C med 50 µl 1 mg mL−1 E. coli β-gal (Sigma-Aldrich) i 0,05 M natriumcarbonat buffer (pH 9.6)., Efter blokering med 5% (w/v%) bovint serum albumin (BSA) i PBS til 3 timer ved stuetemperatur, pladerne blev vasket fire gange med PBST buffer (PBS, 0.05% (v/v%) Tween-20, 0.3% (w/v%) BSA) og inkuberes med serielt fortyndet renset scFv13-R4 prøver eller opløselige fraktioner af CFGpS lysates i 1 time ved stuetemperatur. Prøver blev kvantificeret ved Bradford-assayet, og en ækvivalent mængde af totalt protein blev påført pladen. Efter vask fire gange med den samme buffer blev anti-6 His-His-HRP konjugeret kaninpolyklonalt antistof (Abcam) i 3% PBST tilsat til hver brønd i 1 time., Plader blev vasket og udviklet ved hjælp af standardprotokoller.

In vitro-celle spredning analysen

den Menneskelige erythroleukemia TF-1 celler (Sigma), som kræver, granulocyt–macrophage koloni-stimulerende faktor (GM-CSF), interleukin 3 (IL-3), eller hEPO for vækst og overlevelse blev brugt. Cellerne blev fastholdt i RPMI-1640 medier suppleret med 10% FBS, 50 U mL−1 penicillin, 50 mg mL−1 streptomycin, 2 mM glutamin, og 2 ng mL−1 GM-CSF ved 37 °C i en fugtig atmosfære indeholdende 5% CO2., Efter 16 h inkubation i rpmi-1640 medier uden GM-CSF blev celler talt, høstet og resuspenderet i friske medier. 5 103 103 TF-1 celler pr. brønd blev podet i en 96-brønds analyseplade, og EPO-standarder eller prøver blev sat til endelige ønskede koncentrationer til hver brønd. Cellerne blev inkuberet med i 6 timer i fugtig inkubator, før alamarBlue®blev tilsat. Efter 12 timer blev fluorescenssignalet målt ved 560 nm/590 nm e .citations – / emissionsbølgelængde.,

datatilgængelighed

alle data, der genereres under undersøgelsen, er inkluderet i denne artikel og dens supplerende informationsfiler og er tilgængelige fra forfatterne efter rimelig anmodning.