Laboratorium steder
Alle DNA-arbejde, der involverer den moderne familie blev udført på University of Leicester. Mandlige slægtninge blev skrevet ved hjælp af Promega Po .erple.Y23 og til SNP ‘ er, der definerede de vigtigste europæiske Y-haplogrupper i Leicester med en delmængde af skrivningen, der blev bekræftet på Universit. Paul Sabatier. Kvindelige slægtninge blev sekventeret for hele mitokondriegenomet ved University of Leicester., DNA blev ekstraheret fra gamle tænder og knogler på University of York og Universit.Paul Sabatier, Toulouse. Bibliotek forberedelse og mål berigelse blev gjort på University of York. Single-end 100-bp sekventering ved hjælp af en Hise.2000 (Illumina, CA, USA) blev udført på Copenhagen se .uencing Facility. Målrettet sekventering af både moderne og gammelt DNA blev også udført på genomic technical platform PlaGe (Genopole, Toulouse, Frankrig) og på protein Nucleic Acid Chemistry Laboratory ved University of Leicester. Nedenfor giver vi en kondenseret version af de anvendte metoder., For hvert trin findes fuld information i de supplerende metoder. Detaljer omkring den omfattende genealogiske forskning, der er udført til dette projekt, findes i supplerende Note 2.
Sample collection
DNA blev ekstraheret fra spytprøver af de moderne slægtninge til Richard III, og alle deltagere blev rekrutteret med informeret samtykke efter projektanmeldelse af University of Leicester Research Ethics Committee.
skelet 1 blev udgravet og prøver taget under rene forhold37., Alle involverede i udgravningen på Grey Friars-stedet, clean laboratory i Leicester og dem, der var involveret i laboratorierne og labworkork, havde deres mitokondrielle og, for mænd, Y-kromosomer skrevet. DNA blev ekstraheret fra spytprøver, og alle deltagere blev rekrutteret med informeret samtykke.
DNA-ekstraktion af gamle prøver
DNA blev ekstraheret fra tænder og knogle (lårben) prøver. Alle procedurer blev udført i dedikerede gamle DNA-laboratorier ved University of York og Universit.Paul Sabatier, Toulouse med passende forureningsforholdsregler på plads., To ekstraktionsemner blev inkluderet og behandlet nøjagtigt som om de var ekstrakter gennem hele processen. PCRs og bibliotek eksperimenter også medtaget yderligere blank kontrol.
se .typing assay udført på skelet 1
der blev anvendt et nydesignet se .typing assay bestående af PCR-primere til co-amplifikation af SRY-fragmentet med ut.og UTY homologe regioner. Dette assay blev designet til at gøre det muligt for relativt små fragmenter af SRY, ut.og UTY at blive forstærket fra prøver, der sandsynligvis indeholder nedbrudt dna10.,
Mitokondrie-kontrol regionen analyse af Skelet 1
Analyse af de hypervariable segmenter (HV1, HV2 og HV3) af mtDNA kontrol regionen blev gennemført, ved at forstærke og direkte sekventering flere overlappende fragmenter, der spænder fra 153 til 250 bp i størrelse (http://forensic.yonsei.ac.kr/protocol/mtDNA-midi-mini.pdf)22. Et udvalg af ampliconer blev brugt til kloning af PCR-produkterne i laboratoriet i Toulouse. Sekventering blev udført ved hjælp af Big-Dye Terminator v3.,1 cyklus sekventering kit (Applied Biosystems) og ved kapillar elektroforese på en ABI Prism 3730 Genetiske Analysator (Applied Biosystems) på Protein-nukleinsyre Kemi Laboratorium på University of Leicester eller ved genomisk tekniske platform PlaGe (Genopole).
Mitokondrielle genom/Y-SNP/HIrisplex skrive Skelet 1
Biblioteker blev bygget efter Meyer og Kircher16, med den undtagelse, at den første filtrering trin mellem den stumpe ende reparation og adapter ligation blev erstattet af varme inaktivering af enzymes38,39., To mikroarrays blev designet, en til mtDNA-berigelsen og en anden til nuklear SNP-berigelse. DNA-berigelse blev udført af hybridisering fange hjælp Agilent 244k DNA SureSelect microarray (Agilent, Böblingen, Tyskland). Til kernefangst blev Y-kromosomprober designet til at dække SNP ‘ erne, der var relevante for de store europæiske slægtninge14. Yderligere prober blev designet til at dække SNP ‘ erne, der var relevante for hirisple .31-markørerne. Disse to sæt Sonder (mitokondrie og SNPs) blev brugt separat til at udfylde de to forskellige microarray design af en 1 24 244K format., For hver mikroarray blev fangstprotokollen udført efter Hodges et al.15 med de ændringer, der er foreslået af .hang et al.40 og Fortes og Paijmans38. Bibliotekerne blev samlet i ækvimolære mængder og sekventeret på to baner på Illumina Hise.2000-platformen i 100 SE-tilstand på sekventeringsfaciliteten på Københavns Universitet, Danmark.
de rå læsninger fra hvert bibliotek blev sorteret baseret på det seks-nukleotidindeks, der blev brugt under biblioteksforberedelsen. Kun læser med en 100% match til indekset blev udvalgt til yderligere analyser., Aflæsninger kortere end 25 nukleotider blev kasseret fra yderligere analyse. De trimmede læsninger blev kortlagt til autosomer og kønskromosomer fra det humane referencegenom build 37 (GRCh37) og til rCRS (NC_012920.1) ved hjælp af B .a 0.7.5 a-r405 (ref. 41). I hver justering blev output bam-filer fusioneret ved hjælp af SAMtools 0.1.19 (ref. 41) og PCR-duplikater blev fjernet efterfølgende. De kortlagte læsninger blev filtreret baseret på en kortlægningskvalitet >29 og deres tilpasning til unikke positioner langs referencesekvensen.,
polymorfe positioner blev identificeret ved anvendelse af SAMtools (SAMtools 0.1.19) og bcftools. Endelig, vcfutils.pl var der bruges til at filtrere listen over varianter i henhold til en Phred-skaleret genotype posterior sandsynligheden kvalitet >20 og læs dybde højere end 10. For at undgå fejlopkald på grund af deamineringsmønsteret af gamle DNA-molekyler, alle de polymorfe positioner rapporteret i VCF-outputfilen blev kontrolleret med øjet., I tilfælde af mitokondriegenomet blev samlingen til referencen visualiseret i Tablet42, mens justeringen af læsningerne indeholdende SNP ‘ erne til referencekromosomerne blev visualiseret ved hjælp af IGV43.
SNP at skrive ved PCR
Den fange tilgang gav tilstrækkelig dækning for alle HIrisPlex og Y-kromosom SNPs og derfor primere, der er designet til at generere amplifikation, der indeholder disse Snp ‘samt to Snp’, som yderligere at definere Y-kromosom haplogroup G: M285 (G1) og P287 (G2) (ref. 14). Disse blev forstærket som en del af multiple .reaktioner efter R .mpler et al.,44 eller singleplex reaktioner (med 40 cykler og uden sekundær forstærkning) og planlægges på Ion Torrent følgende bibliotek forberedelse hjælp Ion PGM 200 Xpress Skabelon Kit og PGM 200 Sekventering Kit. For at øge dækningen blev singleple.PCR og sekventering af en markør (rs28777) udført ifølge Binladen et al.45
indtastning af den haplogruppe g-definerende SNP ‘er (M201, M285 og p287) blev gentaget i Toulouse ved hjælp af singleple.PCR’ er. Sekventering af disse PCR-produkter blev udført ved anvendelse af Big-Dye Terminator v3.,1 cyklus sekventering kit (Applied Biosystems) analyseres ved kapillar elektroforese på en ABI Prism 3730 Genetiske Analysator (Applied Biosystems) på genomisk tekniske platform PlaGe (Genopole).
Y-kromosom-haplotype analyse
Antikke og moderne prøver ” Y-kromosomale haplotypes blev opnået ved hjælp af den PowerPlex Y23 System (Promega) og analyseret ved kapillar elektroforese på en ABI Prism 3730 Genetiske Analysator (Applied Biosystems) på genomisk tekniske platform PlaGe (Genopole), og om en ABI Prism 3130xl Genetiske Analysator (Applied Biosystems) ved University of Leicester., For Skeleton 1 blev dette udført på tre separate ekstrakter (RM2, LM1 og LM3) i to forskellige gamle DNA-laboratorier (York og Toulouse). For de moderne slægtninge blev dette udført på to forskellige ekstrakter i to forskellige moderne laboratorier (Leicester og Toulouse).
Y-kromosomale SNP analyse af moderne prøver
Følgende bestemmelse af Y-haplotype for den moderne mand-line prøver, er den forudsagte haplogroup blev bestemt ved hjælp af Whit De er haplogroup predictor (http://www.hprg.com/hapest5/hapest5a/hapest5.htm?order=num)., Binære markører, der dækker disse og beslægtede slægter var skrevet i to multiplekser af SNaPshot minisequencing procedure (Applied Biosystems) og en ABI3130xl Genetiske Analysator (Applied Biosystems) efterfulgt af bekræftelse ved hjælp af Sanger-sekventering. Somerset 3 blev bestemt til at være Hg i (m170+ m223−, M253−)14 afledt, yderligere bekræftet af laboratoriet i Toulouse. Somersets 1,2,4 og 5 blev bestemt til at være afledt for R1b-U152. Somersets 1,2,4 og 5 blev testet for SNPs inddeler denne clade13 (.56, m126, .36, .192, M160 og L2) ved hjælp Sanger sekventering i begge laboratorier.,
moderne mtDNA-analyse
begge prøver blev gentaget to gange.
der blev udtaget Prøver ved hjælp af Oragene DNA-Indsamling kits (DNA Genotek) og DNA udvundet ved hjælp af to forskellige metoder: den Qiacube Blodet og Kroppen Væske-protokollen (200 µl med 200 µl eluering) og Oragene protokol. Til analyse af kontrolområdet blev prøverne sekventeret to gange i både fremadrettet og omvendt retning ved hjælp af to overlappende primersæt (15973-296 og 16524-614) ved hjælp af Big-Dye Terminator V 3.1 (Applied Biosystems). Der blev ikke fundet forskelle mellem replikater eller mellem prøver.,
prøver blev forstærket for det komplette mitokondrielle genom fra begge ekstraktioner efter Meyer et al.26 PCR-amplifikation blev sekventeret på en Ion Torrent PGM Sequencer på en Ion314 Chip. Biblioteker blev udarbejdet ved hjælp af den Ion-Xpress Plus gDNA Fragment Bibliotek Forberedelse kit, mens den skabelon, forberedelse og planlægning blev udført ved hjælp af den Ion PGM 200 Xpress Skabelon Kit og Ion PGM 200 Sekventering Kit, hhv. Raw læser blev sporet tilbage til rCRS (NC_012920.1) ved hjælp af TMAP software, der er inkluderet i Ion Tilpasning plugin 3.2.1 (Torrent Suite Software 3.2.,1) på Ion Torrent-serveren. Duplicate læser fjernelse og variant opkald blev udført ved hjælp af SAMtools 0.1.19 (ref. 41) og lokal tilpasning blev udført med Genomanalyseværktøjet Kit46. Variantsteder blev filtreret for Basekvalitet 20, Kortlægningskvalitet 50 og Dækningsdybde 30 hvorefter 33 polymorfe steder blev bevaret. Alle disse steder er blevet manuelt kontrolleret og bekræftet af Sanger sekventering i begge retninger og replikeres to gange.,
Forurening kontrol og kvantificering
Moderne DNA-kontaminering af den gamle stadig var kontrolleret af følgende metoder:
- 1
Udgravningen blev udført under rene forhold (se Supplerende Metoder)
- 2
Prøver, der blev opbevaret i ren labs og gamle DNA-arbejde udføres kun i dedikeret ancient DNA-faciliteter.
- 3
Separate gamle prøver blev behandlet i separate laboratorier for at replikere resultater.,
- 4
alle lab medlemmer og udgravning deltagere havde deres mtDNA indtastet og Y-kromosom typing blev udført på alle involverede mænd. Ingen havde en matchende mtDNA eller Y-kromosom type.
som bevis mod signifikant forurening viser DNA-analyse af skelet 1 en perfekt mtDNA-match til ML1 og en enkeltbaseforskel med ML2. Det viser også en klar y-STR haplotype, som er blevet gentaget ved hjælp af en række ekstrakter genereret og testet i to separate laboratorier., Endelig understøtter en undersøgelse (se supplerende metoder) af substitutionsmønsteret i vores læsninger også dette.
Statistisk analyse
Under en konservativ tilgang, og ved hvert skridt, har man beregnet sandsynligheden for hvert element af observerede bevis under hver af to modsatrettede hypoteser: Hypotese 1 (H1): Skelet 1 er Richard III, og Hypotese 2 (H2): Skelet 1 er ikke til Richard III.,
da det var rimeligt at antage, at alle de forskellige bevislinjer var uafhængige, blev den fælles sandsynlighed for alle beviser opnået ved multiplikation af de individuelle sandsynligheder under hver hypotese. Vægten af bevis for H1, kaldet sandsynlighedsforholdet (LR), blev derefter givet ved forholdet mellem sandsynligheden under H1 og den under H2. Vi siger, at en antagelse er ‘konservativ’, hvis den reducerer LR.
LR kan omdannes til en sandsynlighed for, at H1 er sandt, givet en forudgående Sandsynlighed., Vi tog udgangspunkt i det øjeblik, at Skeleton 1 Først blev observeret og anerkendt som et menneskeligt skelet, men inden der blev foretaget vurderinger af alder, køn, sundhedstilstand og dødsårsag. På det tidspunkt var der betydelige beviser for, at et skelet fundet i, hvad der menes at have været placeringen af Leicester Grå Friars koret kunne være, at Richard III. Alle de oplysninger, der foreligger på det tidspunkt, at Skelettet 1 blev udgravet, herunder dens præcise beliggenhed og arten af graven, blev anset for denne analyse som baggrund for oplysninger, der kan informere forud sandsynlighed., På grundlag af disse oplysninger mener vi, at en skeptisk observatør ikke med rimelighed kunne have tildelt en forudgående Sandsynlighed mindre end 1 ud af 40. Denne værdi blev foreslået i en tidligere analyse (http://rationalgareth.com/), baseret på, hvad vi vurderer at være skeptiske vurderinger. Den højeste sandsynlighed, der kunne begrundes med det forudgående bevis, kan være 1 ud af 2.
Vi har brugt relevante, tilgængelige data, hvor det er muligt. Uundgåeligt subjektive vurderinger er påkrævet, for eksempel de relevante referencepopulationer og om sandsynligheden for fejl i rapporterede fakta., Så vidt det syntes muligt og rimeligt, vi stræbte efter at være konservative i vores tilgang, for eksempel, ved hjælp af en pseudocount-metode til at bias LR mod en neutral værdi på 1, således tendens til at undgå falske store værdier fra lave observerede frekvenser. Oplysninger om de data og metoder, der er anvendt i den statistiske analyse af kulstof data, alder og køn skelet, tilstedeværelse af skoliose, tilstedeværelse af perimortem sår, Y-kromosom og mtDNA frekvens data kan findes i de Supplerende Metoder. For at opsummere resultaterne: radiocarbon-dataene gav et sandsynlighedsforhold på 1.,84 repræsenterer begrænset støtte til H1. Alder og køn data gav en sandsynlighed ration af 5,25, igen repræsenterer begrænset støtte til H1. Tilstedeværelsen af den ene skulder er højere end den anden, rapporteret i løbet af Richard ‘s levetid, kunne henføres til skoliose (Skelet 1 havde alvorlige idiopatisk adolescent-debut skoliose), eller to andre kendte forhold, Erb Parese og Sprengel’ s deformitet, som begge er meget sjældne. Under H1 giver ovennævnte satser en estimeret Sandsynlighed for 0.,90 observere skoliose givet beskrivelsen af Richard III ‘ s fysiske udseende (=skoliose rente divideret med summen af de tre priser, som vi multipliceret med 0,95 at give mulighed for, at de registrerede beskrivelsen var forkert. Dette førte til en LR på 212, hvilket giver moderat stærk støtte til H1. Tilstedeværelsen af perimortem skader gav en LR på 42, Og så moderat støtte til H1. Y-kromosomet af skelet 1 svarede ikke til det for slægtsforskede patrilineale slægtninge til Richard III., Dette kunne forklares ved en falsk faderskabshændelse i en eller flere af 19 formodede far–søn-forbindelser mellem Richard III og Henry Somerset, femte hertug af Beaufort. Y-kromosomresultaterne indikerer også en yderligere falsk faderskabshændelse mellem Henry Somerset og hans fem samtidige, formodede patrilinære efterkommere. For at være konservativ valgte vi en offentliggjort falsk faderskabsrate,der var (1) lavere end nogen anden offentliggjort sats, som vi betragtede 17, 47 og (2) baseret på genealogiske data18., Til dette tilføjer vi den falske faderskabshændelse i 19 formodede far-søn–forbindelser mellem Henry Somerset og fem moderne mandlige Somersets. Dette giver en sandsynlighed for mindst en falsk faderskabshændelse i de 19 formodede far–søn-forbindelser mellem Richard III og Henry Somerset på 0.16. I betragtning af at en falsk faderskabshændelse skal have fundet sted under H1, er befolkningsfrekvensen for Skelet 1s Y-haplotype den samme under H1 og H2 og annullerer i LR-beregningen. Således er LR 0,16, hvilket repræsenterer begrænset bevis mod H1.,
mtDNA-sekvenserne af skelet 1 og den formodede 19-meiosis matrilinære slægtning til Richard III, Michael Ibsen, matchede fuldstændigt. En 21-meiose-slægtning matchede også undtagen ved en base (8994). Sidstnævnte observation er lige så sandsynligt under H1 og H2 i betragtning af den observerede sekvens af Michael Ibsen, og annullerer derfor i LR. Således har vi kun brug for sandsynligheder for observation af sekvensen, der deles af Michael Ibsen og Skeleton 1.
for at opnå sandsynligheden under H1 kræver vi mtDNA-mutationshastigheden, og i dette tilfælde er høje estimater konservative. Parsons et al.,28 rapporter 10 kontrolregionmutationer i 327 generationer ved hjælp af genealogiske data. Fordi dette antyder en højere sats end andre offentliggjorte estimater og er baseret på genealogiske data, brugte vi det til at udlede en sandsynlighed på 0, 52 for ingen mutation i 19 meioser.
for sandsynligheden under H2 kræver vi befolkningsfraktionen af skelet 1 haplotype. Selvom vi opnåede den komplette mtDNA-genomsekvens fra Skeleton 1, vi identificerede lidt offentliggjorte helgenom-sammenligningsdata fra England., Til den statistiske analyse brugte vi således kun mtDNA-kontrolregionerne mellem positionerne 16,093 og 16,320 og mellem 00073 og 00188, som vi opnåede passende engelske sammenligningsdata fra en opdatering af R .hl et al.30, suppleret med mtDNA-sekvenser leveret af Roots for Real (Genetic Ancestor Ltd ., Clare, Suffolk, Storbritannien). Brug af kun disse korte sektioner af kontrolregionen under H2 er konservativ, da befolkningsfraktionen af de observerede kontrolregionssekvenser ikke kan være mindre end den for det fulde mtDNA-genom., Den relevante referencepopulation er over 500 år tidligere, men på grund af den store befolkningsstørrelse i den betragtede periode forventer vi, at befolkningsfrekvenserne har ændret sig lidt i de sidste fem århundreder. Vi fandt frekvensen af skelet 1 haplotype at være 0 blandt 1823 i databasen, hvortil vi tilføjer den ene forekomst observeret i Michael Ibsen. Denne tilgang er igen konservativ, da Michael blev samplet på grund af hans kendte genealogiske forhold til Richard III. dette fører til en LR på 478, der repræsenterer moderat stærk bevis for H1.,
Vi har også bemærkes, at der ikke var nogen kampe i en database af 26,127 Europæiske mitokondrie-kontrol region haplotypes (www.empop.org)29. Vi behøver ikke at stole på denne database, fordi det er i Europa-en bred, snarere end specifikke til England, og på grund af konstatering spørgsmål, men det tyder på, at Skelettet 1 haplotype kan være meget sjældnere end der kan udledes fra vores mindre engelsk database. Vi bemærker også, at Kvindelig mobilitet blandt den europæiske adel sandsynligvis har været meget højere end for den generelle befolkning på grund af ægteskabspraksis i forbindelse med dannelse af politisk alliance., Sådan praksis ville give en vis begrundelse for at bruge den Europæiske mtDNA-database, og så for at overveje den haplotype, der findes i Skeleton 1 og Michael Ibsen, at være ekstremt sjælden. I supplerende Tabel 10 viser vi nogle illustrative resultater ved hjælp af Den Europæiske database for at demonstrere konsekvenserne af at fastslå, at skelet 1-haplotypen er så sjælden som foreslået af denne database.
LRs for forskellige kombinationer af beviset og to bageste sandsynligheder er vist i supplerende Tabel 10., Hjælp af alle de beviser, der er støtte for H1 er meget stærk med en LR på 6,7 millioner, så vores skeptiker vil blive ført til den konklusion, at sandsynligheden for, at Skelettet 1 er ikke Richard III ligger mindre end 1 ud af 100.000, mens det for dem at tage en 1-i-2 startposition, at sandsynligheden er meget mindre end 1 ud af en million. Under hensyntagen til de konservative antagelser, der ligger til grund for vores beregning beskrevet ovenfor, vi betragter dette som at etablere sandheden om H1 uden rimelig tvivl.