Bakteriální kmeny a plasmidy
následující kmeny E. coli byly použity v této studii: DH5a, BL21(DE3) (Novagen), CLM24, a Origami2(DE3) gmd::kan ΔwaaL. DH5a byl použit pro klonování a čištění plasmidů., BL21(DE3) byl použit pro expresi a purifikaci scFv13-R4DQNAT akceptor protein, který byl použit ve všech in vitro glykosylační reakce. CLM24 je glyko-optimalizované derivát W3110, který nese delece v genu kódující WaaL ligázy, a tím usnadňuje hromadění předmontovanými glykany na Und-PP36. CLM24 byl použit pro čištění CjOST enzymů, organické rozpouštědlo na bázi extrakce všech LLO sbearing bakteriální glykany, a zdroj napětí pro přípravu extraktů s a bez selektivně obohacené glykosylace komponenty., Origami2(DE3) gmd::kan ΔwaaL byl použit pro výrobu Man3GlcNAc2-ložiska LLOs a byl generované sekvenční mutace s P1vir fága transdukční pomocí příslušných kmenů z Keio collection62 jako dárci, které byly získány z Coli Genetic Stock Center (CGSC). Stručně řečeno, dárce lyzátu byl generován z kmene JW3597-1 (ΔrfaL734::kan) a výsledný phage byl použit k infikovat Origami2(DE3) cílové buňky., Po vysetí transformanty na LB desky obsahující kanamycin (Kan), úspěšné transductants byly vybrány a jejich Kan odpor kazety byly odstraněny tím, že změní citlivé na teplotu plasmidu pCP2063. Výsledný kmen, Origami2(DE3) ΔwaaL, byl pak použit pro následné vypuštění gmd gen podle stejné strategie, ale pomocí dárce kmen JW2038-1 (Δgmd751::kan).
všechny plazmidy použité ve studii jsou uvedeny v doplňkové tabulce 2. Plazmidy vytvořené v této studii byly provedeny pomocí standardních klonovacích protokolů a potvrzeny sekvenováním DNA., Ty zahrnovaly následující. Plasmid pJL1-scFv13-R4DQNAT byl vytvořen první PCR amplifikaci genu kódujícího scFv13-R4DQNAT z pET28a-scFv13-R4(N34L, N77L)DQNAT, kde N34L a N77L mutace byly zavedeny k odstranění domnělého vnitřního místa glykosylace v scFv13-R452. Výsledný PCR produkt byl poté ligován mezi NcoI a SalI restrikčních míst v plasmidu pJL1, pET-based vector používá pro CFPS49. Plasmid pJL1-sfGFP217-DQNAT byla generována pomocí podvazování komerčně-syntetizovaný DNA fragment kódující sfGFP217-DQNAT (Integrated DNA Technologies) do pJL1., Tato verze sfGFP obsahuje další vložení GT po K214, který rozšiřuje tuto flexibilní smyčku před konečným beta sheet64. Do této flexibilní smyčky, ihned po T216, jsme roubované 21-sekvence aminokyselin, které obsahují C. jejuni AcrA N123 glykosylace site34, ale s optimální DQNAT sequon v místě nativní AcrA sequon. Podobné postupy byly použity k vytvoření plasmidy pJL1-sfGFP217-AQNAT, pJL1-hEPO22-DQNAT-26, pJL1-hEPO36-DQNAT-40, a pJL1-hEPO81-DQNAT-85., V případě pJL1-hEPO22-DQNAT-26, gen pro zralé lidské EPO byl navržen tak, aby nativní sequon na N24 byl změněn z 22-AENIT-26 optimální bakteriální sequon, DQNAT. Byly provedeny identické klonovací strategie pro samostatné zavedení optimálních motivů DQNAT namísto nativních sekvonů hEPO 36-NENIT – 40 a 81-LVNSS-85. Rekombinantní exprese primer-adaptéru E. coli O9 glycan (Man3GlcNAc) na Und-PP byla dosažena klonováním genů kódujících enzymy wbdb a WbdC mannosyltransferázy odvozené od E., coli ATCC31616 pro montáž glycan, a RfbK a RfbM, rovněž odvozeny z E. coli ATCC31616 pro zvýšení bazénu k dispozici GDP-manóza, v E. coli MG1655. Plasmid pConYCGmCB byla postavena izotermické Gibson montáž a kóduje umělý operon skládá z: (i) droždí glycosyltransferases Alg13, Alg14, Alg1, Alg2 pro Man3GlcNAc2 glycan biosynthesis12 a (ii) E. coli enzymy phosphomannomutase (ManB) a manóza-1-fosfát guanylyltransferase (Když), které společně zvyšují dostupnost GDP-manóza substráty pro Alg1 a Alg2 enzymy.,
proteinová exprese a purifikace
čištění CjPglB bylo provedeno podle dříve popsaného protocol34. Stručně řečeno, jediná kolonie E. coli CLM24 nesoucí plasmid pSN1865 byla pěstována přes noc při 37 °C v 50 mL Luria-Bertani (LB; 10 g L−1 kultivací na trypton, 5 g L−1 kvasničného extraktu, 5 g L−1 NaCl, pH 7,2) s přídavkem ampicilinu (Amp) a 0,2% (w/v%) d-glukózy. Jednodenní buňky byly subkulturovány do 1 L čerstvého bujónu (TB; 12 g l-1 tryptonu, 24 g l−1 kvasnicového extraktu, 0,4% (v/v%) glycerolu, 10% (v/v%) 0,17 m KH2PO4/0.,72 m k2hpo4 fosfátový pufr), doplněný Amp a pěstovaný až do absorbance při 600 nm (Abs600) dosáhl hodnoty ~0,7. Inkubační teplota byla nastavena na 16 °C, po které exprese proteinů byla indukována přídavkem l-arabinóza na konečnou koncentraci 0,02% (w/v%). Exprese proteinů bylo dovoleno pokračovat po dobu 20 h při 16 °C. Buňky byly sklizeny centrifugací a pak narušena pomocí homogenizátoru (Avestin C5 EmulsiFlex). K lyzátu byla centrifugována pro odstranění zbytků buněk a supernatantu byl ultracentrifuged (100,000×g) po dobu 2 h při 4 °C., Výsledný pelet obsahující membránové frakce byl plně resuspendovány pomocí Potter-Elvehjem tkáňového homogenizátoru v pufru obsahujícím 50 mM HEPES, 250 mM NaCl, 10% (v/v%) glycerol, 1% (w/v%) n-dodecyl-β-d-maltoside (DDM) při pH 7.5. Suspenze byla inkubována při pokojové teplotě po dobu 1 h pro usnadnění prací prostředek solubilizace CjPglB z nativního E. coli lipidy, které byly odstraněny následnou ultracentrifugation (100,000×g) po dobu 1 h při teplotě 4 °C., Supernatant obsahující DDM-rozpuštěny CjPglB byl čištěn pomocí Ni-NTA resin (Thermo) podle specifikace výrobce, s výjimkou, že všechny nárazníky byly doplněny s 1% (w/v%) DDM. Eluční frakce z čištění Ni-NTA byla poté podrobena chromatografii s vyloučením velikosti (SEC) pomocí systému ÄKTA Explorer FPLC (GE Healthcare) se sloupcem Superdex 200 10/300 GL. Purifikovaný protein byl skladován při konečné koncentraci 1-2 mg mL−1 v OST skladovacím pufru (50 mM HEPES, 100 mM NaCl, 5% (v/v%) glycerol, 0.01% (w/v%) DDM, pH 7,5) při 4 °C., Glycerol koncentrace ve vzorku byla upravena na 20% (v/v%) pro dlouhodobé skladování při teplotě -80 °C.
Čištění akceptor protein scFv13-R4DQNAT byla provedena, jak je popsáno previously52. Krátce, E. coli kmen BL21(DE3) nesoucí plasmid pET28a-scFv13-R4(N34L, N77L)DQNAT byla pěstována v 1 L TB dodávané s kanamycin. Kultura byla inkubována při 37 °C, dokud Abs600 dosáhl ~0.7, na kterém místě exprese proteinů byla indukována přidáním isopropyl-β-d-1-thiogalactopyranoside (IPTG) do výsledné koncentrace 0,1 mM. Exprese proteinů bylo dovoleno pokračovat po dobu 20 h při teplotě 25 °C., Buňky byly sklizeny a narušeny stejně, jak je popsáno výše. Protein scFv13-R4DQNAT byl čištěn za použití ni-NTA pryskyřice následované SEC podle protokolů výrobce. Protein byl skladován při konečné koncentraci 1-2 mg mL−1 ve skladovacím pufru (50 mM HEPES, 250 mM NaCl, 1 mM EDTA, pH 7,5) při 4 °C.
Extrakce LLOs
protokol pro organickým rozpouštědlem extrakce LLOs z E. coli membrány byl převzat z dříve popsaných protocol34,66., Ve většině případů byla jedna kolonie kmene CLM24 nesoucí plazmid pro cílovou biosyntézu glykanu (doplňková Tabulka 2) pěstována přes noc v LB médiích. Výjimkou byly LLOs ložiska W. succinogenes N-glycan (WsLLOs), které byly vyrobeny s použitím buněk DH5a nesoucí pEpiFOS-5pgl5 fosmid (laskavě poskytl Dr. Markus Aebi), a LLO sbearing Man3GlcNAc2, které byly vyrobeny pomocí Origami2(DE3) gmd::kan ΔwaaL buňky nesoucí plasmid pConYCGmCB. Jednodenní buňky byly subkultivovány na 1 L TB doplněné vhodným antibiotikem a pěstovány, dokud Abs600 nedosáhl ~0,7., Inkubační teplota byla nastavena na 30 °C pro biosyntézu všech glykany s výjimkou Man3GlcNAc2, která byla nastavena na 16 °C. Pro plasmidu pMW07-pglΔB, exprese proteinů byla indukována l-arabinóza na finální koncentraci 0,2% (w/v%), zatímco pro fosmid pEpiFOS-5pgl5 indukce byla s isopropyl β-d-1-thiogalactopyranoside (IPTG) na finální koncentraci 1 mM. Všechny ostatní plazmidy podílející konstitutivní promotory a tedy nevyžaduje chemické induktory. Po 16 hodinách byly buňky sklizeny centrifugací a buněčné pelety byly lyofilizovány až do úplného vysušení při -70 °C., Pro extrakci CjLLOs, nativních a modifikovaných ClLLOs, E. coli O9 primer-adaptér LLOs, a WsLLOs, lyofilizát bylo přerušeno v 10:20:3 objemový poměr Chci3:CH3OH:H2O roztoku a inkubovány při pokojové teplotě po dobu 15 min pro usnadnění extrakce LLOs. Pro extrakci LLO sbearing Man3GlcNAc2 glycan, lyofilizát byl následně suspendován v 10:20 (v/v%) Chci3:CH3OH řešení, vody a 10:20:3 Chci3:CH3OH:H2O roztok s 15 min inkubace při pokojové teplotě mezi každým krokem., V každém případě byla konečná suspenze odstředěna (4000×g) po dobu 15 minut, poté byla organická Vrstva (Spodní Vrstva) shromážděna a vysušena vakuovým koncentrátorem následovaným lyofilizací. Lyofilizát obsahující aktivní LLOs byly resuspendovány v cell-free glykosylace pufru (10 mM HEPES, pH 7,5, 10 mM MnCl2, a 0,1% (w/v%) DDM) a uložen při 4 °C.
Příprava surové S30 výtažky
CLM24 zdroj kmeny byly pěstovány v 2×YTPG (10 g L−1 kvasničného extraktu, 16 g L−1 kultivací na trypton, 5 g L−1 NaCl, 7 g L−1 K2HPO4, 3 g L−1 KH2PO4, 18 g. L−1 glukózy, pH 7,2), dokud Abs600 dosáhl ~3., Pro generování extraktu obohaceného OST byl jako zdrojový kmen použit CLM24 nesoucí plazmid pSF-CjPglB, pSF-CcPglB, pSF-DdPglB, pSF-DgPglB nebo pSF-DvPglB52. Pro generování extraktu obohaceného LLO byl jako zdrojový kmen použit CLM24 nesoucí plasmid pMW07-pglΔB. Pro generování extraktu z jednoho hrnce obsahujícího jak OST, tak LLOs byl jako zdrojový kmen použit CLM24 nesoucí pmw07-pglΔB a pSF-CjOST. Podle potřeby byla exprese glykosylačních složek indukována l-arabinózou v konečné koncentraci 0,02% (w/v%)., Po indukci bylo proteinové expresi povoleno postupovat při 30 ° C na hustotu OD600 ~3, kdy byly buňky sklizeny odstředěním (5000×g) při 4 °C po dobu 15 minut. Všechny následující kroky byly provedeny při 4 ° C, pokud není uvedeno jinak. Peletované buňky byly třikrát promyty v pufru S30 (10 mM Tris acetát, 14 mM octan hořečnatý, 60 mM octan draselný, pH 8.2). Po posledním praní byly buňky peletovány na 7000×g po dobu 10 minut a bleskově zmrazeny na kapalném dusíku. Pro výrobu lyzátu byly buňky rozmrazeny a resuspendovány do homogenity v 1 mL pufru S30 na 1 g mokré buněčné hmoty., Buňky byly narušeny pomocí vysokotlakého homogenizátoru Avestin EmulsiFlex-B15 při 20 000–25 000 psi s jediným průchodem. Lyzát byl poté dvakrát odstředěn při 30 000×g po dobu 30 minut, aby se odstranily zbytky buněk. Supernatant byl převeden do nové nádoby a inkubovány s 250 ot / min třepání při 37 °C po dobu 60 min, aby snížit endogenní mRNA transkriptů a narušit stávající polysome komplexy v lyzátu. Po odstřeďování (15 000×g) po dobu 15 minut při 4 °C byl supernatant odebrán, alikvotní, bleskově zmrazen v kapalném dusíku a skladován při -80 °C., Extrakt S30 byl aktivní po dobu asi tří cyklů zmrazování a rozmrazování a obsahoval ~40 g celkového proteinu L−1, měřeno Bradfordovým testem.
Mobil-zdarma glykoprotein, syntéza
Pro in vitro glykosylace čištěné akceptor protein, reakce byly provedeny v 50 µL objemu obsahujícím 3 µg scFv13-R4DQNAT, 2 µg přečištěné CjPglB, a 5 µg extrahované LLOs (v případě Man3GlcNAc2 LLOs, 20 µg) v in vitro glykosylace pufru (10 mM HEPES, pH 7,5, 10 mM MnCl2, a 0,1% (w/v%) DDM). Reakční směs byla inkubována při 30 ° C po dobu 16 hodin., Pro expresi glykoproteinů na bázi surového extraktu byla provedena dvoufázová schéma. V první fázi byla syntéza proteinů prováděna modifikovaným systémem PANOx-SP67. Konkrétně 1,5 mL mikrocentrifugačních zkumavek byla účtována s 15-ti µL reakce obsahující 200 ng plazmidové DNA, a 30% (v/v%) S30 extrakt a následující: 12 mM hořčík glutamátu, 10 mM amonný glutamát, 130 mM draselný glutamát, 1.2 mM adenosin trifosfátu (ATP), 0.85 mM guanosin trifosfát (GTP), 0.85 mM uridin trifosfát (UTP), 0.85 mM, cytidin trifosfátu (CTP), 0.034 mg mL−1 kyseliny folinové, 0.,171 mg mL−1 E. coli tRNA (Roche), 2 mM, každá z 20 aminokyselin, 30 mM fosfoenolpyruvátu (PEP, Roche), 0,4 mM nikotinamidadenindinukleotid (NAD), 0,27 mM koenzym A (CoA), 4 mM kyselina šťavelová, 1 mM, putrescinu, 1,5 mM spermidinu a 57 mM HEPES. Pro scFv13-R4DQNAT, hEPO22-DQNAT-26, hEPO36-DQNAT-40, a hEPO81-DQNAT85, tato fáze byla provedena při teplotě 30 °C po dobu 4 h pod oxidační podmínky, zatímco pro sfGFP217-DQNAT a sfGFP217-AQNAT tato fáze byla provedena při teplotě 30 °C po dobu 5 min za redukujících podmínek., Za oxidačních podmínek, extrakt byl pre-stabilizuje s 750 µM iodoacetamide ve tmě při pokojové teplotě po dobu 30 min a reakční směs byla dodávána s 200 mM glutathionu na 3:1 poměr oxidované a redukované formy. Aktivní výtěžky sfGFP z reakcí bez buněk byly kvantifikovány měřením fluorescence in-lyzátu a přeměnou na koncentraci pomocí standardní křivky, jak bylo dříve popsáno39. Ve druhé fázi byla proteinová glykosylace zahájena přidáním MnCl2 a DDM v konečné koncentraci 10 mM a 0.,1% (w/v%), respektive, a umožnila postupovat při 30 °C po dobu 16 h. Podle potřeby, reakce byly doplněny 2 µg přečištěné CjPglB (tj. pro CFGpS s LLO-obohacený extrakty) nebo 5 µg rozpouštědlo extrahované CjLLOs (tj. pro CFGpS s OST-obohacený extrakty). Všechny reakce byly zastaveny přidáním Laemmli sample buffer obsahující 5% ßME, po které byly vzorky vaří při 100 °C po dobu 15 min a analyzovány pomocí SDS-PAGE a western blotting.
analýza Western blot
vzorky obsahující 0,5 µg akceptorového proteinu byly načteny do gelů SDS-PAGE., Po elektroforetické separaci byly proteiny převedeny z gelů na imobilon-P polyvinyliden difluorid (PVDF) membrány (0,45 µm) podle protokolu výrobce. Membrány byly promyty dvakrát s TBS pufru (80 g L−1 NaCl, 20 g L−1 KCl a 30 g L−1 Tris-base), následuje inkubace po dobu 1 h v blokujícím roztoku (50 g L−1 non-tuku mléka v TBST (TBS dodávané s 0,05% (v/v%) Tween-20)). Po zablokování byly membrány 4krát promyty TBST s inkubací 10 minut mezi každým mytím., První membrána byla sondoval s 6xHis-polyklonální protilátku (Abcam, ab137839, 1:7500), který specificky rozpoznává hexahistidine epitop kategorie, zatímco druhý replikovat membrána byla sondoval s jedním z následujících: hR6 (1:10,000) sérum z králíků, které uznává rodák C. jejuni a C. lari glycan, stejně jako inženýrství. C. lari glycan nebo ConA-HRP (Sigma, L6397, 1:2500), který uznává Man3GlcNac a Man3GlcNAc2. Snímací membrány byla provedena po dobu nejméně 1 h za třepání při pokojové teplotě, po které se membrány promyjí TBST stejným způsobem, jak je popsáno výše., Pro vývoj byly membrány krátce inkubovány při pokojové teplotě se substrátem Western ECL (BioRad) a zobrazovány pomocí systému ChemiDocTM XRS+. Enzymy Ost obohacené o extrakty byly detekovány identickým postupem SDS-PAGE, následovaným analýzou Western blot s polyklonální protilátkou specifickou pro značku FLAG epitope (Abcam, ab49763, 1:7500). Na glycan součástí LLOs obohacený extrakty byl detekován přímo špinění 10 µL extrakty na nitrocelulózové membrány následuje detekce s hR6 séru. Nezakryté imunobloty jsou znázorněny na doplňkovém obr. 8.,
MS analýzy
Přibližně 2 µg scFv13-R4DQNAT proteinu v roztoku byla denaturována s 6 M močovina, snížené 10 mM DTT, inkubují při teplotě 34 °C po dobu 1 h, pak alkylované s 58 mM iodoacetamide 45 min ve tmě při pokojové teplotě a rozloží do finále 36 mM DTT. Roztok byl poté zředěn 50 mM hydrogenuhličitanem amonným (pH 8.0) na konečnou koncentraci pufru 1 m močoviny před trávením trypsinem. Vzorek byl štěpen s 0,2 µg trypsinu po dobu 18 h při 37 °C. štěpení bylo zastaveno přídavkem TFA, aby konečné pH 2.2–2.5., Vzorky byly poté odsoleny kazetou SOLA HRP SPE (Thermofisher Scientific). Kazety byly klimatizované s 1 × 0,5 mL 90% metanolu, což je o 0,1% trifluoroctové kyseliny (TFA) a rovnovážného stavu s 2 × 0.5 mL 0,1% (v/v%) TFA. Vzorky byly zředěny 1: 1 s 0, 2% (v/v%) TFA a pomalu procházely zásobními vložkami. Po umytí s 2 × 0.5 mL ekvilibrační roztok, peptidy byly eluovány 1 × 0,5 mL 50% (v/v%) acetonitril (ACN), o 0,1% (v/v%) TFA a suší se v rychlosti vakuové centrifuze.,
nanoLC–MS/MS analýza byla provedena pomocí UltiMate3000 RSLCnano (Dionex) ve spojení se Orbitrap Fusion (ThermoFisher Scientific) hmotnostní spektrometr vybaven nanospray Flex Iontovým Zdrojem. Každý vzorek byl rozpuštěn ve 22 µL 0,5% (w/v%) FA a 10 µL bylo naloženo na Acclaim PepMap 100 C18 past kolona (5 µm, 100 µm × 20 mm, 100 Å, ThermoFisher Scientific) s nanoViper Kování na 20 µL min−1 0,5% FA pro on-line odsolování., Po 2 min, ventil se přepne, aby umožňoval peptidy, které mají být odděleny na Acclaim PepMap C18 nano sloupci (3 µm, 75 µm x 25 cm, ThermoFisher Scientific), v 90 min. spádu 5 až 23% na 35% B po 300 nL min−1 (3-73 až 93 min), následuje 9-min ramping až 90% B, 9-min držet na 90% B a rychlý přepínač do 5% B v 1 min. Sloupec byl před dalším spuštěním znovu vyrovnán s 5% B po dobu 20 minut. Fúze Orbitrap fungovala v režimu kladných iontů s napětím nanospray nastaveným na 1,7 kV a zdrojovou teplotou 275 °C., Před analýzou byla provedena externí kalibrace pro analyzátory hmotnosti ft, IT a quadrupole. Po průzkumu ORBITRAP full MS survey scan (m/z 400-1800) následovaly špičkové skenování MS/MS pro prekurzorové peptidy s 2-7 náboji nad prahovým počtem iontů 50 000 s normalizovanou kolizní energií 32%., MS průzkum snímky byly získány při řešení power 120 000 (FWHM na m/z 200), s Automatickým Gin Control (AGC) = 2e5 a maximální doba vstřikování (Max) = 50 ms, a HCD MS/MS skenuje v rozlišení 30 000 s AGC = 5e4, Max = 60 ms a s Q izolace okna (m/z), 3. pro hmotnostní rozsah m/z 105-2000. Parametry dynamického vyloučení byly nastaveny na dobu vyloučení 1 do 60 s S s délkou vyloučení ±10 ppm. Produkt Ion vyvolat seznam se skládal z vrcholů na 204.0867 Da (HexNAc oxonium ion), 138.0545 Da (HexNAc fragment), a 366.1396 Da (HexHexNAc oxonium ionty)., Pokud jeden z HCD produktových iontů v seznamu bylo zjištěno, dvě nabití-závislé ETD MS/MS skenů (EThcD) s HCD doplňkové aktivace (SA) na stejné prekurzorového iontu byly spuštěny a shromažďovány v lineární iontové pasti. U dvojnásobně nabitých prekurzorů byla reakční doba ETD nastavená na 150 ms a energie SA nastavena na 30%, zatímco stejné parametry na 125 ms a 20% byly použity pro vyšší nabité prekurzory. Pro oba iontově spouštěné skeny byl cíl fluoranthen ETD činidla nastaven na 2E5, AGC cíl na 1e4, Max na 105 ms a izolační okno na 3. Všechna data byla získána pomocí Xcalibur 3.,0 provozní software a aplikace Orbitrap Fusion Tune v. 2.1 (Thermofisher Scientific).
všechna MS a MS/MS surová spektra z každého vzorku byla prohledána pomocí Byonics v. 2.8.2 (proteinové metriky) pomocí databáze proteinů E coli s přidanou cílovou sekvencí proteinu scFv13-R4DQNAT. Peptid vyhledávací parametry byly následující: dva minul štěpení pro plné trypsin trávení s pevnou carbamidomethyl modifikace cysteinu, variabilní modifikace oxidace methioninu, a deamidation na asparagin/glutaminových zbytků., Tolerance hmotnosti peptidu byla 10 ppm a hodnoty tolerance hmotnosti fragmentu pro HCD a EThcD spektra byly 0,05 a 0,6 Da. Maximální počet běžných i vzácných modifikací byl stanoven na dvě. Na glycan vyhledávání podle seznamu 309 savčích N-vázaných glykanů v Byonic software. Identifikované peptidy byly filtrovány pro maximálně 2% FDR. Software exportoval výsledky vyhledávání do tabulky.
fluorescenční aktivita GFP
aktivita sfGFP odvozené od buněk byla stanovena pomocí fluorescenční analýzy in-lyzátu, jak bylo popsáno výše. 39., Krátce se 2 µL syntetizované glykosylované sfGFP reakce bez buněk zředí na 48 µL nanopurové vody. Řešení bylo poté umístěno do Costar 96-well black assay plate (Corning). Excitační a emisní vlnové délky pro sfgfp fluorescenci byly 485 a 528 nm.
Enzyme-linked immunosorbent analýzy (ELISA)
Partner 96-well ELISA destičky (Corning) jsou potaženy přes noc při 4 °C s 50 µl, 1 mg mL−1 E. coli β-gal (Sigma-Aldrich) v 0,05 M uhličitanu sodného pufru (pH 9.6)., Po zablokování s 5% (w/v%) bovinní sérum albumin (BSA) v PBS po dobu 3 h při teplotě místnosti, talíře byly promyty čtyřikrát s PBST pufru (PBS, výši 0,05% (v/v%) Tween-20, 0.3% (w/v%) BSA) a inkubovány s pořadovým zředěn čištěné scFv13-R4 vzorky nebo rozpustné frakce CFGpS lyzáty pro 1 h při pokojové teplotě. Vzorky byly kvantifikovány Bradfordovým testem a na desku bylo aplikováno ekvivalentní množství celkového proteinu. Po čtyřnásobném promytí stejným pufrem byla do každé jamky přidána konjugovaná polyklonální protilátka králíka Anti-6×-His-HRP (Abcam) ve 3% PBST po dobu 1 hodiny., Desky byly omyty a vyvinuty pomocí standardních protokolů.
In vitro buněčné proliferace
Lidská erytroleukémie TF-1 buněk (Sigma), které vyžadují kolonie granulocytů a makrofágů stimulující faktor (GM-CSF), interleukin 3 (IL-3), nebo hEPO pro růst a přežití byly použity. Buňky byly udržovány v RPMI-1640 media doplněným 10% FBS, 50 U mL−1 penicilinu, 50 mg mL−1 streptomycin, 2 mM glutamin, a 2 ng mL−1 GM-CSF při 37 °C ve zvlhčené atmosféře obsahující 5% CO2., Po inkubaci 16 h v médiích RPMI-1640 bez GM-CSF byly buňky počítány, sklizeny a resuspendovány v čerstvých médiích. 5 × 103 TF-1 buňky na jamku byly nasazeny do 96-dobře testovací desky a standardy EPO nebo vzorky byly přidány do konečných požadovaných koncentrací do každé jamky. Buňky byly inkubovány s po dobu 6 h ve vlhkém inkubátoru před přidáním alamarBlue®. Po 12 hodinách byl fluorescenční signál měřen při 560 nm/590 nm excitační/emisní vlnové délce.,
dostupnost dat
všechna data generovaná během studie jsou zahrnuta v tomto článku a jeho doplňkových informačních souborech a jsou k dispozici od autorů na základě přiměřené žádosti.