Laboratorní místech

Všechny DNA práce zahrnující moderní příbuzných byla provedena na University of Leicester. Samec-line příbuzní byli zadány pomocí Promega PowerPlex Y23 a pro Snp definování hlavních Evropských Y-haplogroups in Leicester s podmnožinou psaní byl potvrzen na Université Paul Sabatier. Příbuzní ženské linie byli sekvenováni pro celý mitochondriální genom na University of Leicester., DNA byla extrahována ze starých zubů a kostí na University of York a Université Paul Sabatier, Toulouse. Příprava knihovny a cílové obohacení bylo provedeno na University of York. Sekvenování s jedním koncem 100 bp pomocí HiSeq 2000 (Illumina, CA, USA) bylo provedeno v Sekvenačním zařízení v Kodani. Cílené sekvenování moderní i starodávné DNA bylo také provedeno na genomické technické platformě PlaGe (Genopole, Toulouse, Francie) a v laboratoři chemie proteinových nukleových kyselin na University of Leicester. Níže uvádíme kondenzovanou verzi použitých metod., Pro každý krok lze úplné informace nalézt v doplňkových metodách. Podrobnosti o rozsáhlém genealogickém výzkumu provedeném pro tento projekt naleznete v doplňkové poznámce 2.

odběr Vzorku

DNA byla extrahována ze vzorků slin moderní příbuzných Richarda III. a všichni účastníci byli přijati s informovaným souhlasem následující projekt recenzi na University of Leicester Výzkum Etická komise.

kostra 1 byla vykopána a vzorky odebrány za čistých podmínek37., Všechny zúčastněné ve výkopu v Šedých Mnichů stránky, čisté laboratoře v Leicesteru a těm, kteří v laboratořích a labwork měl jejich mitochondriální a, pro muže, Y-chromozomů zadali. DNA byla extrahována ze vzorků slin a všichni účastníci byli přijati s informovaným souhlasem.

extrakce DNA starých vzorků

DNA byla extrahována ze vzorků zubů a kostí (femur). Všechny postupy byly provedeny ve specializované DNA laboratoře na University of York a Université Paul Sabatier, Toulouse s odpovídající znečištění opatření na místě., Byly zahrnuty dva extrakční polotovary a ošetřeny přesně tak, jako by to byly extrakty po celý proces. PCR a knihovní experimenty také zahrnovaly další prázdné ovládací prvky.

Sex-typing test provádí na Kostru 1

nově navržený sex-typing test zahrnující PCR primery pro co-amplifikace SRY fragment s UTX UTY a homologní oblastí byl použit. Tento test byl navržen tak, aby relativně malé velikosti fragmentů SRY, UTX a UTY být co-zesílený ze vzorků, které pravděpodobně obsahují degradované DNA10.,

Mitochondriální kontrolu regionu analýza Kostra 1

Analýza hypervariabilní segmenty (HV1, HV2 a HV3) mtDNA kontrolu regionu byla provedena amplifikací a přímo sekvenování více překrývajících se fragmentů v rozmezí 153 až 250 bp ve velikosti (http://forensic.yonsei.ac.kr/protocol/mtDNA-midi-mini.pdf)22. Výběr ampliconů byl použit pro klonování produktů PCR v laboratoři v Toulouse. Sekvenování bylo provedeno pomocí Big-Dye Terminator v3.,1 cycle sequencing kit (Applied Biosystems) a kapilární elektroforézy na ABI Prism 3730 Genetic Analyser (Applied Biosystems) na Bílkoviny, Nukleové Kyseliny Chemie v Laboratoři na University of Leicester, nebo na genomické technické platformy PlaGe (Genopole).

Mitochondriální genom/Y-SNP/HIrisplex psaní Kostra 1

Knihovny byly postaveny následující Meyer a Kircher16, s výjimkou, že první filtrace krok mezi tupým koncem opravy a adaptér ligace byla nahrazena tepelné inaktivaci enzymes38,39., Byly navrženy dva mikroarény, jeden pro obohacování mtDNA a druhý pro obohacování jaderného SNP. DNA obohacení byla provedena hybridizace zachytit pomocí Agilent 244k DNA SureSelect microarray (Agilent, Böblingen, Německo). Pro nukleární zachycení byly sondy Y chromozomů navrženy tak, aby pokryly SNP relevantní pro hlavní evropské řádky14. Další sondy byly navrženy tak, aby pokryly SNP relevantní pro značky HIrisplex31. Tyto dvě sady sond (mitochondriální a SNP) byly použity samostatně k vyplnění dvou různých návrhů mikroarray formátu 1 × 244k., Pro každý mikroarray byl protokol zachycení proveden podle Hodges et al.15 s úpravami navrženými Zhang et al.40 a Fortes a Paijmans38. Knihovny byly sdruženy v ekvimolárních množstvích a sekvenovány na dvou pruzích platformy Illumina HiSeq 2000 v režimu 100 SE v sekvenačním zařízení Kodaňské univerzity v Dánsku.

surové čtení z každé knihovny bylo seřazeno na základě šestijádrového indexu použitého při přípravě knihovny. Pro další analýzy bylo vybráno pouze čtení se 100% shodou s indexem., Čte kratší než 25 nukleotidů byly vyřazeny z další analýzy. Zdobené čte byly mapovány na autozomy a pohlavní chromozomy z lidského referenční genom build 37 (GRCh37) a rCRS (NC_012920.1) pomocí bwa 0.7.5-r405 (ref. 41). V každém zarovnání, výstupní bam soubory byly sloučeny pomocí SAMtools 0.1.19 (ref. 41) a PCR duplikáty byly následně odstraněny. Mapované čte byly filtrovány na základě mapování kvality >29 a jejich zarovnání do jedinečné pozice podél referenční sekvence.,

polymorfní polohy byly identifikovány pomocí Samtoolů (Samtoolů 0.1.19) a bcftoolů. Konečně, vcfutils.pl byl použit k filtrování seznamu variant podle Phred-měřítko genotyp posteriorní pravděpodobnost kvality >20 a číst hloubce vyšší než 10. Aby nedošlo k chybě kvůli deaminačnímu vzoru starých molekul DNA, byly všechny polymorfní polohy hlášené ve výstupním souboru vcf zkontrolovány okem., V případě mitochondriální genom, montáž na odkaz zobrazil v Tablet42, zatímco vyrovnání čte obsahující Snp referenční chromozomů byl vizualizován pomocí IGV43.

SNP psaní pomocí PCR

zachycení přístup přinesly dostatečné pokrytí pro všechny HIrisPlex a Y-chromozomu Snp, a proto primery byly navrženy tak, aby generovat amplikony obsahující tyto Modifikace, stejně jako dvě Modifikace, které dále definují Y-chromozomu haploskupiny G: M285 (G1) a P287 (G2) (ref. 14). Ty byly zesíleny jako součást multiplexních reakcí po Römpler et al.,44 nebo singleplex reakce (pomocí 40 cyklů a bez sekundární zesílení) a sekvenovány na Ion Torrent následující knihovny přípravu pomocí Ion PGM 200 Xpress Šablony Kit a PGM 200 Sequencing Kit. Pro zvýšení pokrytí bylo provedeno singleplex PCR a sekvenování jedné značky (rs28777) podle Binladen et al.45.

Psaní z haploskupiny G definování Snp (M201, M285 a P287) se opakuje v Toulouse pomocí singleplex Pcr. Sekvenování těchto produktů PCR bylo provedeno pomocí Big-Dye Terminator v3.,1 cyklová sekvenční sada (aplikované biosystémy) analyzovaná kapilární elektroforézou na genetickém analyzátoru Abi Prism 3730 (aplikované biosystémy) na genomické technické platformě PlaGe (Genopol).

Y-chromozomální haplotyp analýzy

Starověký a moderní vzorky‘ Y-chromozomální haplotypy byly získány pomocí PowerPlex Y23 System (Promega) a analyzovány pomocí kapilární elektroforézy na ABI Prism 3730 Genetic Analyser (Applied Biosystems) v genomové technické platformy PlaGe (Genopole) a ABI Prism 3130xl Genetic Analyser (Applied Biosystems) na University of Leicester., Pro Skeleton 1 to bylo provedeno na třech samostatných extraktech (RM2, LM1 a LM3) ve dvou různých starověkých laboratořích DNA (York a Toulouse). Pro moderní příbuzné to bylo provedeno na dvou různých extraktech ve dvou různých moderních laboratořích (Leicester a Toulouse).

Y-chromozomální SNP analýzy moderních vzorků

Následující stanovení Y-haplotyp pro moderní muže-line vzorky, předpokládané haploskupina byla stanovena pomocí Drobet Ti to haplogroup predictor (http://www.hprg.com/hapest5/hapest5a/hapest5.htm?order=num)., Binární markery pokrývající tyto a související linie byly zadány ve dvou multiplexů, které Snímek minisequencing řízení (Applied Biosystems) a ABI3130xl Genetic Analyzer (Applied Biosystems), následuje potvrzení pomocí Sangerova sekvenování. Somerset 3 byl určen jako Hg I (M170 + M223−, M253 -) 14 odvozený, dále potvrzený laboratoří v Toulouse. Somersety 1,2,4 a 5 byly určeny k odvození pro R1b-u152. Somersets 1,2,4 a 5 byly testovány pro Snp rozčlenit tento clade13 (Z56, M126, Z36, Z192, M160 a L2) pomocí Sangerova sekvenování v obou laboratořích.,

moderní analýza mtDNA

oba vzorky byly replikovány dvakrát.

Vzorky byly odebrány pomocí Oragene DNA Collection kit (DNA Genotek) a DNA extrahována pomocí dvou různých metod: Qiacube Krev a Tělesné Tekutiny protokolu (200 µl 200 µl eluční) a Oragene protokolu. Analyzovat kontrolu regionu, vzorky byly sekvenovány dvakrát, v obou vpřed a vzad pomocí dvou překrývajících se primer nastaví (15973-296 a 16524-614) pomocí Big Dye Terminator V. 3.1 (Applied Biosystems). Nebyly zjištěny žádné rozdíly mezi replikáty nebo mezi vzorky.,

vzorky byly zesíleny pro kompletní mitochondriální genom z obou extrakcí po Meyer et al.26 PCR amplicony byly sekvenovány na Ion Torrent PGM sekvenceru na Ion314 čipu. Knihovny byly připraveny pomocí sady pro přípravu fragmentů knihovny Ion Xpress plus gDNA, zatímco příprava šablon a sekvenování byly prováděny pomocí sady šablon Ion PGM 200 Xpress a sekvenční sady Ion PGM 200. Syrové čte byly mapovány zpět do rCRS (NC_012920.1) pomocí TMAP software součástí Ion Zarovnání plugin 3.2.1 (Torrent Suite Software 3.2.,1) na serveru Ion Torrent. Odstranění duplicitních čtení a volání variant bylo provedeno pomocí SAMtools 0.1.19 (ref. 41) a lokální vyrovnání bylo provedeno pomocí nástroje pro analýzu genomu Kit46. Varianty byly filtrovány pro základní kvalitu 20, kvalita mapování 50 a hloubka pokrytí 30 po kterém 33 polymorfní místa byla zachována. Všechny tyto stránky byly ručně zkontrolovány a potvrzeny sekvenováním Sanger v obou směrech a replikovány dvakrát.,

kontrola Kontaminace a kvantifikace

Moderní DNA kontaminace starověké pozůstatky byl řízen za pomocí následujících metod:

  1. 1

    Výkop byl proveden v rámci čisté podmínky (viz Doplňkové Metody)

  2. 2

    Vzorky byly skladovány v čistých laboratořích a starobylé DNA práce prováděny pouze ve vyhrazených starověké DNA zařízení.

  3. 3

    samostatné starověké vzorky byly zpracovány v samostatných laboratořích pro replikaci výsledků.,

  4. 4

    Všichni členové laboratoře a účastníci výkopu měli napsanou mtDNA a psaní Y chromozomů bylo provedeno u všech zúčastněných mužů. Žádný neměl odpovídající typ mtDNA nebo Y chromozomu.

jako důkaz proti významné kontaminaci ukazuje analýza DNA skeletu 1 perfektní shodu mtDNA s ML1 a jednobázový rozdíl s ML2. Ukazuje také jasný haplotyp y-STR, který byl replikován pomocí řady extraktů generovaných a testovaných ve dvou samostatných laboratořích., Nakonec to také podporuje vyšetření (viz doplňkové metody) substitučního vzoru v našich přečtech.

Statistické analýzy

Přičemž konzervativní přístup v každém kroku vypočítáme pravděpodobnost pro každou položku pozorovaných důkazů za každé dvě protichůdné hypotézy: Hypotéza 1 (H1): Kostra 1 je Richard III, a Hypotéza 2 (H2): Kostra 1 není Richard III.,

Jak to bylo rozumné předpokládat, že všechny ty různé linie důkazů, byly nezávislé, společné pravděpodobnost, že všechny důkazy byly získány vynásobením jednotlivých pravděpodobností v rámci každé hypotézy. Hmotnost důkazů pro H1, nazývaná poměr pravděpodobnosti (LR), byla poté dána poměrem pravděpodobnosti podle H1 k pravděpodobnosti podle H2. Říkáme, že předpoklad je „konzervativní“, pokud snižuje LR.

LR lze převést na pravděpodobnost, že H1 je pravda, vzhledem k předchozí pravděpodobnosti., Vzali jsme jako výchozí bod okamžik, kdy kostra 1 byla poprvé pozorována a uznána jako lidská kostra, ale před jakýmkoli hodnocením věku, pohlaví, zdravotního stavu a příčiny smrti. V tomto bodě, tam byl podstatný důkaz, že kostru našel v tom, co je věřil k byli umístění Leicester Šedých Mnichů sbor by mohlo být, že Richarda III. Všechny informace k dispozici v době Skeletu 1 byla objevena, včetně jeho přesné umístění a charakteru hrobu, byl považován pro tuto analýzu jako základní informace, které mohou informovat apriorní pravděpodobnost., Na základě těchto informací se domníváme, že skeptický pozorovatel nemohl přiměřeně přiřadit předchozí pravděpodobnost menší než 1 ze 40. Tato hodnota byla navržena v předchozí analýze (http://rationalgareth.com/), na základě toho, co chápeme skeptických hodnocení. Nejvyšší pravděpodobnost, která by mohla být odůvodněna předchozími důkazy, může být 1 v 2.

Pokud je to možné, použili jsme relevantní dostupná data. Nevyhnutelně jsou vyžadovány Subjektivní úsudky, například příslušné referenční populace a pravděpodobnosti chyb v hlášených skutečnostech., Tak daleko, jak se zdálo možné a rozumné, snažili jsme se být konzervativní v našem přístupu, například pomocí pseudocount metoda bias LR směrem k neutrální hodnotě 1, tedy tendenci, aby se zabránilo rušivé velké hodnoty od nejnižší pozorované frekvence. Podrobnosti údajů a metody používané v statistické analýze radiokarbonové údaje, věk a pohlaví skeletu, přítomnost skoliózy, přítomnost perimortální zranění, Y-chromozomu a mtDNA frekvenční údaje lze nalézt v Doplňkové Metody. Shrnout výsledky: radiokarbonové údaje přinesly poměr pravděpodobnosti 1.,84 představující omezenou podporu pro H1. Údaje o věku a pohlaví přinesly poměr pravděpodobnosti 5, 25, což opět představuje omezenou podporu pro H1. Přítomnost jedno rameno vyšší než ostatní, hlášeny během richardova života, může být přičítáno skolióza (Kostra 1 měl těžkou idiopatickou adolescentní-nástup skoliózy) nebo dva jiné známé podmínky, Erb je Obrna a Sprengel je deformity, z nichž oba jsou velmi vzácné. Podle H1 výše uvedené sazby dávají odhadovanou pravděpodobnost 0.,90 pozorování skoliózy vzhledem k popisu fyzického vzhledu Richarda III (=míra skoliózy dělená součtem tří sazeb), kterou jsme vynásobili 0, 95, abychom umožnili možnost, že zaznamenaný popis byl nesprávný. To vedlo k LR 212, poskytující mírně silnou podporu pro H1. Přítomnost perimortemových zranění poskytla LR 42, a tak mírnou podporu H1. Y-chromozom Kostry 1 neodpovídá tomu, co se rodokmenu určí patrilineal příbuzných Richarda III., To by mohlo být vysvětleno falešnou otcovskou událostí v jednom nebo více z 19 domnělých vazeb otce a syna mezi Richardem III.a Henrym Somersetem, pátým vévodou z Beaufortu. Výsledky chromozomu Y také naznačují další falešnou otcovskou událost mezi Henrym Somersetem a jeho pěti současnými, předpokládanými patrilineárními potomky. Být konzervativní, vybrali jsme publikoval falešné otcovství sazba, která byla (1) nižší, než jakékoli jiné zveřejněné sazby, které jsme considered17,47 a (2) na základě genealogických data18., K tomu přidáme falešně otcovskou událost v 19 domnělých vazbách otce a syna mezi Henrym Somersetem a pěti současnými mužskými Somersety. To dává pravděpodobnost alespoň jedné falešné otcovské události v 19 předpokládaných vazbách otce a syna mezi Richardem III.a Henrym Somersetem z 0, 16. Vzhledem k tomu, že falešné otcovství události došlo pod H1, četnosti populace Kostra 1 Y-haplotyp je stejné pod H1 a H2 a ruší v LR výpočet. LR je tedy 0, 16, což představuje omezené důkazy proti H1.,

sekvence mtDNA kostry 1 a předpokládaná 19-meióza matrilineární příbuzná Richarda III., Michaela Ibsena, zcela odpovídaly. Relativní 21-meióza také odpovídala kromě jedné základny (8994). Druhé pozorování je stejně pravděpodobné pod H1 a H2 vzhledem k pozorované sekvenci Michaela Ibsena, a tak se v LR zruší. Potřebujeme tedy pouze podobnosti pro pozorování sekvence sdílené Michaelem Ibsenem a Skeletonem 1.

abychom získali pravděpodobnost podle H1, požadujeme míru mutace mtDNA a v tomto případě jsou vysoké odhady konzervativní. Parsons et al.,28 zpráva 10 mutací kontrolní oblasti v 327 generacích pomocí genealogických dat. Protože to naznačuje vyšší míru než jiné publikované odhady a je založeno na genealogických datech, použili jsme ji k odvození pravděpodobnosti 0, 52 pro žádnou mutaci v 19 meiózách.

pro Pravděpodobnost pod H2 požadujeme populační zlomek skeletu 1 haplotyp. Přestože jsme získali kompletní sekvenci genomu mtDNA z kostry 1, identifikovali jsme málo publikované údaje o porovnání celého genomu z Anglie., Tak, pro statistickou analýzu jsme použili pouze kontrolní oblasti mtDNA mezi pozicemi 16,093 a 16,320 a mezi 00073 a 00188, pro které jsme získali vhodné angličtina srovnání dat z aktualizace Röhl et al.30, doplněné sekvencemi mtDNA dodávanými Roots for Real (Genetic Anector Ltd., Clare, Suffolk, UK). Použití pouze těchto krátkých úseků kontrolní oblasti pod H2 je konzervativní, protože populační zlomek sledovaných sekvencí kontrolní oblasti nemůže být menší než podíl plného genomu mtDNA., Relevantní referenční populace je v minulosti více než 500 let, ale vzhledem k velké velikosti populace v posuzovaném období očekáváme, že se populační frekvence v posledních pěti stoletích málo změnily. Zjistili jsme, že frekvence skeletu 1 haplotypu je 0 mezi 1823 v databázi, ke které přidáme jednu instanci pozorovanou u Michaela Ibsena. Tento přístup je opět konzervativní jako byl Michael vzorku vzhledem k jeho známé genealogický vztah k Richardu III. To vede k LR 478 představuje středně silný důkaz pro H1.,

Jsme také poznamenal, že tam byly žádné zápasy v databázi 26,127 Evropské mitochondriální kontrolu regionu haplotypy (www.empop.org)29. Nechceme spoléhat na tuto databázi, protože je v celé Evropě, spíše než specifické pro Anglii a kvůli zjištění problémů, ale naznačuje to, že Kostra 1 haplotyp může být mnohem vzácnější, než může být odvozena z našich menších anglicky databáze. Jsme také na vědomí, že ženské mobility mezi Evropskou šlechtu, je pravděpodobné, že byly mnohem vyšší než v obecné populaci, protože manželství postupů týkajících se politické aliance formace., Takové praktiky by poskytnout určité odůvodnění pro použití Evropské databáze mtDNA, a tak za zvážení haplotyp nalézt ve Skeletu 1 a Michael Ibsen být extrémně vzácné. V Doplňující Tabulce 10, ukážeme názorné výsledky pomocí Evropské databáze demonstrovat důsledky, kterým se, že Kostra 1 haplotyp je tak vzácné, jak navrhl, že databáze.

LRs pro různé kombinace důkazů a dvě zadní pravděpodobnosti jsou uvedeny v doplňkové tabulce 10., Pomocí všechny důkazy, podpora pro H1 je extrémně silný s LR 6,7 milionů, tak, že naše skeptik by být hnáni k závěru, že pravděpodobnost, že Kostra 1 není Richarda III je menší než 1: 100 000, zatímco pro ty s 1 v 2 výchozí polohy, že pravděpodobnost je mnohem menší než 1 v milionu. Vezmeme-li v úvahu konzervativní předpoklady, které jsou základem našeho výpočtu popsaného výše, považujeme to za zjištění pravdy H1 nade vší pochybnost.